誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞研究進(jìn)展

2014-07-05 10:23程騰賀小英馬利兵

湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年5期

程騰　賀小英　馬利兵

摘要：通過(guò)轉(zhuǎn)染特定的一個(gè)或多個(gè)基因?qū)⒁逊只捏w細(xì)胞誘導(dǎo)成為多潛能干細(xì)胞，這種干細(xì)胞稱為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（Induced pluripotent stem cells，iPS cells）。近年來(lái)關(guān)于iPS細(xì)胞的研究取得了舉世矚目的成就，多種已分化的體細(xì)胞都可以誘導(dǎo)成為iPS細(xì)胞，而且可以進(jìn)一步將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成具有特定功能的細(xì)胞，稱為誘導(dǎo)性細(xì)胞。這些研究極大地促進(jìn)了細(xì)胞生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)和發(fā)育生物學(xué)的研究，并且為人類再生醫(yī)學(xué)和特異的細(xì)胞治療帶來(lái)了更美好的希望。對(duì)iPS細(xì)胞和誘導(dǎo)性細(xì)胞的最新研究狀況進(jìn)行了綜述。

關(guān)鍵詞：誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）；誘導(dǎo)性細(xì)胞；細(xì)胞治療

中圖分類號(hào)：Q813 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）05-0993-05

將已分化的體細(xì)胞重編程為類胚胎干細(xì)胞樣細(xì)胞的技術(shù)完成于2006年。Takahashi等[1]通過(guò)外源表達(dá)一組選擇性的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)入成體小鼠成纖維細(xì)胞，最終確定最少有4種轉(zhuǎn)錄基因組合——Oct4（也稱Pou5f1、Oct3/4）、Sox2、Klf4和c-Myc可將成纖維細(xì)胞重編程為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞）。從此iPS細(xì)胞的研究開始成為干細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱門，并且iPS細(xì)胞的來(lái)源也越來(lái)越廣泛。利用iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)將終末分化細(xì)胞先誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，再進(jìn)一步誘導(dǎo)成具有特定功能的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞，心肌細(xì)胞等，稱為誘導(dǎo)性細(xì)胞。時(shí)至今日研究者已經(jīng)開始嘗將iPS細(xì)胞應(yīng)用于臨床治療。

1 誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞的研究進(jìn)展

從iPS細(xì)胞誕生之日起，iPS細(xì)胞的研究就成為細(xì)胞研究領(lǐng)域的熱門。起初，研究者誘導(dǎo)iPS細(xì)胞時(shí)，iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率極低，而且他們用的是4個(gè)轉(zhuǎn)錄因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc，其中c-Myc還具有一定的致癌作用。后來(lái)經(jīng)過(guò)科學(xué)家們的不斷嘗試，開始用小分子化合物、miRNA、mRNA或蛋白質(zhì)等導(dǎo)入細(xì)胞來(lái)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞[1-6]，轉(zhuǎn)錄因子的個(gè)數(shù)也從4個(gè)減少到1個(gè)，甚至只用小分子化合物等物質(zhì)來(lái)誘導(dǎo)iPS細(xì)胞[7-9]。近年來(lái)iPS細(xì)胞研究取得了突破性進(jìn)展，如建立了人類疾病特異的iPS細(xì)胞，借助鋅指核酸酶和轉(zhuǎn)座子等介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)高效制備了無(wú)病毒的iPS細(xì)胞[10-13]。

從2007年Takahashi 等[2]和Yu等[3]先后將人的體細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞開始，多種人類成體干細(xì)胞被重編程為誘導(dǎo)性多潛能干細(xì)胞，但是直到2013年Trokovic等[14]才將人類骨骼成肌細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞，他們通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄病毒載體（圖1）或仙臺(tái)病毒載體介導(dǎo)目的基因的異位表達(dá)，在無(wú)飼養(yǎng)層且含有適宜的培養(yǎng)基條件下，可以使人類骨骼成肌細(xì)胞達(dá)到和人類成纖維細(xì)胞一樣的重編程效率，再加入組蛋白脫乙酰酶抑制劑丙戊酸鈉（VPA）、丁酸鈉（NaB）和ALK4/5/7抑制劑SB431542（SB），能明顯提高人類骨骼成肌細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率。

到目前為止，除了人之外，小鼠、大鼠、猴子、綿羊、豬的iPS細(xì)胞系均已建立[15-19]。

iPS細(xì)胞研究的意義重大，它不僅為多潛能干細(xì)胞[20]的獲取提供了新的途徑，而且避免了傳統(tǒng)胚胎干細(xì)胞研究中存在的倫理問題，同時(shí)還解決了免疫排斥反應(yīng)問題，為細(xì)胞的體外培養(yǎng)和誘導(dǎo)提供了平臺(tái)（圖2），使人們?cè)诩?xì)胞和分子水平上研究人類多種疾病及其發(fā)病機(jī)理成為可能（圖3），也為相應(yīng)藥物的研發(fā)提供了便利。正是由于iPS細(xì)胞技術(shù)使得整個(gè)細(xì)胞生物學(xué)研究發(fā)生了質(zhì)的飛躍，所以Yamanaka榮獲了2012年的諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)。當(dāng)然，目前iPS細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制還不是十分明確，還有待深入了解，iPS細(xì)胞的誘導(dǎo)效率仍然很低，整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程相對(duì)繁瑣，費(fèi)用比較昂貴，達(dá)到商業(yè)化、大眾化應(yīng)用的地步還有些遙遠(yuǎn)，這一切都有待進(jìn)一步研究和開發(fā)。

2 誘導(dǎo)性細(xì)胞的研究進(jìn)展

利用iPS細(xì)胞誘導(dǎo)技術(shù)，通過(guò)導(dǎo)入特定的轉(zhuǎn)錄因子組合，再加入一些小分子化合物等物質(zhì)，將終末分化細(xì)胞先誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，再進(jìn)一步誘導(dǎo)成具有特定功能的細(xì)胞，如神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞等，稱為誘導(dǎo)性細(xì)胞或誘導(dǎo)性功能細(xì)胞。到目前為止，已經(jīng)在多種具有重要功能的細(xì)胞上誘導(dǎo)成功[21-23]。

2.1 誘導(dǎo)性造血和血管祖細(xì)胞

Park等[21]在改進(jìn)的無(wú)飼養(yǎng)層的內(nèi)皮培養(yǎng)條件下，利用了一組重組生長(zhǎng)因子[骨形態(tài)發(fā)生蛋白4（BMP4）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）和纖維母細(xì)胞生長(zhǎng)因子2（FGF2）]的最適組合，然后在成分明確的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基（EGM-2）中附著低密度培養(yǎng)，用人類胚胎干細(xì)胞和人類誘導(dǎo)多潛能干細(xì)胞培育出大量的CD34+CD45+造血祖細(xì)胞（表1）。這些造血祖細(xì)胞出現(xiàn)在附著于內(nèi)皮或基質(zhì)的細(xì)胞層周圍，從某種意義上來(lái)說(shuō)，這種方式與體內(nèi)胚胎生血內(nèi)皮的造血方式類似。雖然之前已經(jīng)證實(shí)由成纖維細(xì)胞衍生而來(lái)的hiPSC細(xì)胞系并不具備有效分化為造血內(nèi)皮的能力，但是這個(gè)培養(yǎng)體系能夠使hiPSC具有和hESC一樣分化為造血內(nèi)皮的能力。這個(gè)有效的分化體系可用于直接延時(shí)攝像和造血發(fā)生過(guò)程的時(shí)間進(jìn)程研究等。

2.2 誘導(dǎo)性神經(jīng)細(xì)胞

Kuo等[22]在由海藻酸和多聚γ-谷氨酸（γ-PGA）以及表面神經(jīng)生長(zhǎng)因子構(gòu)成的水凝膠中將iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成神經(jīng)元。這種由海藻酸和多聚γ-谷氨酸（γ-PGA）以及表面神經(jīng)生長(zhǎng)因子構(gòu)成的水凝膠在整個(gè)誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，而孔隙結(jié)構(gòu)、孔隙度和溶脹比也有一定的影響。在這種水凝膠中，iPS細(xì)胞分化的形態(tài)學(xué)圖像（圖4）展示出神經(jīng)元的特點(diǎn)。在誘導(dǎo)iPS細(xì)胞向神經(jīng)元分化的過(guò)程中，表面神經(jīng)生長(zhǎng)因子可以增強(qiáng)β Ⅲ微管蛋白的表達(dá)強(qiáng)度而抑制SSEA-1的表達(dá)強(qiáng)度。iPS細(xì)胞在這種水凝膠中的分化可以通過(guò)SSEA-1和β Ⅲ微管蛋白的表面抗原免疫化學(xué)染色和掃描電子顯微鏡來(lái)觀察鑒定。

2.3 誘導(dǎo)性心肌細(xì)胞

Jiang等[23]使用從Oct4-GFP-C57小鼠身上獲得的心臟成纖維細(xì)胞（Cardiac fibroblasts，CFs）感染逆轉(zhuǎn)錄表達(dá)重組因子（Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc）來(lái)誘導(dǎo)功能性心臟細(xì)胞（Cardiomyocytes，CMs）。以初代的小鼠胎兒成纖維細(xì)胞（MEFs）作為對(duì)照，試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)由CFs衍生而來(lái)的iPS細(xì)胞（CF-iPS）與胚胎干細(xì)胞（EBs）及MEF衍生而來(lái)的iPS細(xì)胞（MEF-iPS）具有同樣的生理學(xué)特性。他們使用經(jīng)典擬胚體的方法和Transwell CM共培養(yǎng)體系來(lái)模擬心肌旁分泌微環(huán)境，進(jìn)而將CF-iPS向功能性心肌細(xì)胞誘導(dǎo)。在模擬的心肌旁分泌微環(huán)境中，CF-iPS自發(fā)地形成可以跳動(dòng)的EBs。這些分化而來(lái)的能夠自發(fā)跳動(dòng)的細(xì)胞可以表達(dá)心臟特有的組織特異性轉(zhuǎn)錄和結(jié)構(gòu)因素，而且顯示出典型的心肌形態(tài)學(xué)和電生理特征。

當(dāng)然，除了上述誘導(dǎo)性造血和血管細(xì)胞、誘導(dǎo)性神經(jīng)細(xì)胞和誘導(dǎo)性心肌細(xì)胞外，還有其他的誘導(dǎo)性功能細(xì)胞也已經(jīng)被人們所發(fā)現(xiàn)并認(rèn)知。如Yamaguchi等[24]將小鼠的iPS細(xì)胞誘導(dǎo)成肥大細(xì)胞。

3 展望

iPS細(xì)胞自誕生之日起即受到人們的關(guān)注，iPS細(xì)胞的研究開創(chuàng)了細(xì)胞生物學(xué)的新篇章，也極大地促進(jìn)了表觀遺傳學(xué)和胚胎生物學(xué)的發(fā)展，為人類再生醫(yī)學(xué)和特異的細(xì)胞治療帶來(lái)了更美好的希望。

如果供體細(xì)胞是來(lái)源于病人自身的體細(xì)胞，就可以避免免疫排斥反應(yīng)問題，將這些體細(xì)胞先誘導(dǎo)成iPS細(xì)胞，進(jìn)而再誘導(dǎo)成具有特定功能的目的細(xì)胞，理論上就可以用于臨床醫(yī)學(xué)和再生醫(yī)學(xué)，這樣就有望實(shí)現(xiàn)個(gè)性化治療。然而，到目前為止，誘導(dǎo)性功能細(xì)胞的種類有限，誘導(dǎo)效率也有待提高，并且細(xì)胞的功能仍需要大量動(dòng)物模擬試驗(yàn)驗(yàn)證。

目前，如何獲取更多的從終末分化細(xì)胞誘導(dǎo)而來(lái)的iPS細(xì)胞，并進(jìn)一步誘導(dǎo)成具有特定功能的細(xì)胞成為熱點(diǎn)，對(duì)多種體細(xì)胞衍生的iPS細(xì)胞和多種新的培養(yǎng)誘導(dǎo)方法[25-28]也已經(jīng)進(jìn)行了嘗試。

盡管這種誘導(dǎo)的功能性體細(xì)胞在將來(lái)可能具有較高的應(yīng)用價(jià)值，但是其中的詳細(xì)機(jī)理仍需要探索明確。相信在胚胎干細(xì)胞研究、iPS細(xì)胞研究、現(xiàn)代基因組學(xué)和RNA組學(xué)以及蛋白質(zhì)組學(xué)的發(fā)展和帶動(dòng)下，在不遠(yuǎn)的將來(lái)，越來(lái)越多的誘導(dǎo)性功能細(xì)胞有望在臨床醫(yī)學(xué)和生物學(xué)基礎(chǔ)研究上發(fā)揮重要作用，從而加快再生醫(yī)學(xué)和動(dòng)物組織工程的發(fā)展，同時(shí)，也能促進(jìn)發(fā)育生物學(xué)、表觀遺傳學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等基礎(chǔ)研究的發(fā)展。

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