李鴻梅,苗琇巖,魏 明,趙 慧,閔偉紅
(吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,吉林長春 130118)
羅耳阿太菌(Athelia rolfsii)屬半知菌亞門小菌核屬,有性世代為齊整小核菌(Sclerotium rolfsii)[1-2]。該菌所分泌的多糖具有優(yōu)良的增稠性[3]、假塑性[4]、抗菌性[5]、抗腫瘤活性、免疫活性[6],廣泛應(yīng)用于食品[7]、藥品、陶瓷、石油等領(lǐng)域[8]。目前,德國Cargill公司、美國Pillshury公司已有小菌核屬多糖工業(yè)化產(chǎn)品,而我國對該多糖的需求主要依賴進(jìn)口,主要原因是缺乏高產(chǎn)多糖的優(yōu)良菌株。
誘變是改良菌種的基本方法。常用誘變方法包括物理誘變(如紫外線、X射線、γ射線、快中子)和化學(xué)誘變(如堿基類似物誘變劑、移碼突變劑、烷化劑等)[9]。由于單獨(dú)使用一種誘變方法,誘變效率低,且易發(fā)生回復(fù)突變。目前國內(nèi)外學(xué)者通常采用紫外線或亞硝基胍誘變方法改良真菌菌種[10]。1976年,小菌核屬多糖由法國CECA S.E.公司商業(yè)化,商品名為Biopolymer CS,隨后法國賽諾菲生物公司收購了CECA S.E.公司,成為國際上生產(chǎn)小菌核屬多糖的主要生產(chǎn)者,并為該種多糖取商業(yè)名為Polytran[11]。目前我國還沒有該多糖的工業(yè)化產(chǎn)品,而且缺乏對羅耳阿太菌及其相近菌屬的菌種改良研究工作。本文通過響應(yīng)面設(shè)計紫外線(UV)和亞硝基胍(NTG)復(fù)合誘變羅耳阿太菌,根據(jù)目標(biāo)致死率優(yōu)化誘變條件,獲得高產(chǎn)多糖的正向突變菌株,提高多糖產(chǎn)量[12],為該多糖在國內(nèi)的工業(yè)化生產(chǎn)奠定一定的科學(xué)基礎(chǔ)。
羅耳阿太菌(Sclerotium rolfsii) 吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)發(fā)酵實驗室保藏菌種;亞硝基胍(NTG)溶液 稱取10mg亞硝基胍于棕色瓶中,加1.0mL丙酮使其溶解,溶解后加10mL水,配制成1.0mg/mL亞硝基胍溶液[12-13];PBS溶液 稱7.9g NaCl,0.2g KCl,0.24g KH2PO4、1.8g K2HPO4,溶于800mL蒸餾水中,用HCl調(diào)pH至7.4,用蒸餾水定容至1L,保存于4℃冰箱中備用;PDA斜面培養(yǎng)基(g/L) 馬鈴薯200、葡萄糖20、瓊脂20,pH自然;種子培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖30.0、NaNO33.0、KH2PO41.0、酵母浸粉1.0、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5,pH4.0;發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L) 葡萄糖35.0、NaNO33.0、KH2PO41.0、酵母浸粉1.0、KCl 0.5、MgSO4·7H2O 0.5、檸檬酸1.4,pH4.5。
HZC-Q空氣浴振蕩器 哈爾濱市東聯(lián)技術(shù)開發(fā)有限公司;HPX-9082 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博迅實業(yè)有限公司;pH計 上海雷茲儀器廠;高速低溫離心機(jī)Z-36HK 德國HERMLE;HH-8水浴鍋 國華電器有限公司;MP6001電子天平 上海恒平有限公司。
1.2.1 菌種選育程序 出發(fā)菌株→制備菌絲體懸液→稀釋→誘變處理→涂平板→挑取單菌落斜面培養(yǎng)→搖瓶復(fù)篩→測定多糖產(chǎn)量。
1.2.2 培養(yǎng)條件 菌種斜面活化:29℃培養(yǎng)3d。種子搖瓶培養(yǎng):100mL種子液,29℃,200r/min,2d。發(fā)酵搖瓶培養(yǎng):100mL發(fā)酵液,接種量7%,29℃,200r/min,5.5d。
1.2.3 多糖提取 向培養(yǎng)結(jié)束的液體培養(yǎng)基中加3倍體積蒸餾水,用1mol/L NaOH調(diào)pH為7.0,80℃水浴處理40min,8000r/min離心30min,取300mL上清液,加入等體積95%乙醇,4℃靜置醇沉8h,5000r/min離心20min,取沉淀80℃烘干至恒重,稱量。
1.2.4 誘變方法
1.2.4.1 紫外誘變 將斜面培養(yǎng)基保存的菌種接種到種子培養(yǎng)液中,29℃下培養(yǎng)24h,勻漿,稀釋至10-3,轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中,在15W紫外燈下20cm處照射30s(紫外燈預(yù)熱30min),取0.1mL菌液涂平板。將平板置于29℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)3d,計算致死率:
式中,S1—誘變處理前菌落面積;S2—誘變處理后菌落面積。
按上述方法固定其他因素,選擇紫外照射時間為20、30、40、50、60、70s,菌液稀釋梯度為10-1、10-2、10-3、10-4、10-5,培養(yǎng)時間為12、18、24、30、36h,分別進(jìn)行單因素實驗。在突變株中選取7個長勢較好的菌株,分別命名UV1、UV2、UV3、UV4、UV5、UV6、UV7,進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),提取并測定多糖產(chǎn)量。
1.2.4.2 亞硝基胍(NTG)誘變 將斜面培養(yǎng)基保存的菌種接種到種子培養(yǎng)液中,29℃培養(yǎng)24h,8000r/min離心10min,收集菌絲體,用PBS沖洗1次,加入0.5mL PBS制成菌絲體懸液,加入0.4mg/mL NTG溶液0.5mL,29℃處理40min后離心,用PBS沖洗菌絲體沉淀3次,除去殘留的NTG,轉(zhuǎn)移至100mL種子培養(yǎng)基中29℃培養(yǎng)2d,勻漿振蕩2min,稀釋10-3,涂平板,29℃培養(yǎng)3d,計算致死率。
按上述方法固定其他因素,選擇亞硝基胍濃度0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6mg/mL,誘變時間10、20、30、40、50、60min,分別進(jìn)行單因素實驗。根據(jù)單因素實驗結(jié)果選擇亞硝基胍誘變條件為:亞硝基胍濃度0.4mg/mL,亞硝基胍處理時間40min,進(jìn)行亞硝基胍誘變。在突變株中選取7個長勢較好的菌株,分別命名為NTG1、NTG2、NTG3、NTG4、NTG5、NTG6、NTG7,進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),提取并測定多糖產(chǎn)量。
1.2.4.3 紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變 將斜面培養(yǎng)基保存的菌種接種到種子培養(yǎng)液中,29℃培養(yǎng)24h,勻漿,稀釋10-3。15W紫外燈下20cm處照射菌絲體懸浮液一段時間(響應(yīng)面設(shè)計),8000r/min離心10min,收集菌絲體,用PBS沖洗1次,加入0.5mL PBS制成菌絲體懸液,加入一定濃度的NTG(響應(yīng)面設(shè)計),浸泡紫外誘變后的菌絲體,29℃誘變處理一段時間(響應(yīng)面設(shè)計)后離心,離心后用PBS沖洗菌絲體沉淀3次,除去殘留的NTG,轉(zhuǎn)移菌絲體至100mL種子培養(yǎng)基中,29℃下培養(yǎng)2d,勻漿,稀釋10-3,涂平板,29℃培養(yǎng)3d,計算致死率。從平板上隨機(jī)選取16個長勢較好的菌株,進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),提取并測定多糖產(chǎn)量。
1.2.4.4 響應(yīng)面實驗設(shè)計復(fù)合誘變 紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變響應(yīng)面設(shè)計因素見表1。
表1 紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變響應(yīng)面因素表Table 1 Response surface factors and levels on UV and NTG mutagenize
1.2.5 遺傳穩(wěn)定性實驗 選取誘變后得到的多糖產(chǎn)量較高的變異菌株連續(xù)傳代5次,每代分別進(jìn)行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng),提取并測定多糖產(chǎn)量。
2.1.1 紫外照射時間對致死率的影響 按1.2.4.1采用不同的照射時間對菌體進(jìn)行處理,以未經(jīng)紫外照射的菌株為對照,計算致死率,結(jié)果見圖1。由圖1可知,隨照射時間的延長,致死率逐漸增加。較高的誘變指標(biāo)(致死率)有利于篩選優(yōu)良菌株,但由于紫外線有殺菌的效果,如果處理時間過長,一些高活性菌株也可能致死,不利于篩選。因此,選擇70%~80%為目的致死率。從圖1中可看出當(dāng)處理時間為50s時,致死率達(dá)71.65%,因此選取50s為紫外照射時間。
圖1 照射時間對UV誘變致死率的影響Fig.1 Effect of UV radiation time on lethality rate
2.1.2 菌液稀釋梯度對致死率的影響 稀釋梯度對致死率的影響見圖2,從圖2中可以明顯看出,菌液稀釋梯度對致死率影響較大。當(dāng)稀釋梯度為10-1時,紫外誘變致死率較低,僅為17.32%,這可能是由于菌絲體密度過大影響了紫外線的穿透能力,使誘變效果不明顯;隨著菌液濃度的增大,紫外線的穿透能力隨之增強(qiáng),菌種致死率明顯增加。但是菌液濃度過低時,菌絲體含量較少,紫外線穿透量過大,紫外照射會殺死大量菌體,所以當(dāng)稀釋梯度為10-5時,致死率接近100%。稀釋梯度為10-3時,致死率為68.32%,接近目標(biāo)致死率。因此,稀釋梯度選擇為10-3。
圖2 菌液稀釋梯度對UV誘變致死率的影響Fig.2 Effect of diluted Athelia rolfsii liquid gradient on lethality rate by UV
2.1.3 種子培養(yǎng)基培養(yǎng)時間對致死率的影響 選擇種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間的菌種進(jìn)行紫外誘變,致死率結(jié)果見圖3。從圖3中可以看出,在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)12h時的菌種經(jīng)紫外照射后,在平板培養(yǎng)基中基本沒有菌落出現(xiàn),這可能是由于經(jīng)過12h的培養(yǎng),菌種生長還停留在適應(yīng)期,紫外照射引起成大量菌種死亡;而經(jīng)過種子培養(yǎng)基培養(yǎng)36h的菌種,紫外誘變后致死率僅為34.79%,可能是由于菌體生長處于對數(shù)期末期或穩(wěn)定期,此期間菌體生長狀況基本穩(wěn)定,紫外照射誘變后的菌種致死率較低。培養(yǎng)24h的菌種經(jīng)紫外誘變后致死率為74.68%,符合目的致死率。因此,選擇培養(yǎng)24h的菌種進(jìn)行紫外誘變處理。
圖3 種子培養(yǎng)時間對UV誘變致死率的影響Fig.3 Effect of Athelia rolfsii incubation time in seed culture medium on lethality rate by UV
2.1.4 紫外誘變對多糖產(chǎn)量的影響 紫外誘變對多糖產(chǎn)量的影響如圖4所示,采用單因素實驗獲得的最佳條件(紫外照射時間50s、稀釋梯度10-3、培養(yǎng)時間24h)對羅耳阿太菌進(jìn)行紫外誘變,突變株多糖產(chǎn)量有明顯變化。正向突變株多糖產(chǎn)量明顯增加,其中UV1、UV2、UV6和UV7多糖產(chǎn)量相對出發(fā)菌株增長率均高于10%。UV7多糖產(chǎn)量最高,達(dá)17.759g/L,比出發(fā)菌株16.042g/L增長了10.70%。
圖4 紫外誘變菌株的多糖產(chǎn)量Fig.4 Polysaccharide production from different mutant strains treated by UV
2.2.1 亞硝基胍濃度對致死率的影響 亞硝基胍是有效的化學(xué)誘變劑,可以使DNA分子上的堿基及磷酸部分烷化,導(dǎo)致DNA復(fù)制時堿基配對錯誤而引起突變。不同濃度亞硝基胍誘變菌體所得致死率結(jié)果見圖5,亞硝基胍濃度為0.1mg/mL時,致死率僅為13.16%。隨著亞硝基胍濃度的增加,致死率明顯升高,當(dāng)亞硝基胍濃度達(dá)到0.4mg/mL時,致死率為71.35%,在目標(biāo)致死范圍之內(nèi)。繼續(xù)提高亞硝基胍濃度,菌體致死率迅速提高,濃度為0.6mg/mL時,菌體基本完全死亡。所以在亞硝基胍誘變中選擇亞硝基胍濃度為0.4mg/mL。
圖5 亞硝基胍濃度對致死率的影響Fig.5 Effect of NTG concentration on lethality rate
圖6 亞硝基胍處理時間對致死率的影響Fig.6 Effect of treated time by NTG on lethality rate
2.2.2 亞硝基胍處理時間對致死率的影響 一般來說,延長亞硝基胍的處理時間,會增大菌體DNA突變的幾率,從而提高致死率。真菌誘變致死率一般要求控制在70%~80%之間,為了獲得這樣高的致死率,通常控制亞硝基胍的處理時間在20~70min之間。亞硝基胍誘變時間對菌體致死率的影響結(jié)果見圖6。由圖6可知,亞硝基胍處理10min,菌體的致死率為26.32%;隨著誘變時間的增加,菌體致死率顯著提高。誘變時間為40min時,致死率達(dá)到79.65%,在目標(biāo)致死范圍之內(nèi)。誘變時間為60min時,菌體基本死亡。因此在亞硝基胍誘變中處理時間選擇40min。
2.2.3 亞硝基胍誘變對多糖產(chǎn)量的影響 亞硝基胍誘變對多糖產(chǎn)量的影響如圖7所示,采用單因素實驗獲得的最佳條件(亞硝基胍濃度0.4mg/mL,亞硝基胍處理時間40min)對羅耳阿太菌進(jìn)行亞硝基胍誘變,突變株多糖產(chǎn)量有明顯變化。正向突變株多糖產(chǎn)量明顯增加,其中NTG1、NTG2、NTG5和NTG7多糖產(chǎn)量相對于出發(fā)菌株增長率均高于14%。其中NTG7多糖產(chǎn)量最高,達(dá)18.573g/L,比出發(fā)菌株16.042g/L增長了15.78%。
圖7 亞硝基胍誘變突變株的多糖產(chǎn)量Fig.7 Polysaccharide production from different mutant strains treated by NTG
2.3.1 復(fù)合誘變條件 根據(jù)表1進(jìn)行紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變,實驗結(jié)果見表2,響應(yīng)面結(jié)果分析、回歸模型參數(shù)方差分析見表3。
以致死率為響應(yīng)值回歸擬合所得各因素函數(shù)表達(dá)如下:Y=79.20+4.40A+13.35B+4.03C-7.03AB-0.23AC-3.32BC-0.63A2-1.64B2+3.62C2。
由方差分析得出p值,模型極顯著,模型的失擬性不顯著,回歸決定系數(shù)R2=0.9897,修正決定系數(shù)R2Adj=0.9764,說明方程擬合性較好,可對培養(yǎng)條件分析預(yù)測。采用Design Expert 8.0.5對結(jié)果分析,目標(biāo)致死率選擇75%,確定復(fù)合條件見表4。
2.3.2 復(fù)合誘變對多糖產(chǎn)量的影響 按表4中修正條件對羅耳阿太菌進(jìn)行復(fù)合誘變,突變株多糖產(chǎn)量如圖8所示,每組選取四株長勢較好的突變株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng),都能篩選出正向突變菌株,其中X2、X3、X13菌株的多糖產(chǎn)量均達(dá)到19g/L以上。紫外照射40s,濃度為0.28mg/mL的亞硝基胍處理25min的突變菌株X2多糖產(chǎn)量最高,達(dá)19.868g/L,比出發(fā)菌株16.042g/L增長了23.85%。
將圖8中X2突變株連續(xù)傳代培養(yǎng)5次,發(fā)酵測定多糖產(chǎn)量,多糖產(chǎn)量遺傳穩(wěn)定性結(jié)果見表5。由表5可知,在幾次傳代中,多糖產(chǎn)量基本相同,均達(dá)到19.6g/L以上。對傳代5次的多糖產(chǎn)量進(jìn)行方差分析,計算方差為0.001,表明經(jīng)過傳代后的X2菌株多糖產(chǎn)量基本穩(wěn)定。實驗結(jié)果表明X2菌株產(chǎn)多糖的遺傳穩(wěn)定性較好。
表2 響應(yīng)面實驗設(shè)計及結(jié)果Table 2 Process variables and levels of UV and NTG in response surface central composite design and experimental results
表3 復(fù)合誘變回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis for regression model of composite mutation
圖8 紫外與亞硝基胍復(fù)合誘變菌株多糖產(chǎn)量Fig.8 Polysaccharide production from different mutanted strains treated by UV and NTG
表4 優(yōu)化復(fù)合誘變條件Table 4 Variance analysis for regression model of composite mutation
表5 突變菌株X2產(chǎn)多糖遺傳穩(wěn)定性Table 5 Stablity of polysaccharide production from X2
分別采用紫外線和亞硝基胍誘變羅耳阿太菌,UV7突變株多糖產(chǎn)量為17.759g/L,NTG7突變株多糖產(chǎn)量為18.573g/L。紫外線和亞硝基胍復(fù)合誘變條件為:紫外照射40s,亞硝基胍濃度0.28mg/mL,亞硝基胍處理時間25min,篩選得到X2突變株,多糖產(chǎn)量最高為19.868g/L,比出發(fā)菌株16.042g/L增長了23.85%。以X2為出發(fā)菌株,連續(xù)傳代5次,多糖產(chǎn)量基本一致,表明通過亞硝基胍與紫外復(fù)合誘變得到的X2菌株遺傳穩(wěn)定性較好。
[1]魏景超.真菌鑒定手冊[M].上海:上??茖W(xué)科技出版社,1979.
[2]喻璋,張猛.半知菌分屬圖冊[M].北京:科學(xué)出版社,2009.
[3]PRETUS H,ENSLEY H,MCNAMEE R,et al.Isolation,physicochemical characterization and preclinical efficacy evaluation of soluble scleroglucan[J].Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics,1991,257(1):500-510.
[4]賈薇,鄭志永,劉汝冰,等.一種新型微生物多糖流變學(xué)初探[J].食品科學(xué),2009,30(1):135-138.
[5]MASTROMARINO P,PETRUZZIELLO R,MACCHIA S,et al.Antiviral activity of natural and semisynthetic polysaccharides on the early steps of rubella virus infection[J].Journal of Antimicrobial Chemotherapy,1997,39(3):339-345.
[6]JAMAS S,EASSON JR D D,OSTROFF G R.Use of aqueous soluble glucan preparations to stimulate platelet production:U.S.Patent 5,532,223[P].1996.
[7]VINARTA S,MOLINA O,F(xiàn)IGUEROA L,et al.A further insight into the practical applications of exopolysaccharides fromSclerotium rolfsii[J].Food hydrocolloids,2006,20(5):619-629.
[8]VI ARTA S C,YOSSEN M M,VEGA J R,et al.Scleroglucan compatibility with thickeners,alcohols and polyalcohols and downstream processing implications[J].Carbohydrate Polymers,2012,chap,2.
[9]馮云,任路靜,魏萍,等.微生物發(fā)酵產(chǎn)二十二碳六烯酸代謝機(jī)理的研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報,2010,26(9):1225-1231.
[10]張春玲.紫外線與亞硝基胍復(fù)合誘變選育高產(chǎn)海藻糖菌株的研究[J].食品科學(xué),2009,30(21):188-191.
[11]Survase S A,Saudagar P S,Bajaj I B,et al.Scleroglucan:fermentative production,downstream processing and applications[J].Food Technology and Biotechnology,2007,45(2):107-118.
[12]楊歡歡,胡中澤.紅曲菌的復(fù)合誘變及其固態(tài)發(fā)酵條件的優(yōu)化[J].食品科學(xué),2012,33(11):247-251.
[13]吳慧昊,牛鋒.乳酸菌低溫菌株的復(fù)合誘變選育[J].微生物學(xué)通報,2013,40(4):631-645.