正交法優(yōu)化新疆蘆葦根蘑菇液體培養(yǎng)基的研究*

郭永紅,張微思，何 容，羅曉莉，黃仕文，桂明英**

(1.云南省食用菌工程技術研究中心，云南 昆明 650223；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.文山州硯山縣八嘎鄉(xiāng)農技站，云南 硯山 663100)

〈栽培技術〉

正交法優(yōu)化新疆蘆葦根蘑菇液體培養(yǎng)基的研究*

郭永紅1,2,張微思1,2，何 容2，羅曉莉2，黃仕文3，桂明英2**

(1.云南省食用菌工程技術研究中心，云南 昆明 650223；2.中華全國供銷合作總社昆明食用菌研究所，云南 昆明 650223；3.文山州硯山縣八嘎鄉(xiāng)農技站，云南 硯山 663100)

本文采用液體培養(yǎng)法，研究新疆蘆葦根蘑菇對碳氮源的利用情況，并以四因素三水平的正交試驗進行培養(yǎng)基配方的優(yōu)化。結果表明，新疆蘆葦根蘑菇的最適培養(yǎng)基配方為糊精30 g·L-1、酵母粉2 g·L-1、MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1、KH2PO40.25 g·L-1。

新疆蘆葦根蘑菇；液體培養(yǎng)基；正交試驗

新疆蘆葦根蘑菇，采自新疆郭音巴楞州博湖縣蘆葦蕩，該蘑菇具有營養(yǎng)豐富、味道鮮美、子實體大等特點，市場銷量逐年增加。為滿足人們的生活需要，開發(fā)新疆蘆葦根蘑菇種質資源已成為人們研究的新課題。通過實地采樣后對其子實體進行了組織分離，成功獲得斜面母種，并對其進行了液體培養(yǎng)基的優(yōu)化。即從液體培養(yǎng)常用的幾種碳氮源中篩選出較優(yōu)者[1]，并采用正交試驗的方法獲得碳源、氮源、無機鹽3種營養(yǎng)成分之間的最合理搭配[2，3]，獲得蘑菇的最適液體培養(yǎng)基，為人工栽培提供可靠的實驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株

新疆蘆葦根蘑菇，分離自新疆郭音巴楞州博湖縣蘆葦蕩蘑菇。

1.1.2 培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯20%、葡萄糖2%、瓊脂2%，pH自然；基礎培養(yǎng)基：葡萄糖2%、蛋白胨0.2%、KH2PO40.1%、MgSO4·7H2O 0.05%、VB10.01%，pH自然。各碳源、氮源不同的培養(yǎng)基分別取代其中的葡萄糖和蛋白胨，其余成分不變。配方見表1。

表1 液體培養(yǎng)基配方

1.2.1 斜面菌種制備

將新疆蘆葦蘑菇進行組織分離，接種于斜面培養(yǎng)基上，于25℃培養(yǎng)7 d。

1.2.2 培養(yǎng)方法及條件

取2小塊1 cm2菌塊接種于液體培養(yǎng)基，使菌絲朝上懸浮于液體培養(yǎng)基，置于25℃培養(yǎng)箱靜止培養(yǎng)，每天觀察并記錄菌絲生長情況。

1.2.3 菌絲體生物量的計算

過濾發(fā)酵液，清洗菌絲體出去殘留培養(yǎng)基，60℃烘箱烘干菌絲體至恒重，稱重并計算生物量(M，g·L-1)，公式為：

M=m1100×1000

式中：m1為100 mL發(fā)酵液中菌絲體干重。

綜上所述，國內尿素走勢并不如意，開工率下滑利好不斷被業(yè)內炒作，或已透支；所謂的印度招標利好也不及預期。不可否認，當前行業(yè)低開工局面確實給低庫存或零庫存的尿素企業(yè)提供了挺價籌碼，但內需疲軟，暫時不允許工廠去考慮“貨緊價揚”。換而言之，或許淡儲期間的供應量不及往年水平，下游經銷商庫存量偏低，但并不能改變此時下游對高價尿素的不認可。當然，不排除眾多經銷商在本輪尿素跌價期間等待新的抄底機會，但相應心理價位仍需進一步博弈。預計11月底，國內尿素主產區(qū)報價2000元/噸左右。

1.2.4 最適碳氮源篩選試驗

(1)最適碳源試驗

分別以2%葡萄糖、蔗糖、淀粉、乳糖、麥芽糖、果糖、糊精作為基礎培養(yǎng)基的碳源，按配方配制7組培養(yǎng)基，每組3個重復。

(2)最適氮源試驗

分別以0.2%蛋白胨、尿素、牛肉膏、酵母粉、NH4Cl、NH4NO3、NaNO3作基礎培養(yǎng)基中的氮源，按配方配7組培養(yǎng)基，每組3個重復。

將配好的培養(yǎng)基裝入500 mL的三角瓶中，每瓶裝100 mL，121℃滅菌20 min。冷卻后接種，于25℃培養(yǎng)箱振蕩培養(yǎng)，每天觀察并記錄菌絲生長情況，至菌絲最旺時稱量菌絲體干重。

1.2.5 正交試驗

考慮碳氮比及無機鹽之間的交互作用對菌絲體生長的影響，選取最適碳氮源試驗中得到的碳源和氮源，無機鹽采用KH2PO4、MgSO4·7H2O，維生素選擇VB1，設計四因素三水平的正交試驗。用L9(34)正交試驗方法以發(fā)酵終點菌絲體干重為主要指標，篩選4者之間的最優(yōu)搭配，每組設3次重復。

2 結果與分析

2.1 最適碳源篩選結果

發(fā)酵終點稱量各供試培養(yǎng)基中菌絲體干重，計算出生物量，結果見圖1。

由圖1可知，蘑菇菌絲生長能優(yōu)先利用的碳源為糊精，生物量為2.93 g·L-1；其次為乳糖、蔗糖、果糖；而該蘑菇對淀粉的利用率最差。最后，選擇糊精作為蘑菇生長的最佳碳源來進行氮源的篩選試驗。

2.2 最適氮源篩選結果

發(fā)酵終點稱量各供試培養(yǎng)基中菌絲體干重，計算出生物量，結果見圖2。

由圖2可知，菌絲生長的最適氮源為酵母粉，生物量高達3.61 g·L-1；其次為牛肉膏和尿素，生物量分別為 2.64 g·L-1、2.61 g·L-1；利用較差的為無機氮源，其中以NaNO3最差。表明該蘑菇在以有機氮源進行液體發(fā)酵時，菌絲體生物量產率明顯高于無機氮源，可見在其菌絲體生長過程中，對有機氮源的利用優(yōu)于無機氮源，而對這幾種無機氮源的利用相差不大。最后選擇酵母粉作為蘑菇液體培養(yǎng)基的最佳氮源進行正交試驗。

2.3 正交試驗優(yōu)化蘑菇發(fā)酵培養(yǎng)基

以得到的最適碳源糊精作為碳源，最適氮源酵母粉作為氮源，以及無機鹽KH2PO4、MgSO4·7H2O作為正交試驗四因素，設計了四因素三水平的正交試驗，其設計及結果見表2和表3。

表2 L9(34)正交試驗因素水平表

表3 正交實驗結果L9(34)

根據極差大小，判斷因素的主次影響順序，R越大，表示該因素的水平變化對試驗指標的影響越大，因素越重要。由表3可知，糊精對蘑菇菌絲的生長影響最大，其次是無機鹽MgSO4·7H2O和酵母粉，KH2PO4對菌絲生長的影響最小。各因素的主次順序為A>D>B>C，A因素為主要因素，C因素為不重要因素。

進一步考察各因子對指標的影響，對正交試驗進行了方差分析，見表4。

表4 正交實驗的方差分析

注：F0.10(2，8)=3.11。

從表4的方差分析結果可以看出，因素A在90%的置信度下的F比大于F0.10(2，8)，表明糊精對試驗結果有一定的影響；因素B、C、D對試驗影響不顯著。從極差分析和方差分析結果可以確定培養(yǎng)基的最佳組合為A3B3C2D1，即糊精30 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1、KH2PO40.25 g·L-1。

3 結論

碳源試驗結果顯示，乳糖、蔗糖、果糖、糊精有利于蘑菇菌絲生長，其中以糊精最好。

氮源試驗表明，酵母粉、牛肉膏和尿素是蘑菇較適宜的發(fā)酵氮源，二無機氮源不利于菌絲體的生長。

L9(34)正交試驗結果確定的蘑菇液體發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組分為糊精30 g·L-1、酵母粉3 g·L-1、MgSO4·7H2O 1.0 g·L-1、KH2PO40.25 g·L-1。

[1]劉東，李世敏，許柏球，等. 靈芝菌絲體深層液體培養(yǎng)基研究[J]. 微生物學雜志，2001，21(2)：15-17.

[2] 楊立紅，倪新江，黃清榮，等. 栽培基質對巴西蘑菇胞外酶活性的影響[J]. 吉林農業(yè)大學學報，2004，26(6)：284-286.

[3] 王怡平，肖亞中，沈中興，等. 正交試驗法優(yōu)化食用菌深層發(fā)酵的泥炭培養(yǎng)基[J]. 安徽大學學報，1996，20(2)：93-97.

Orthogonal Optimization of Liquid Medium of Xinjiang Reed Root Mushroom

GUO Yong-hong1,2, ZHANG Wei-si1,2, HE Rong2, LUO Xiao-li2, HUANG Shi-wen3, GUI Ming-ying2

(1.Edible Fungi Engineering Technology Research Center of Yunnan Province, KunmingYunnan650223; 2.Kunming Edible Fungi Institute of China Co-op, KunmingYunnan650223; 3.Agricultural Technician Station of Baga Counthy of Wenshan State, YanshanYunnan663100)

By liquid culture, Xinjiang reed root mushroom on the utilization situation of carbon and nitrogen source were studied, using orthogonal experiment with four factors and three levels for optimizating the formula of medium. The results showed that the optimal culture medium formula of Xinjiang reed root mushroom was dextrin 30 g·L-1, yeast extract 2 g·L-1, MgSO4·7H2O 0.5 g·L-1, KH2PO40.25 g·L-1.

Agaricus; Liquid Medium; Orthogonal test

*項目來源：國家科技支撐計劃課題“野生食用菌資源保護與開發(fā)利用技術研究”(2013BAD16B01)。

郭永紅(1964-)，女，研究員，主要從事食用菌資源保護及食用菌栽培技術研究。E-mail:guoyonghong@126.com

**通信作者：桂明英，研究員，主要從事食用菌資源的保護開發(fā)與研究。E-mail：guimingying@126.com

2013-11-24

S646.9

A

1003-8310(2014)01-0017-03