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    艾灸對大鼠皮膚創(chuàng)傷成纖維細胞和KGF表達的影響*

    2014-07-30 02:38:50孫忠人尹洪娜張秦宏岳金換
    針灸臨床雜志 2014年4期
    關鍵詞:肉芽纖維細胞艾灸

    孫忠人,王 迪,尹洪娜,張秦宏,孫 琦,岳金換

    (1.黑龍江中醫(yī)藥大學,黑龍江 哈爾濱150040;2.黑龍江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院,黑龍江哈爾濱150001)

    艾灸是祖國醫(yī)學的傳統(tǒng)治療方法,具有溫經(jīng)通絡、消瘀散結、拔毒泄熱的作用[1]。現(xiàn)代研究證明,艾灸燃燒時釋放的紅外輻射可以為機體細胞的代謝活動、免疫功能提供所必需的能量,也能給缺乏能量的病態(tài)細胞提供活化能。還可促進炎癥、浮腫、滲出物、血腫等病理產(chǎn)物消散吸收[2]。因此艾灸可作為治療皮膚創(chuàng)傷的方法進行研究。本研究采用免疫組化法和HE染色法檢測皮膚創(chuàng)傷修復過程中角質細胞生長因子(keratinocyte growth factor,KGF)表達及成纖維細胞數(shù)量變化,探究艾灸對皮膚創(chuàng)傷修復的作用。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    無特定病原體(SPF級)SD大鼠24只,雌雄各半,體重250~300 g,由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供。蘇木素染色液、伊紅染色液(上海博谷生物科技有限公司);免疫組化試劑Rabbit Anti-KGF、即用型試劑盒SV0002、DAB顯色劑(武漢博士德生物工程有限公司);戊巴比妥麻醉劑(德國Merck公司);艾灸條(中國南陽醫(yī)樂嘉艾草生物制品有限公司);薇婷脫毛膏(中國利潔時家化有限公司);CX41奧林巴斯顯微鏡(日本奧林巴斯公司);TK-C9201EC型JVC攝像頭(日本JVC公司);RM2235型LEICA切片機(德國LEICA公司);KP-21C型PLACOM求積儀(日本PLACOM公司)。

    1.2 方法

    1.2.1 實驗動物分組 將實驗動物隨機分為治療組和模型組。治療組又按治療時間分為3個時間點,分別為1天、3天、7天。每個時間點設置一個模型組。每組4只大鼠。

    1.2.2 動物模型的建立 大鼠常規(guī)飼養(yǎng)1周后,于造模前12 h禁食水。實驗動物以1%戊巴比妥作腹腔注射麻醉(0.35 ml/kg),將其脊柱左側旁開1 cm,脊柱右側旁開3 cm,上至肩胛下緣,下達髂骨上緣的背部毛發(fā)剔除。用脫毛膏進行脫毛處理,生理鹽水清洗拭干,使其背部皮膚顯露。在脊柱右側1 cm處行一與脊柱平行的縱行切口,長1 cm,深達皮膚全層,制造皮膚創(chuàng)傷模型[3]。術后碘伏消毒,皮膚創(chuàng)面自然止血,不給予包扎。

    1.2.3 治療方法 治療組大鼠給予艾灸治療。將點燃的艾條置于艾灸盒中,架于大鼠皮膚創(chuàng)面上方進行治療。其間應適當調整艾條高度,使艾條與創(chuàng)面的距離始終保持3~4 cm,每次治療30 min,按照分組給予不同天數(shù)治療。模型組除不點燃艾條,其余與治療組相同。

    1.3 測定指標

    1.3.1 創(chuàng)面面積測定 7天組在治療第2、4、8天時用醋酸紙覆蓋于創(chuàng)面,并沿創(chuàng)面邊緣劃線。采用求積儀測繪創(chuàng)面面積。愈合指數(shù)=(1-現(xiàn)切口面積/原切口面積)×100%[4]。

    1.3.2 組織形態(tài)學觀察 治療完成后,各組分別將大鼠以1%戊巴比妥作腹腔注射麻醉取創(chuàng)面皮膚組織,組織標號后浸入10%中性甲醛溶液中固定,常規(guī)石蠟包埋切片進行HE染色。在40×10倍光鏡下,每張切片采集10個視野的圖像,計算單位面積內(nèi)所含成纖維細胞數(shù)。

    1.3.3 觀察角質細胞生長因子(KGF)將包埋后的石切片,然后進行脫水、過氧化氫阻斷處理、BSA封閉、Rabbit Anti-KGF處理、抗體孵育、聚合HRP標記抗兔IgG結合、DAB顯色等免疫組化過程。在40×10倍光鏡下,觀察1天、3天、7天組創(chuàng)面修復組織中KGF的表達。

    1.4 統(tǒng)計學處理

    2 結果

    2.1 創(chuàng)面愈合的基本病理變化

    實驗第2天,大部分皮膚創(chuàng)面干燥結痂,無滲出物,模型組中有少部分創(chuàng)面濕潤,有少許滲出物。創(chuàng)面邊緣出現(xiàn)紅暈及皺褶。1天皮膚創(chuàng)面組織鏡下可以見:創(chuàng)面邊緣肉芽向傷口長入。肉芽組織成分以炎性細胞為主。第4天所有創(chuàng)面均干燥,可見肉芽組織明顯增生。3天模型組肉芽組織顏色為深紅色,創(chuàng)面邊緣皺褶增多、變硬;治療組肉芽組織顏色為暗紅色,局部長出薄皮,創(chuàng)面邊緣皮膚皺褶增多、收縮明顯。3天皮膚創(chuàng)面組織鏡下可見:模型組肉芽組織中仍以炎性細胞為主,創(chuàng)面底部可見成纖維細胞增生;治療組創(chuàng)面切口兩側距離減小,成纖維細胞排列緊密。第8天7天模型組創(chuàng)面明顯縮小,基本為肉芽組織所填充,但未見完全愈合;治療組創(chuàng)面已基本愈合,僅剩不明顯線性痕跡。7天皮膚創(chuàng)面組織鏡下可見:模型組肉芽組織生長旺盛,成纖維細胞增多,炎性細胞減少;治療組肉芽組織可見大量成纖維細胞以及纖維細胞。

    2.2 皮膚創(chuàng)面愈合指數(shù)

    圖1 皮膚創(chuàng)面愈合指數(shù)

    由圖1可見,造模后第4天創(chuàng)面愈合指數(shù)統(tǒng)計結果顯示:大鼠皮膚創(chuàng)面愈合指數(shù)(%)治療組(39.6±4.80)與模型組(30.5 ±5.41)相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。造模后第8天創(chuàng)面愈合指數(shù)統(tǒng)計結果顯示:大鼠皮膚創(chuàng)面愈合指數(shù)(%)治療組(100.0±0.00)與模型組(63.5±5.21)相比,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。說明艾灸治療組創(chuàng)面愈合程度優(yōu)于模型組。

    2.3 皮膚創(chuàng)面中成纖維細胞數(shù)量

    見表1、圖2。光鏡下觀察,3天治療組成纖維細胞數(shù)量與模型組相比無顯著差異(P>0.05)。7天治療組成纖維細胞數(shù)量較模型組明顯增多,差異顯著(P <0.05)。

    表1 皮膚創(chuàng)面中成纖維細胞數(shù)量的比較(±s,單位:個/mm2)

    表1 皮膚創(chuàng)面中成纖維細胞數(shù)量的比較(±s,單位:個/mm2)

    注:與治療組相比,aP >0.05,bP <0.05。

    組別 n 3天 7天4 15.5 ±2.08 26.5 ±1.29模型組 4 12.5 ±1.91a 23.8 ±1.70治療組b

    圖2 7天大鼠皮膚創(chuàng)面組織成纖維細胞HE染色,40×10

    2.4 角質細胞生長因子KGF表達

    由圖3可見,光鏡下觀察:模型組:1天未見KGF表達;3天皮膚創(chuàng)面KGF表達呈弱陽性;7天皮膚創(chuàng)面KGF表達呈陽性。治療組:1天未見KGF表達;3天皮膚創(chuàng)面KGF表達呈陽性;7天皮膚創(chuàng)面KGF表達呈強陽性。

    3 討論

    圖3 7天大鼠皮膚創(chuàng)面組織KGF陽性表達免疫組化,40×10

    近年來,伴隨細胞和分子生物學的發(fā)展,對于創(chuàng)傷修復的研究已經(jīng)由傷后形態(tài)學向分子機制方向發(fā)展。許多研究者開展了各種細胞及生長因子對創(chuàng)傷修復影響的研究。研究指出,在創(chuàng)傷發(fā)生的最初兩天,最先進入創(chuàng)面的是中性粒細胞,創(chuàng)傷發(fā)生2~3天后,成纖維細胞順著濃度梯度從周圍組織中遷移到創(chuàng)傷部位,影響著創(chuàng)傷愈合過程[5]。KGF在真皮細胞中,具有強烈的致分裂原活性,在全層皮膚的損傷中,激發(fā)肉芽組織的形成,激發(fā)表皮生長[6]。外源性KGF能促進皮膚創(chuàng)面上皮細胞增殖,加速創(chuàng)面的愈合,明顯縮短創(chuàng)傷修復時間[7]。因此,成纖維細胞和角質細胞生長因子(KGF)均參與并影響創(chuàng)傷修復的過程。本研究中HE染色顯示7天治療組皮膚創(chuàng)面中成纖維細胞數(shù)量較模型組明顯增多,與模型組相較差異有顯著意義(P<0.05),說明艾灸加速了成纖維細胞的增值,從而促進皮膚創(chuàng)面的愈合。通過觀察KGF表達發(fā)現(xiàn),治療組KGF表達相比模型組較為明顯,說明艾灸可以使KGF的表達增強,從而影響表皮細胞的增值,促進創(chuàng)面的愈合。從皮膚創(chuàng)面愈合指數(shù)方面比較,治療組創(chuàng)面愈合程度也優(yōu)于模型組。說明艾灸可以促進皮膚創(chuàng)面的愈合。

    4 結論

    艾灸作為祖國醫(yī)學傳統(tǒng)的治療方法,具有安全、簡便、無副作用的特點,所以艾灸可能會成為將來治療皮膚創(chuàng)傷的有效手段。雖然本研究作為動物實驗,未能證實艾灸治療人類皮膚創(chuàng)傷仍具有一定療效,但卻為將來將艾灸治療皮膚創(chuàng)傷修復應用于臨床提供了動物實驗基礎和依據(jù),為治療皮膚創(chuàng)傷修復提供了一個新的思路。

    [1]石學敏.針灸學[M].北京:中國中醫(yī)藥出版社,2007:152-153

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