基于差異蛋白質(zhì)鑒別僵蠶及其新型偽品

邱 乙，汪云偉，程元柳，吳純潔，萬(wàn)德光，國(guó)錦琳

(成都中醫(yī)藥大學(xué) 中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室中藥資源系統(tǒng)研究與開發(fā)利用省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，成都611137)

僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶BombyxmoriLinnaeus 4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥體[1]。具有息風(fēng)止痙，祛風(fēng)止痛，化痰散結(jié)之功效[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，在我國(guó)513種常用成藥中，含有僵蠶的有49種，其中64種兒科成藥中，有29種含有僵蠶[3]。僵蠶每年我國(guó)需求量在400噸以上,且常年外銷出口。傳統(tǒng)的偽品僵蠶大多為用石灰水將死家蠶摻白加工而成[4]，也有將地蠶冒充正品僵蠶使用[5]。近年來(lái),出現(xiàn)了新的偽品黑死蠶和空心僵蠶，由于外觀、顯微等均與正品相似，難以應(yīng)用常規(guī)方法進(jìn)行有效鑒別。僵蠶作為典型的動(dòng)物藥,主要藥理活性成分為蛋白質(zhì)[6]。蛋白質(zhì)有嚴(yán)格的種屬特異性和組織特異性[7-8]。國(guó)際種子檢驗(yàn)協(xié)會(huì)將蛋白質(zhì)電泳方法正式定為標(biāo)準(zhǔn)的品種鑒定方法，表明了蛋白質(zhì)電泳方法在種子鑒定和純度檢測(cè)中的地位。同時(shí)蛋白質(zhì)在體內(nèi)以及不同部位間都具有穩(wěn)定的含量，因此僵蠶的鑒別可以選擇其差異蛋白作為鑒別的基礎(chǔ)。本研究比較了僵蠶與偽品間蛋白質(zhì)含量差異,并通過(guò)SDS-PAGE的方法初步尋找差異蛋白條帶對(duì)僵蠶與偽品進(jìn)行了鑒別，基于尋找的特有蛋白可有效的對(duì)僵蠶進(jìn)行真?zhèn)舞b別。

1 材料與儀器

僵蠶、空心僵蠶、黑死蠶均購(gòu)自廣元市蒼溪縣，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)國(guó)錦琳副教授鑒定僵蠶為蠶蛾科昆蟲家蠶BombyxmoriLinnaeus4～5齡的幼蟲感染(或人工接種)白僵菌Beauveriabassiana(Bals.)Vuillant而致死的干燥體；空心僵蠶經(jīng)鑒定為家蠶感染白僵菌之前缺少絲腺，或者是已經(jīng)吐絲之后感染了白僵菌形成的干燥體；黑死蠶經(jīng)鑒定為家蠶在養(yǎng)殖過(guò)程中未感染白僵菌死亡后曬干得到的干燥體，憑證樣品保存于成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥材標(biāo)準(zhǔn)化教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。 化學(xué)試劑均為分析純。 垂直電泳系統(tǒng)(Bio-Rad公司)，凱氏定氮儀(KDY-0408)。

2 方法

2.1 總蛋白含量測(cè)定 1)銨態(tài)氮的含量測(cè)定：精密稱取樣品粉末各3分，在相同條件進(jìn)行銨態(tài)氮的測(cè)定[9]，并將滴定結(jié)果用空白試驗(yàn)校正。2)總氮的含量測(cè)定：按照2010版《中國(guó)藥典》附錄Ⅸ L氮測(cè)定法-常量法[1]，精密稱取樣品粉末0.30 g，各3分，取平均值，測(cè)得總氮。3)總蛋白的含量測(cè)定：將測(cè)得的總氮含量扣除銨態(tài)氮的含量，再乘以6.25即得總蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 可溶性蛋白提取 稱取1 g僵蠶與黑死蠶粉末各3分，在相同條件加入0.02 mol/L-1PBS緩沖液(pH7.2)10 mL，4 ℃浸提過(guò)夜。取出離心20 min后取上清液，即得樣品[10]。用Bradford法[11]測(cè)定可溶性蛋白含量，結(jié)果見(jiàn)表1。

編 號(hào)樣品均值總蛋白含量/%均值可溶性蛋白含量/%1僵蠶 63.44±0.414.29±0.222空心僵蠶56.37±0.392.79±0.283黑死蠶 58.22±0.413.36±0.33

2.3 SDS-PAGE分析可溶性蛋白 將2.2項(xiàng)下樣品進(jìn)行SDS-PAGE[12]，掃描保存圖像，用Quantity one軟件分析其相對(duì)分子質(zhì)量范圍和相對(duì)含量。

2.4 SDS-PAGE重現(xiàn)性考察 選取同一時(shí)間,不同批次樣品按照同樣的提取條件和電泳方法進(jìn)行重現(xiàn)性考察。

2.5 數(shù)據(jù)處理 利用SPSS 17.0和Excel進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著水平為P<0.05。

3 結(jié)果

3.1 僵蠶與偽品總蛋白的含量分析 僵蠶總蛋白含量在63.03%～63.85%，空心僵蠶的總蛋白含量為55.98%～56.76%，黑死蠶總蛋白含量為57.81%～58.63%，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行方差分析，P<0.05。LSD法進(jìn)行多重比較結(jié)果表明，3個(gè)處理組的兩兩比較，P<0.05。

3.2 僵蠶與偽品的可溶性蛋白含量分析 通過(guò)對(duì)僵蠶與偽品間可溶性蛋白含量的比較發(fā)現(xiàn)，僵蠶的可溶性蛋白含量一般在4.02%～4.51%，空心僵蠶的蛋白含量在2.51%～3.07%，黑死蠶中可溶性蛋白含量在3.03%～3.69%，對(duì)其結(jié)果進(jìn)行方差分析，P<0.05。LSD法進(jìn)行多重比較結(jié)果表明,3個(gè)處理組的兩兩比較，P<0.05。

3.3 僵蠶與偽品的電泳圖譜分析 通過(guò)Quantity one軟件分析電泳圖譜發(fā)現(xiàn)，僵蠶正品與偽品間蛋白條帶差異較大，黑死蠶與正品僵蠶的相似度為(54.22±1.95)%，空心僵蠶與正品僵蠶的相似度為(63.81±2.29)%,如表3所示。其中僵蠶正品與黑死蠶之間存在明顯差異條帶SP，相對(duì)分子質(zhì)量約為22.0 kDa，而黑死蠶、黑死蠶絲腺、黑死蠶皮均沒(méi)有出現(xiàn)SP,如圖1所示。同時(shí)該僵蠶中SP蛋白含量為偽品空心僵蠶SP蛋白含量的1.37倍，其含量差異明顯。

1.僵蠶；2.僵蠶絲腺；3.僵蠶(剝離絲腺)；4.黑死蠶；5.黑死蠶絲腺；6.黑死蠶(剝離絲腺)；7.空心僵蠶；M.低分子量蛋白Marker圖1 僵蠶與偽品間的蛋白質(zhì)電泳圖譜

1.僵蠶；2.僵蠶絲腺；3.僵蠶(剝離絲腺)；4.黑死蠶；5.黑死蠶絲腺；6.黑死蠶(剝離絲腺)；7.空心僵蠶；M.低分子量蛋白Marker圖2 僵蠶與偽品間的蛋白質(zhì)電泳圖譜

3.4 重現(xiàn)性考察 凝膠電泳圖譜中存在明顯的蛋白質(zhì)差異。僵蠶與黑死蠶間的差異條帶SP比較明顯，分辨率高；僵蠶中SP蛋白含量為偽品空心僵蠶SP蛋白含量的1.35倍,重現(xiàn)性較好。如圖2所示。表明，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳用于僵蠶及其劣品的鑒別方法可靠，具有說(shuō)服力。

表3 僵蠶與偽品蛋白質(zhì)差異蛋白條帶對(duì)比

4 討論

僵蠶中主要活性蛋白質(zhì)為絲腺蛋白，約占僵蠶蛋白質(zhì)含量的22.81%?？招慕┬Q和黑死蠶由于絲腺較小等原因，其蛋白質(zhì)含量明顯低于正品僵蠶，其余常見(jiàn)偽品該指標(biāo)也明顯低于正品僵蠶，因此，建議進(jìn)一步研究后藥典僵蠶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢查項(xiàng)下增加蛋白質(zhì)含量測(cè)定項(xiàng)，可有效區(qū)別上述偽品。 蛋白質(zhì)類成分是僵蠶主要活性成分，具有穩(wěn)定的含量和物種特異性等。凝膠電泳圖譜中僵蠶與黑死蠶和空心僵蠶共有條帶較多，主要集中在26～82 kD之間，推斷為是家蠶的共有蛋白。僵蠶與黑死蠶凝膠電泳圖譜顯示有明顯的蛋白質(zhì)差異，其中差異蛋白質(zhì)(SP)可作為其鑒別依據(jù)；此外僵蠶與偽品空心僵蠶間的條帶差異不明顯，推測(cè)原因?yàn)榭招慕┬Q體內(nèi)仍然存在著少量的絲腺蛋白且感染了白僵菌，但其蛋白質(zhì)含量存在明顯差異，僵蠶相關(guān)蛋白質(zhì)特別是特有蛋白SP含量遠(yuǎn)高于空心僵蠶，其含量差異下一步可作為鑒別指標(biāo)。進(jìn)一步研究如表明該SP蛋白與僵蠶功能直接相關(guān)，建議進(jìn)一步研究后藥典僵蠶質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可增加SP蛋白的含量測(cè)定項(xiàng)，以期更加準(zhǔn)確的評(píng)價(jià)僵蠶的質(zhì)量。

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