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    地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)模擬與序列分析

    2014-07-05 18:16:47余磊韓雅莉
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年5期
    關(guān)鍵詞:纖溶酶精氨酸賴(lài)氨酸

    余磊 韓雅莉

    摘要:為了研究地鱉蟲(chóng)(Eupolyphage sinensis Walker)纖溶酶的溶栓機(jī)理,根據(jù)地鱉蟲(chóng)纖溶酶成熟肽編碼序列,利用生物信息學(xué)方法,對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶進(jìn)行了結(jié)構(gòu)分析,用Biosun軟件的同源模建技術(shù),模擬了其三維結(jié)構(gòu)。利用GOLDKEY軟件,對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶的氨基酸序列進(jìn)行了分析,討論了其等電點(diǎn)、親水性、柔性與催化活性之間的關(guān)系。結(jié)果表明,地鱉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心是組氨酸、絲氨酸和天冬氨酸3個(gè)氨基酸殘基,位于球蛋白中心凹穴處,底物結(jié)合部位是絲氨酸、天冬氨酸和甘氨酸,該類(lèi)酶水解纖維蛋白的機(jī)理是催化精氨酸-賴(lài)氨酸之間的肽鍵水解。

    關(guān)鍵詞:地鱉蟲(chóng)(Eupolyphage sinensis Walker);纖溶酶;三維結(jié)構(gòu);序列

    中圖分類(lèi)號(hào):Q55;R857.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2014)05-1185-04

    地鱉蟲(chóng) (Eupolyphage sinensis Walker)又名土元、土鱉,屬節(jié)肢動(dòng)物門(mén)昆蟲(chóng)綱蜚蠊目鱉蠊科昆蟲(chóng),為《中華人民共和國(guó)藥典》記載的正品藥材,是傳統(tǒng)的活血化瘀類(lèi)動(dòng)物藥,其藥用功效主要為逐瘀、破積、通絡(luò)等。廣東工業(yè)大學(xué)纖溶先導(dǎo)藥物課題組在進(jìn)行地鱉蟲(chóng)纖溶活性成分研究時(shí),從該蟲(chóng)體內(nèi)分離純化得到了地鱉蟲(chóng)纖溶酶[1,2],對(duì)此類(lèi)纖溶酶基因 DNA序列進(jìn)行了分析研究,克隆得到其中一種地鱉蟲(chóng)纖溶酶成熟肽cDNA序列(GenBank登錄號(hào):DQ396618),并將其用赤畢酵母表達(dá)[3]。為了深入探討地鱉蟲(chóng)纖溶酶的纖溶作用機(jī)制,確定其活性中心的位置,本研究利用生物信息學(xué)方法,對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶序列進(jìn)行多方位分析,并建立了地鱉蟲(chóng)纖溶酶可靠的三維結(jié)構(gòu)模型,揭示了其纖溶機(jī)理,為今后進(jìn)一步研究提供參考。

    1 理論與方法

    要想了解蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu),只有將蛋白質(zhì)溶液結(jié)晶,利用X射線衍射分析蛋白質(zhì)的單晶,通過(guò)衍射數(shù)據(jù),得到蛋白質(zhì)的立體結(jié)構(gòu)。但是蛋白質(zhì)結(jié)晶條件苛刻,而且不是所有的蛋白質(zhì)都能變成單晶。但是利用現(xiàn)代計(jì)算機(jī)技術(shù),可以對(duì)已知氨基酸序列的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)做出預(yù)測(cè),同時(shí)還能對(duì)蛋白質(zhì)序列中的每個(gè)氨基酸逐個(gè)分析,即比較蛋白質(zhì)模建,又稱(chēng)為同源模建。該方法是目前應(yīng)用最廣的蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)方法[4-6]。本研究將地鱉蟲(chóng)纖溶酶的蛋白質(zhì)序列提交到NCBI的自動(dòng)比較蛋白質(zhì)模建服務(wù)器Blast上,通過(guò)程序自動(dòng)確定了地鱉蟲(chóng)纖溶酶序列活性中心與底物結(jié)合的部位(圖1),Biosun軟件模擬生成了地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)。利用GOLDKEY軟件,對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶全序列的等電點(diǎn)、親水性、柔性進(jìn)行分析,利用無(wú)模型比對(duì)時(shí)活性中心氨基酸殘基的性質(zhì),進(jìn)一步闡明地鱉蟲(chóng)纖溶酶的纖溶機(jī)理。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 三維結(jié)構(gòu)模擬與評(píng)估

    將地鱉蟲(chóng)纖溶酶蛋白質(zhì)序列導(dǎo)入Biosun軟件,軟件自動(dòng)選取蛋白質(zhì)Tryp_SPc[cd00190]為模板,模擬目的蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu),結(jié)果見(jiàn)圖2。其中a、b、c 3個(gè)球狀模型,分別對(duì)應(yīng)S178、H41、D85 3個(gè)氨基酸殘基側(cè)鏈(羥基、咪唑基、羧基),與胰蛋白酶催化三聯(lián)體結(jié)構(gòu)一致[7,8]。d、e、f 3個(gè)肽鍵鏈狀模型,分別對(duì)應(yīng)于地鱉蟲(chóng)纖溶酶的底物結(jié)合部位D172、S193、G195。由三維結(jié)構(gòu)可以看出,底物結(jié)合部位和酶催化活性中心都沒(méi)有α螺旋和β折疊(α螺旋為柱狀區(qū),β折疊為板狀區(qū)),該區(qū)域容易發(fā)生形變,在催化過(guò)程中跟底物結(jié)合時(shí)產(chǎn)生誘導(dǎo)契合,符合酶催化理論。酶活中心處于這個(gè)蛋白質(zhì)中心的凹穴處,與通常對(duì)纖溶酶活性中心的認(rèn)識(shí)一致[9,10]。筆者在前期試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),該酶受絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF的抑制,推測(cè)其為絲氨酸蛋白酶[1,2],此推測(cè)與生物信息學(xué)方法找到的活性中心S178結(jié)論一致。

    對(duì)模板蛋白質(zhì)和目的蛋白質(zhì)進(jìn)行同源性比對(duì)(圖3),Blast軟件給出89.9的評(píng)分,說(shuō)明模板蛋白和地鱉蟲(chóng)纖溶酶的同源性比較高,二者序列覆蓋率達(dá)到99%。隨機(jī)匹配的可能性為2×10-19,這么小的隨機(jī)匹配可能性,說(shuō)明2個(gè)蛋白質(zhì)相同的序列部分,不是偶然出現(xiàn)的,是具有同源性的。二者最大序列的相似度達(dá)到43%。以此模板蛋白質(zhì)進(jìn)行同源模建,結(jié)果可信。

    2.2 GOLDKEY軟件的序列分析

    在地鱉蟲(chóng)纖溶酶三維結(jié)構(gòu)分析中,采用的是同源模建的方法。在預(yù)測(cè)的時(shí)候,其他蛋白質(zhì)與目標(biāo)預(yù)測(cè)物的差異會(huì)導(dǎo)致一定程度的偏差。采用GOLDKEY軟件對(duì)序列的每個(gè)殘基逐個(gè)計(jì)算其特性,雖然無(wú)法得到三維結(jié)構(gòu),但是其數(shù)據(jù)可靠性更好,更能反映目標(biāo)蛋白質(zhì)的特性。圖4為利用GOLDKEY軟件對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸序列的等電點(diǎn)進(jìn)行模擬。由圖4可知,該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)為9.67。在通常生理環(huán)境下,該蛋白質(zhì)帶正電。纖維蛋白通常帶負(fù)電荷,所以地鱉蟲(chóng)纖溶酶很容易靠近纖維蛋白質(zhì),與之結(jié)合,表明該酶對(duì)血栓有一定的靶向作用。

    利用GOLDKEY軟件對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸序列進(jìn)行親水性模擬(圖5)。由圖5可知,地鱉蟲(chóng)纖溶酶序列中每個(gè)氨基酸的親水值越大,親水性越強(qiáng)。其中H41為0.5,D85、S178、D172、S193、G195均為0。H41、D85、S178為活性部位,D172、S193、G195為底物結(jié)合部位,其親水值均比較低。在序列中,這6個(gè)殘基的親水值都處于局部最低點(diǎn)(相鄰殘基的親水值均較高)。對(duì)于水溶性球形蛋白質(zhì),親水值較低的氨基酸趨向于蛋白質(zhì)的內(nèi)部,親水值較高的氨基酸趨向于蛋白質(zhì)的外部,從一級(jí)結(jié)構(gòu)上的親水性推測(cè),H41、D85、S178、D172、S193、G195這6個(gè)氨基酸都位于蛋白質(zhì)的內(nèi)部,與三級(jí)結(jié)構(gòu)相符。

    利用GOLDKEY軟件對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶氨基酸序列進(jìn)行柔性模擬(圖6)。由圖6可知,地鱉蟲(chóng)纖溶酶序列中每個(gè)氨基酸的柔性值,其中H41=0.91,D85=0.93,S178=1.12, D172=1.03,S193=0.93,G195=0.93。H41、D85、S178為活性部位,D172、S193、G195為底物結(jié)合部位,其柔性值均比較大,符合酶促反應(yīng)動(dòng)力學(xué)誘導(dǎo)契合理論。在結(jié)合底物時(shí),活性中心的結(jié)構(gòu)和底物的結(jié)構(gòu)都發(fā)生了一定的形變(柔性才能形變),使其在空間結(jié)構(gòu)上互補(bǔ),從而能很好的契合。但是從全序列柔性值來(lái)看,催化中心和底物結(jié)合部位的柔性并非最大,而且催化中心和底物結(jié)合部位的柔性還處于局部最低點(diǎn),都在峰谷處。這正好驗(yàn)證了酶結(jié)構(gòu)的相對(duì)穩(wěn)定性。酶具有高效性和專(zhuān)一性的催化特點(diǎn),決定這些特點(diǎn)的關(guān)鍵不僅僅是因?yàn)槊富钚灾行牡年P(guān)鍵基團(tuán),也與酶的特殊空間結(jié)構(gòu)有著不可分割的關(guān)系。所以酶關(guān)鍵部位的空間結(jié)構(gòu)也不能有太大的柔性,更不能隨意變形。

    2.3 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

    體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴(lài)氨酸之間的肽鍵,使之?dāng)嗔训倪^(guò)程[11]。從圖7中可以看到,精氨酸和賴(lài)氨酸側(cè)鏈都有一個(gè)較長(zhǎng)的烷烴部分,疏水性較強(qiáng),能插入酶活中心底物結(jié)合處的輸水區(qū),而且長(zhǎng)鏈烷烴的一端含有1個(gè)氨基,能與底物結(jié)合部位D172的羧基結(jié)合,使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)幾乎相同(約為5~6個(gè)σ C-C單鍵長(zhǎng)度,7.7×10-10 m),被纖溶酶底物結(jié)合位捕獲后,其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處(從三維結(jié)構(gòu)上可知,D85與 D172相距約5個(gè)肽鍵長(zhǎng)度6.6×10-10 m,大致與精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度相同),這時(shí)酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈斷裂,而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基,在親核親電雙重作用的協(xié)同效應(yīng)下[12],能協(xié)助肽鍵斷裂時(shí)的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程,從而完成纖維蛋白的水解。

    3 小結(jié)

    本研究對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬,并對(duì)其全序列進(jìn)行分析。地鱉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178;底物結(jié)合部位為D172、S193、G195。其三維結(jié)構(gòu)可以與序列分析相互印證,該纖溶酶屬于水溶性球蛋白,其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測(cè)其催化纖維蛋白水解的機(jī)理是作于與精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈,使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

    參考文獻(xiàn):

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    2.3 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

    體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴(lài)氨酸之間的肽鍵,使之?dāng)嗔训倪^(guò)程[11]。從圖7中可以看到,精氨酸和賴(lài)氨酸側(cè)鏈都有一個(gè)較長(zhǎng)的烷烴部分,疏水性較強(qiáng),能插入酶活中心底物結(jié)合處的輸水區(qū),而且長(zhǎng)鏈烷烴的一端含有1個(gè)氨基,能與底物結(jié)合部位D172的羧基結(jié)合,使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)幾乎相同(約為5~6個(gè)σ C-C單鍵長(zhǎng)度,7.7×10-10 m),被纖溶酶底物結(jié)合位捕獲后,其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處(從三維結(jié)構(gòu)上可知,D85與 D172相距約5個(gè)肽鍵長(zhǎng)度6.6×10-10 m,大致與精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度相同),這時(shí)酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈斷裂,而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基,在親核親電雙重作用的協(xié)同效應(yīng)下[12],能協(xié)助肽鍵斷裂時(shí)的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程,從而完成纖維蛋白的水解。

    3 小結(jié)

    本研究對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬,并對(duì)其全序列進(jìn)行分析。地鱉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178;底物結(jié)合部位為D172、S193、G195。其三維結(jié)構(gòu)可以與序列分析相互印證,該纖溶酶屬于水溶性球蛋白,其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測(cè)其催化纖維蛋白水解的機(jī)理是作于與精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈,使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

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    2.3 纖維蛋白水解部位結(jié)構(gòu)分析

    體內(nèi)纖維蛋白的溶解是纖溶酶作用與精氨酸-賴(lài)氨酸之間的肽鍵,使之?dāng)嗔训倪^(guò)程[11]。從圖7中可以看到,精氨酸和賴(lài)氨酸側(cè)鏈都有一個(gè)較長(zhǎng)的烷烴部分,疏水性較強(qiáng),能插入酶活中心底物結(jié)合處的輸水區(qū),而且長(zhǎng)鏈烷烴的一端含有1個(gè)氨基,能與底物結(jié)合部位D172的羧基結(jié)合,使得纖維蛋白此處的肽鏈被纖溶酶捕獲。精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度和結(jié)構(gòu)幾乎相同(約為5~6個(gè)σ C-C單鍵長(zhǎng)度,7.7×10-10 m),被纖溶酶底物結(jié)合位捕獲后,其肽鏈的位置正好位于酶活中心D85處(從三維結(jié)構(gòu)上可知,D85與 D172相距約5個(gè)肽鍵長(zhǎng)度6.6×10-10 m,大致與精氨酸-賴(lài)氨酸側(cè)鏈長(zhǎng)度相同),這時(shí)酶活中心的天冬氨酸羧基酸性催化精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈斷裂,而H41、S178上分別帶有親核性的咪唑基與親電性的羥基,在親核親電雙重作用的協(xié)同效應(yīng)下[12],能協(xié)助肽鍵斷裂時(shí)的電子轉(zhuǎn)移過(guò)程,從而完成纖維蛋白的水解。

    3 小結(jié)

    本研究對(duì)地鱉蟲(chóng)纖溶酶的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行了模擬,并對(duì)其全序列進(jìn)行分析。地鱉蟲(chóng)纖溶酶的活性中心為H41、D85、S178;底物結(jié)合部位為D172、S193、G195。其三維結(jié)構(gòu)可以與序列分析相互印證,該纖溶酶屬于水溶性球蛋白,其纖溶活性中心位于球蛋白表面凹穴處。推測(cè)其催化纖維蛋白水解的機(jī)理是作于與精氨酸-賴(lài)氨酸的肽鏈,使不溶性纖維蛋白水解成可溶性蛋白。

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