新疆維吾爾族抑郁癥基因樣本庫(kù)的初步建立及應(yīng)用

張麗麗， 韓書(shū)賢， 安治國(guó)， 鐘銜江， 羅 曉， 伊琦忠

(新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院心理醫(yī)學(xué)中心, 烏魯木齊 830054)

抑郁癥是一種慢性復(fù)發(fā)性精神疾病，在所有精神障礙中抑郁癥患病率最高。1993年，世界范圍的流行病學(xué)調(diào)查顯示，普通人群抑郁癥的患病率為5.8%[1]，且有很高的自殺風(fēng)險(xiǎn)[2]。

研究顯示，抑郁癥是一種多基因遺傳病，有家族聚集現(xiàn)象,從遺傳學(xué)的角度闡述發(fā)病機(jī)制及風(fēng)險(xiǎn)因素，對(duì)于抑郁癥的診斷及治療意義重大[3-4]。目前國(guó)內(nèi)多個(gè)研究機(jī)構(gòu)建立了抑郁癥基因數(shù)據(jù)庫(kù)，并發(fā)現(xiàn)與抑郁癥密切相關(guān)的88個(gè)基因[5-6]。新疆維吾爾族很少與漢族通婚，保有本民族的遺傳特色，是基因研究中不可多得的資源[7]。抑郁癥中的自殺行為一直為人們所關(guān)注[8-9]。有研究發(fā)現(xiàn)，5-HT合成限速酶色氨酸羥化酶2(TPH-2)與抑郁癥自殺傾向密切相關(guān)[10-14]。Zhang等[15]提出，在抑郁癥有自殺行為患者中，TPH-2基因位點(diǎn)rs7305115等位基因A與基因型A/A的頻率要低于無(wú)自殺行為的患者。本研究旨在初步建立新疆維吾爾族抑郁癥的基因樣本庫(kù)，并以rs7305115為例進(jìn)行危險(xiǎn)因素的評(píng)估。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象研究對(duì)象均來(lái)自世居新疆及無(wú)生物學(xué)親緣關(guān)系的維吾爾族人群。入組前簽署知情同意書(shū)，并通過(guò)新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的審查。樣本共計(jì)800例，男性364例，女性436例，平均年齡(40.85±0.43)歲。按職業(yè)分組：腦力勞動(dòng)者350例，體力勞動(dòng)者450例；按文化程度分組：高中文化程度以上313例，高中文化程度以下(包括高中)487例。入組標(biāo)準(zhǔn)：(1)2010年1月-2013年1月于新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院精神科及新疆其他精神病院治療的維吾爾族抑郁癥患者；(2)診斷、一般人口學(xué)資料及臨床信息的收集由2名主治醫(yī)師以上精神科醫(yī)生完成，采用半定式臨床檢查(SCID)進(jìn)行精神檢查，符合《美國(guó)精神障礙診斷與統(tǒng)計(jì)手冊(cè)》第4版(DSM-IV)抑郁發(fā)作的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(3)按照一般劃界分，漢密頓抑郁量表(HAMD-17)評(píng)分≥7分者視為有抑郁癥狀。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)中樞神經(jīng)系統(tǒng)及腦器質(zhì)性疾病患者；(2)嚴(yán)重軀體疾病，如腫瘤、內(nèi)分泌、心血管疾病、肝腎功能損傷及由軀體疾病繼發(fā)的抑郁；(3)其他精神疾病與精神發(fā)育遲滯患者；(4)有精神疾病陽(yáng)性家族史者；(5)孕期、哺乳期及月經(jīng)期女性。

1.2方法

1.2.1 一般人口學(xué)資料及臨床資料庫(kù)的建立 收集一般人口學(xué)資料，包括姓名、出生年、性別、民族、文化程度、職業(yè)、聯(lián)系方式等；臨床資料包括住院號(hào)、初次發(fā)病年齡、本次診斷、HAMD前17項(xiàng)評(píng)分、本次出院評(píng)價(jià)、是否為雙生兒、寄養(yǎng)子、近親婚配、精神病互相婚配、一級(jí)親族遺傳史等信息。上述信息首先填入“精神疾病家系調(diào)查表”，然后應(yīng)用Excel軟件建立與上述信息一一對(duì)應(yīng)的資料庫(kù)。

1.2.2 DNA樣本庫(kù)的建立

1.2.2.1 采集外周血 采集研究對(duì)象晨起空腹肘靜脈血各5 mL，2%EDTA抗凝處理。及時(shí)送往新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院重大疾病資源標(biāo)本庫(kù)。由專(zhuān)業(yè)人員控制質(zhì)量，進(jìn)行血清與血細(xì)胞的分離，統(tǒng)一編碼(參照國(guó)際通用標(biāo)準(zhǔn))。

1.2.2.2 基因組DNA的提取 每例樣本各選取500 μL血細(xì)胞，采用天根血液基因組提取試劑盒(DP319)提取DNA。

1.2.2.3 基因組DNA的質(zhì)量控制 用NanoDrop1000分光光度計(jì)對(duì)DNA樣本濃度、純度進(jìn)行測(cè)定并予以記錄。使純度(ODA280/A260)為1.6～1.9，濃度為200～500 ng/μL，不符合要求的重新提取。經(jīng)質(zhì)量控制后，將與Excel數(shù)據(jù)庫(kù)信息一一對(duì)應(yīng)的DNA樣本存入我院的重大疾病資源標(biāo)本庫(kù)，-80℃長(zhǎng)期保存，初步建立DNA樣本庫(kù)。

1.2.3 數(shù)據(jù)庫(kù)及DNA樣本庫(kù)的初步應(yīng)用

1.2.3.1 抑郁癥危險(xiǎn)因素評(píng)估 比較不同職業(yè)、文化程度各組間HAMD-17評(píng)分的差異，進(jìn)行危險(xiǎn)因素的評(píng)估。

1.2.3.2 TPH-2基因與抑郁癥自殺傾向的研究 隨機(jī)抽取DNA樣品268例，按有無(wú)自殺傾向(有自殺觀念或未遂)分組：自殺傾向組123例，無(wú)自殺傾向組145例，以rs7305115為例，進(jìn)行關(guān)聯(lián)性研究。具體方法如下：(1)利用primer 5.0設(shè)計(jì)引物，引物為：5′-ACCTGAGCCCACGAGACTTT -3′和5′-TCGAGCCAGAGCTGGAATAT-3′。(2)PCR擴(kuò)增目的片段，反應(yīng)體系為25 μL，包括模板DNA 50 ng 、12.5 μL PCR Master Mix、正向及反向引物各0.5 μL、ddH2O 6.5 μL。反應(yīng)條件為：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃ 5 min。(3)擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳檢測(cè)后，送往上海生物工程股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理根據(jù)是否符合正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)，應(yīng)用SPSS17.0軟件對(duì)不同文化程度、職業(yè)組間HAMD-17評(píng)分差異進(jìn)行t檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；對(duì)不同基因型組間HAMD-17評(píng)分差異進(jìn)行單因素方差分析。利用SHEsis軟件(http://analysis.bio-x.cn)進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡度檢驗(yàn)、組間等位基因和基因型頻率差異分析。

2 結(jié)果

2.1DNA樣本庫(kù)及臨床數(shù)據(jù)庫(kù)的初步建立收集維吾爾族抑郁癥患者基因組DNA共計(jì)800例，純度為1.6～1.9，濃度為200～500 ng/μL；對(duì)樣本庫(kù)進(jìn)行初步應(yīng)用后發(fā)現(xiàn)，rs7305115位點(diǎn)中基因型成功測(cè)定率為99.6%，進(jìn)一步證實(shí)了DNA樣本質(zhì)量可靠。且DNA樣品與臨床數(shù)據(jù)庫(kù)信息嚴(yán)格對(duì)應(yīng)，由本院重大疾病資源標(biāo)本庫(kù)專(zhuān)業(yè)人員保存，初步構(gòu)建了DNA樣品庫(kù)和資料庫(kù)。

2.2不同文化程度及職業(yè)患者HAMD-17評(píng)分的比較高中以下(包括高中)組HAMD-17評(píng)分為(26.45±0.30)分，與高中以上組HAMD-17評(píng)分(25.28±0.37)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=2.04，P=0.042)；體力勞動(dòng)者組HAMD-17評(píng)分為(26.43±0.31)分，和腦力勞動(dòng)者組HAMD-17評(píng)分(24.79±0.34)分比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.23，P<0.001)。

2.3不同基因型間HAMD-17評(píng)分的差異性比較對(duì)于rs7305115位點(diǎn)，剔除1例未成功測(cè)序的樣本，發(fā)現(xiàn)A/A、A/G、G/G 3種不同基因型組間HAMD-17評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表 1，測(cè)序圖見(jiàn)圖1。

表1 不同基因型間HAMD-17評(píng)分的比較 分)

圖中箭頭標(biāo)注位置為突變位點(diǎn)A/G

2.4rs7305115基因多態(tài)性與抑郁癥自殺傾向的關(guān)聯(lián)性自殺傾向組與無(wú)自殺傾向組間性別、年齡均衡可比(P性別=0.35；P年齡=0.85)，且基因型的分布均符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.05)。兩組間等位基因(P=0.20，OR=0.80，95%CI為0.57～1.12)與基因型(P=0.45)的分布頻率差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)表2。

表2 rs7305115基因多態(tài)性與抑郁癥自殺傾向的關(guān)聯(lián)性/例(%)

3 討論

新疆維吾爾族和漢族存在遺傳學(xué)和地理及社會(huì)文化背景等差異。本研究以rs7305115為例進(jìn)行的研究與Zhang等[15]的研究結(jié)論不相一致，提示內(nèi)地建立的漢族抑郁癥基因庫(kù)及尋找的基因位點(diǎn)不一定適合新疆維吾爾族抑郁癥病人。因此，建立維吾爾族抑郁癥樣品DNA庫(kù)和臨床數(shù)據(jù)庫(kù)，是研究維吾爾族抑郁癥發(fā)病機(jī)制、診斷、個(gè)體治療及新藥研究的基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)基因庫(kù)質(zhì)量的控制發(fā)現(xiàn)：DNA樣本質(zhì)量可靠，純度為1.6～1.9，濃度為200～500 ng/μL。以rs7305115為例進(jìn)行研究時(shí)，基因型成功測(cè)定率高達(dá)99.6%，且符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，進(jìn)一步說(shuō)明DNA樣品質(zhì)量可靠，且有良好的群體代表性。通過(guò)對(duì)臨床數(shù)據(jù)庫(kù)相關(guān)風(fēng)險(xiǎn)因素的分析，發(fā)現(xiàn)低文化程度和體力勞動(dòng)患者的病情嚴(yán)重，符合抑郁癥發(fā)病的一般規(guī)律。

郝偉[16]研究提示5-HT相關(guān)基因可能參與抑郁癥的發(fā)病機(jī)制。本研究通過(guò)初步應(yīng)用該基因庫(kù)，進(jìn)行 TPH-2基因多態(tài)性與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性研究。結(jié)果顯示A/A、A/G、G/G 3種不同基因型組間HAMD-17評(píng)分差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；有自殺傾向組與無(wú)自殺傾向組間等位基因與基因型的分布頻率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，未能找到rs7305115與抑郁癥自殺傾向有關(guān)的證據(jù)，也未能找到影響疾病嚴(yán)重程度的危險(xiǎn)基因或基因型。考慮一方面可能與樣本量偏小有關(guān)；另一方面，可能是由于維吾爾族特有的遺傳因素所致。

綜上所述，本研究初步建立了規(guī)范化的維吾爾族抑郁癥DNA樣品庫(kù)及臨床資料庫(kù)，并以TPH-2基因?yàn)槔龑?duì)該庫(kù)初步應(yīng)用，進(jìn)行其與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性研究，進(jìn)一步證實(shí)了該遺傳資源庫(kù)的可靠、科學(xué)。但離建立大規(guī)模基因樣本庫(kù)仍有一定距離，目前對(duì)維吾爾族抑郁癥的DNA樣本收集工作仍在繼續(xù)，爭(zhēng)取為今后維吾爾族抑郁癥研究提供一定規(guī)模的生物學(xué)資源。

參考文獻(xiàn)：

[1] Patten SB. Recall bias and major depression lifetime prevalence[J]. Soc Psychiatry Epidemiol, 2003,38(6):290-296.

[2] 張國(guó)芳, 候鋼. 五輕色胺與抑郁癥自殺的分子遺傳學(xué)[J]. 國(guó)外醫(yī)學(xué):精神病學(xué)分冊(cè),2003, 30(2): 92-94.

[3] 段冬梅, 圖婭, 陳利平, 等. 基因組學(xué)研究在抑郁癥發(fā)病機(jī)制及診斷中的應(yīng)用[J].中華中醫(yī)藥學(xué)刊,2009,27(5):944-948.

[4] Verhoeven KJ, Macel M, Wolfe LM, et, al. Population admixture, biological invasions and the balance between local adaptation and inbreeding depression[J]. Proc Biol Sci, 2011, 278(1702):2-8.

[5] 王棟. 抑郁癥相關(guān)基因與蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建[D].西安:第四軍醫(yī)大學(xué), 2005:4-7.

[6] 王棟,梁蜀忠,孫金立,等.抑郁癥相關(guān)基因數(shù)據(jù)庫(kù)的構(gòu)建[J].中國(guó)臨床康復(fù),2005,9(32):30-31.

[7] 梁黎.中國(guó)少數(shù)民族基因庫(kù)[N]. 中國(guó)民族, 2009(Z1).

[8] Beghi M, Rosenbaum JF, Cerri C, et al. Risk factors for fatal and nonfatal repetition of suicide attempts: a literature review[J]. Neuropsychiatr Dis Treat,2013,9(1):1725-1736.

[9] Li JJ, Berk MS, Lee SS. Differential susceptibility in longitudinal models of gene-environment interaction for adolescent depression[J]. Dev Psychopathol,2013, (4 Pt 1):991-1003.

[10] Walther DJ, Peter JU, Bashammakh S, et a1. Synthesis of serotonin by a second tryptophan hydroxylase isoform[J]. Science, 2003, 299(5603):76.

[11] Sugden D.Comparison of circadian expression of tryptophan hydroxylase isoform mRNAs in the rat pineal gland using real-time PCR[J]. J Neurochemistry，2003,86(5):1308-1311．

[12] Lazary J, Viczena V, Dome P, et al. Hopelessness, a potential endophenotpye for suicidal behavior, is influenced by TPH2 gene variants[J]. Pro Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,2012,36(1):155-160.

[13] Musil R, Zill P, Seemüller F, et al. Genetics of emergent suicidality durin-g antidepressive treatment--data from a naturalistic study on a large sample of inpatients with a major depressive episode[J]. Eur Neuropsychopharmacol, 2013,23(7): 663-674.

[14] 張玉琦, 徐文煒, 袁國(guó)楨, 等. TPH2 基因單核苷酸多態(tài)性與單相抑郁癥及其癥狀表型的關(guān)聯(lián)研究[J]. 現(xiàn)代預(yù)防醫(yī)學(xué), 2011, 38(10): 1904-1907.

[15] Zhang Y, Zhang C, Yuan G,et al. Effect of tryptophan hydroxylase-2 rs7305115 SNP on suicide attempts risk in major depression[J]. Behav Brain Funct,2010,6:49.

[16] 郝偉.精神病學(xué)[M].北京:人民衛(wèi)生出版社, 2008:104.