全氟辛烷磺酸對雄性小鼠睪丸細(xì)胞凋亡及相關(guān)基因表達(dá)的影響

張小梅，丁 寧，劉 超，趙彩虹，裘紅梅

（大連大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

全氟有機(jī)化合物，是一種持久性有機(jī)污染物，尤其是其代表性化合物全氟辛烷磺酸（PFOS）和全氟辛酸（PFOA），具有難溶性、生物蓄積性和沿食物鏈向高位營養(yǎng)級的生物體內(nèi)富集的作用，已被列為持久性有機(jī)環(huán)境污染物新成員，其所造成的全球性生態(tài)系統(tǒng)污染已成事實(shí)。毒理學(xué)研究資料證明[1-7]，它們對實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及人類都造成的不只是生殖毒性，還能引起肝臟毒性、神經(jīng)毒性、心血管毒性、胚胎發(fā)育與遺傳毒性、致癌性、免疫毒性等。

我們實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，PFOS 通過飲水染毒35 天，結(jié)果高劑量組小鼠精子活動(dòng)率顯著下降，5.0和10.0 mg/kg 組小鼠精子畸形率與陰性對照組比較顯著增加。但對PFOS 的具體作用機(jī)制尚不清楚，本實(shí)驗(yàn)通過用不同濃度的PFOS 飲水染毒，觀察不同染毒劑量組雄性小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡以及相關(guān)基因變化，來探討全氟辛烷磺酸對雄性小鼠的生殖毒性作用的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型建立

健康昆明種雄性小鼠，體重18~22 g，由大連醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。飼養(yǎng)一周后，隨機(jī)分為5組，每組8 只。飲水染毒，劑量分別為0 mg/kg、1.25 mg/kg、2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、10.0 mg/kg，自由攝食，飲水。染毒35 天后摘眼球采血，頸椎脫臼處死大鼠，分離雙側(cè)睪丸、附睪等臟器，檢測各指標(biāo)。

1.2 流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞

1.2.1 睪丸單細(xì)胞懸液制備

用眼科剪將睪丸組織剪成勻漿狀。加入0.01 mol/L PBS 液10 mL，輕輕吹打均勻。用吸管吸取組織勻漿，用200 目篩網(wǎng)過濾至試管內(nèi)。離心沉淀（1500 r/min，3~5 min），再用PBS 液漂洗3 次；每次漂洗后800 r/min 離心5 min，除去細(xì)胞碎片。用250 目尼龍網(wǎng)過濾，去除聚集的細(xì)胞團(tuán)塊。收集的細(xì)胞懸液做細(xì)胞計(jì)數(shù)，總量應(yīng)不少于1×106個(gè)/mL。加少量PBS液用吸管反復(fù)吹打，然后用300 目尼龍網(wǎng)過濾，1000 r/min 離心5 min，棄去上清液，用PBS 漂洗2 次，加入冰冷的75%乙醇溶液固定（加入預(yù)冷乙醇時(shí)應(yīng)不斷震蕩避免細(xì)胞團(tuán)結(jié)成塊），4℃冰箱過夜備用。

1.2.2 流式細(xì)胞儀檢測

取上述固定的細(xì)胞懸液，離心棄乙醇，用PBS漂洗2 次，2000 r/min 離心5 min，收集(1~5)×105細(xì)胞。加入500 μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞。加入5 μL Annexin V-FITC 混勻后，加入5 μL Propidium Iodide 混勻，室溫避光反應(yīng)5~10 min。用流式細(xì)胞儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，用FACSDiva Version 6.2.1軟件處理得出結(jié)果圖。

1.3 RT-PCR 檢測Bax 和Bcl2 基因表達(dá)

（1）睪丸組織總RNA 的提?。═rizol 法）：Trizol劑盒由大連寶生物工程有限公司提供，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。

（2）RT-PCR 反應(yīng)：按照RT-PCR 試劑盒（大連寶生物工程有限公司）操作方法合成cDNA，參照文獻(xiàn)[8]設(shè)計(jì)合成Bax，Bcl2，F(xiàn)AS，F(xiàn)al 四對特異性引物，β-actin 作為內(nèi)參，均由大連寶生物工程有限公司合成（引物信息見表1）。PCR 反應(yīng)體系為20 μl，1 μL cDNA 模板，3.0 μL 10×PCR-buffer，1.0 μL 10m MdNTPs，1.0 μL 引物(50 ng/μL)，0.5 μL Ampli-Taq聚合酶，13.5 μL ddH2O。PCR 擴(kuò)增條件如下：先95℃預(yù)變性2 s，然后95℃5 s、55℃（Fas 基因?yàn)?0℃）15 s、72℃10 s，循環(huán)40 次，最后72℃延伸5 min。擴(kuò)增后分別產(chǎn)生101 bp、410 bp、143 bp 、217 bp和110 bp 大小的FAS、Fal、Bax、Bcl2 和β-actin 的DNA 片段。Bax，Bcl-2，F(xiàn)as，F(xiàn)AL 的PCR 反應(yīng)結(jié)束后,取6 μL 反應(yīng)液，在含0.5 μg/mL 溴化乙啶的1.5%瓊脂糖凝膠中電泳，凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果，分析目的基因擴(kuò)增條帶亮度，讀取亮度值，為進(jìn)行半定量分析，以β-actin 的亮度值作為參照，得出各個(gè)PCR 產(chǎn)物的相對亮度值。

表1 PCR 擴(kuò)增引物序列、退火溫度及長度

1.4 數(shù)據(jù)分析

2 結(jié)果

2.1 PFOS 對小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡早期位于細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserin，PS)遷移至細(xì)胞外側(cè)，流式細(xì)胞儀通過Annexin V-FITC 標(biāo)志暴露于細(xì)胞膜上的PS 結(jié)合PI 進(jìn)入損傷細(xì)胞膜標(biāo)記降解DNA 分析凋亡與壞死細(xì)胞。在檢測時(shí)有4 個(gè)亞群包括機(jī)械性損傷細(xì)胞(Q1：Annexin-/PI+)、凋亡晚期細(xì)胞(Q2:Annexin+/PI+)、正常細(xì)胞(Q:3：Annexin-/PI-)和凋亡早期細(xì)胞(Q4：Annexin+/PI-)被區(qū)分(如圖1）。PFOS 飲水染毒，流式細(xì)胞儀檢測不同染毒劑量組雄性小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡情況（圖所1 示）?？煽闯?，細(xì)胞凋亡率隨著PFOS的濃度增加而增加，各劑量組與對照組比較均有顯著性差異（p<0.05）。5.0、10.0 mg/kg PFOS 組小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡明顯增多（p<0.01）。

圖1 PFOS 對小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的影響 （與對照組比較，*p<0.05，**p<0.01）

圖2 PFOS 對小鼠睪丸組織中Bax、Bcl-2mRNA 的表達(dá)影響（與對照組比較，*p<0.05,**p<0.01）

2.2 PFOS 對小鼠睪丸細(xì)胞Bax 和Bcl-2 表達(dá)的影響

Bcl-2 家族成員Bax、Bcl-2 在線粒體損傷引起的凋亡中起重要的調(diào)節(jié)作用。采用RT-PCR 檢測Bax、Bcl-2 基因mRNA 的表達(dá)量，電泳條帶如圖2 所示。從圖2 可看出，10 mg/kg/d PFOS 實(shí)驗(yàn)組小鼠睪丸組織中Bax 基因表達(dá)與對照組比較顯著上升（p<0.05）,其他劑量組變化與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p>0.05）。隨著染毒劑量的增加，Bcl-2 基因表達(dá)下降，5.0、10.0 mg/kg/d PFOS 實(shí)驗(yàn)組與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（分別為p<0.05，p<0.01）。

3 討論

目前，人類對PFOA 和PFOS 等全氟有機(jī)化合物的環(huán)境危害、生物多樣性及人體健康損害的調(diào)查研究越來越多，尤其是對哺乳動(dòng)物的PFOS 毒性進(jìn)行了較多的實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)PFOS 對小鼠、大鼠、家兔和猴子等動(dòng)物具有一定的生殖發(fā)育毒性[4-7]。因此在現(xiàn)有資料的基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)用PFOS 染毒小鼠，通過觀察小鼠體重、流式細(xì)胞儀檢測睪丸組織細(xì)胞凋亡和RT-PCR 檢測Bax、Bcl-2 基因表達(dá)變化等指標(biāo)，了解PFOS 對雄性小鼠的生殖毒性作用的機(jī)制。

凋亡(apoptosis)是一種特殊的受遺傳控制的細(xì)胞死亡過程,它在組織的發(fā)育和維持過程中扮演著重要角色[9]。本實(shí)驗(yàn)采用雙染色經(jīng)流式細(xì)胞儀分析后，各染毒劑量組小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡與對照組相比都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（p<0.05）。在5.0、10.0 mg/kg 劑量組中，細(xì)胞凋亡總數(shù)顯著增加（p<0.01）。在高劑量組中，處于凋亡早期的細(xì)胞數(shù)與對照組比較有顯著性的變化（p<0.01），提示在本實(shí)驗(yàn)劑量水平下，PFOS 對小鼠睪丸的毒性作用較敏感。細(xì)胞凋亡是受Bcl-2 蛋白家族、調(diào)節(jié)蛋白Apaf-1(凋亡激酶激活因子1)、Caspase 蛋白家族等調(diào)控的。Bcl-2 家族包括兩類成員，一類如bcl-2，bcl-xl 等是抑制凋亡發(fā)生的，另一類如bax、bak、bcl-xs、bad、bid、bik 等是促進(jìn)凋亡發(fā)生的。bcl-2 位于線粒體外膜，可以與bax 結(jié)合形成bcl-2/bax 異二聚體，阻止bax 插入線粒體外膜，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡的損害[10]。bcl-2 和bax 在組織細(xì)胞中常協(xié)同表達(dá)，bcl-2/bax 增大時(shí)促進(jìn)細(xì)胞存活，反之則導(dǎo)致細(xì)胞死亡[11]。近年來的研究提示，Bcl-2 和Bax這兩種基因均參與了睪丸細(xì)胞凋亡的過程[12]。但有報(bào)道睪丸熱暴露后，Bax 從細(xì)胞質(zhì)到核周重新分布進(jìn)而啟動(dòng)凋亡，并且熱暴露后6 h Bcl-2 的表達(dá)明顯升高[13]。還有研究表明隨著雄激素的逐漸戒斷，大鼠睪丸中Bax 和Bcl-2 的表達(dá)上調(diào)[14]；體外研究還顯示，Bcl-2 是凋亡的主要執(zhí)行者(例如caspase-3)的底物，在凋亡過程中，caspase-3 可以剪切Bcl-2 的C2 末端，進(jìn)而消除其抗凋亡活性。而且，Bcl-2 的剪切產(chǎn)物有與Bax 相似的前凋亡活性，通過激活下游caspases片斷而觸發(fā)細(xì)胞死亡[15]。這些研究顯示在雄性睪丸細(xì)胞凋亡中Bcl-2 可能也具有促凋亡作用。

研究結(jié)果顯示，PFOS 染毒處理的小鼠，Bax 的表達(dá)水平在最高劑量組（10.0 mg/kg）中與對照組比較有顯著性增高，但其他各組與對照組的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bcl-2 表達(dá)水平雖然是隨著染毒劑量的增加而下降，也只有在5.0、10.0 mg/kg 實(shí)驗(yàn)組中才表現(xiàn)出與對照組比較有顯著性差異，較低的劑量組與對照組在統(tǒng)計(jì)學(xué)上無差別。說明Bax、Bcl-2 可能參與PFOS 誘導(dǎo)小鼠睪丸組織細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程。

[1] Lau C, Thibodeaux JR, Hanson RG, et al. Effects of perfluo- rooctanoic acid exposure during pregnancy in the mouse [J]. Toxiool Sci, 2006, 90(2): 510-518.

[2] 羽冰, 于麒辟, 金一和, 等. 全氟辛烷磺酸對大鼠海馬神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的影響[J]. 毒理學(xué)雜志, 2005, 19(3): 225-226.

[3] 張璐. PFOS 對成年鵪鶉生殖系統(tǒng)毒性作用的實(shí)驗(yàn)研究[D].生態(tài)毒理學(xué)報(bào), 2008, 13(2): 14-17.

[4] 范軼歐, 金一和, 麻懿馨, 等. 全氟辛烷磺酸對雄性大鼠生精功能的影響[J]. 衛(wèi)生研究, 2005, 34(1): 37-39.

[5] 范軼歐, 金一和, 麻懿馨, 等. 全氟辛烷磺酸染毒小鼠骨髓細(xì)胞微核率和精子質(zhì)量的變化[J]. 衛(wèi)生毒理學(xué)雜志, 2004, 18(4): 245-247.

[6] Thibodeaux JR, Hanson RG, Rogers JM, et al. Exposure to perfluorooctane sulfonate during pregnancy in labratory rat and mouse [J]. I:Maternal and prenatal evaluations. Toxicol Sci, 2003, 74(2): 369-381.

[7] Luebker DJ, Case MT, York RG, et al. Two-generation repro- ducetion and crossfoster studies of perfluorooctanesulfonate (PFOS)in rats [J]. Toxicology, 2005, 215(1-2): 126-148．

[8] Feng Y, Shi Z, Fang X. Perfluorononanoic acid induces apoptosis involving the Fas death receptor signaling pathway in rat testis [J]. Toxicology Letters, 2009, 190(02): 102-106.

[9] Lic, Wang X, Vais H, et al. Apoptosis regulation by Bcl- x(L) modulation of mammalian inositol 1,4,5-trisphosphate recep for channel isoform gating [J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2007, 104(30): 12565-12570.

[10] Shimizu S, Narita M, Tsujimoto Y. Bcl-2 family proteins regulate the release of apoptogenic cytochromec by the mitochondrial channel VDAC[J]. Nature 1999, 399: 483-487.

[11] Schabitz WR, Sommer C, Zoder W, et al. Intraveno-us brain-derived neurotrophic factor reduces infarct size and counter regulates Bax and Bcl-2 expression after temporary focal cerebral ischemia [J]. Stroke, 2000, 31(9): 2212-2127.

[12] 楊筱珍, 陳耀星, 王子旭, 等. 基因?qū)π坌陨臣?xì)胞凋亡調(diào)控的研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī), 2004, 31(1): 24-27.

[13] Yamamoto CM, Sinha H IKIM AP, Huynh PN, et al. Redistribution of Bax is an early step in an apoptotic pathway leading to germ cell death in rats, triggered bymild testicular hyperthermia [J]. Biol Reprod, 2000, 63(6): 1683-1690.

[14] WOOLVER IDGE I, DE BOER2BROUWERM, TAYLORMF, et al. Apoptosis in the rat spermatogenic epithelium following androgen withdrawal, changes in apoptosisrela- ted genes [J]. Biol Reprod, 1999, 60(2): 461-470.

[15] CHENG EHY, KIRSCH DG, CLEM RJ, et al. Conversion of Bcl-2 to a Bax-like death effector by caspases [J]. Science, 1997, 278(5345): 1966-1968.