磷脂酶D的抗逆特性及其活性檢測(cè)研究

王秀娟　高山　王國澤

摘要：介紹了磷脂酶D（PLD）的研究現(xiàn)狀及進(jìn)展，包括其分類、來源和用途，詳述了PLD的抗逆特性和相關(guān)作用機(jī)理及對(duì)PLD活性檢測(cè)的最新方法，對(duì)PLD在科學(xué)研究中的發(fā)展前景進(jìn)行了展望。

關(guān)鍵詞：磷脂酶D（PLD）；抗逆特性；活性檢測(cè)

中圖分類號(hào)：Q55 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2014）05-0998-03

1 概述

1.1 磷脂酶概述

磷脂又稱磷酸甘油脂，廣義上是指磷脂酰膽堿（PC）、磷脂酰乙醇胺 （PE）、磷脂酰肌醇（PI）、磷脂酰絲氨酸（PS）和神經(jīng)鞘磷脂（SM）的復(fù)合物，狹義上即為磷脂酰膽堿[1]，是構(gòu)成生物細(xì)胞膜骨架的主要成分，對(duì)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定具有重要意義，并且參與細(xì)胞代謝和神經(jīng)細(xì)胞的信號(hào)傳遞，同時(shí)其水解產(chǎn)物能參與多種生理過程以及環(huán)境刺激所引起的細(xì)胞反應(yīng)[2]，在細(xì)胞的生命活動(dòng)中起著重要的作用。磷脂的降解酶有多種，而磷脂酶則是催化降解磷脂第一步反應(yīng)的關(guān)鍵酶[3]，此過程是在植物細(xì)胞膜上普遍存在的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。磷脂在磷脂酶作用下水解為脂肪酸、肌醇三磷酸（IP3）、磷脂酸（PA）、二脂酰甘油（DAG）及乙酰膽堿等。根據(jù)其水解磷脂的部位不同可以把磷脂酶分為5類，即磷脂酶A1（Phospholipase Al，PLA1）、磷脂酶A2（PhospholipaseA2，PLA2）、磷脂酶B（Phospholipase B，PLB）、磷脂酶C（Phospholipase C，PLC）和磷脂酶D（Phospholipase D，PLD）[4，5]。

1.2 PLD的分類

PLD為磷脂酰膽堿磷脂水解酶，是磷脂酶的一種，用來催化水解磷脂末端的磷酸二酯鍵形成磷脂酸和親水性的膽堿等[6]，其催化水解作用廣泛存在于萌發(fā)種子、衰老器官、逆境脅迫及胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中[7]。PLD屬于多基因家族，具有多分子異質(zhì)性，通過對(duì)擬南芥PLD基因進(jìn)行序列相似性和生物特性的分析，將其分成6種類型12個(gè)成員，即α（3）、β（2）、γ（3）、δ、ε和 ζ（2）[8，9]，同理將大米的PLD基因分成6種類型17個(gè)成員，即α（8）、β（2）、δ（3）、ζ（2）、κ和ψ[10]。目前的研究發(fā)現(xiàn)，影響PLD活性的因素很多，包括溫度、pH、鹽類、溶劑以及底物的聚合狀態(tài)等，不同來源的PLD有著不同的最適影響條件，比如植物中PLD的最適pH 5～6要比微生物中的最適pH 4～8范圍窄[11]。PLD既具有水解特性，又具有轉(zhuǎn)導(dǎo)特性，且其最基本的功能就是維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定性[12]，同時(shí)PLD具有較廣的底物特異性，可以作用于多種底物磷脂及其衍生物，且對(duì)構(gòu)成脂的堿基部分沒有絕對(duì)的特異性要求[13]，相關(guān)研究表明，神經(jīng)鞘磷脂可能是目前得知的惟一不能被PLD降解的磷脂[14]。

1.3 PLD的用途

PLD作為降解磷脂類物質(zhì)的主要酶系，在各種細(xì)胞反應(yīng)中扮演著重要的角色，包括細(xì)胞轉(zhuǎn)移、受體的內(nèi)吞作用、細(xì)胞分泌、細(xì)胞骨架重組等[15]，同時(shí)也在生活生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，比如在醫(yī)藥方面。PLD在工業(yè)方面可用于油脂精煉、磷脂改性等[16]?？傊?，PLD已經(jīng)越來越得到人們的普遍關(guān)注。

2 PLD的來源

有活性的PLD最先是在1947～1948年由Hanahan等[17-19]從胡蘿卜根和菠菜葉的提取物中得到的，但是由于其多樣性及不穩(wěn)定性，其活性一直沒有得到充分利用，直到1994年Wang等[20]從萌發(fā)的蓖麻中通過系列試驗(yàn)得到有活性的PLD基因。迄今為止，從蓖麻、擬南芥、豇豆、甘藍(lán)、煙草、水稻、玉米、番茄、黃瓜、甜瓜等多種植物中克隆到的PLD 基因及其功能已經(jīng)被廣泛研究。雖然PLD普遍存在于動(dòng)物和植物中，但是由于來源于微生物的PLD種類繁多，多為外分泌表達(dá)和單亞基蛋白，容易大量快速制備且成本較低，因而逐漸成為提取磷脂酶的主要來源[5]。常見的產(chǎn)磷脂酶的微生物主要有產(chǎn)堿假單胞菌（Pseudomonas alcaligenes）、哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）、黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens ）、鏈霉菌（Streptomyces）和米曲霉（Aspergillus oryzae）等[21]，為了改變中國主要采用的微生物菌株由國外購買的現(xiàn)狀[22]，研究人員已逐漸篩選培育出了一些高產(chǎn)磷脂酶的菌株。李軍紅等[23]通過平板初篩和搖瓶復(fù)篩的方法獲得的高產(chǎn)菌株，經(jīng)驗(yàn)證鑒定其為蠟狀芽孢桿菌（Bacillu scereus），王金梅等[21]則得到的為無色桿菌屬（Achromobacter sp.）細(xì)菌，同時(shí)對(duì)其進(jìn)行脫膠處理，證明其有良好的應(yīng)用前景。

3 PLD在抗逆反應(yīng)中的作用

植物在低溫干旱、機(jī)械損傷、病原等逆境脅迫下，可通過信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)迅速啟動(dòng)響應(yīng)機(jī)制來調(diào)節(jié)自身的生理狀態(tài)，以產(chǎn)生適應(yīng)性或抗逆性[24]。研究發(fā)現(xiàn)，許多逆境下的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程都與植物體內(nèi)PLD的激活有關(guān)[25]，當(dāng)一些病原菌侵染植物時(shí)，植物中的PLD的調(diào)節(jié)活動(dòng)明顯增強(qiáng)。近年來，磷脂酶在干旱、低溫、機(jī)械損傷等逆境條件下的反應(yīng)機(jī)理已逐漸被發(fā)現(xiàn)。

3.1 低溫逆境

植物與外界環(huán)境接觸的首要部位即為細(xì)胞膜，細(xì)胞膜是由磷脂雙分子層構(gòu)成的，蛋白質(zhì)穿插在其中，磷脂作為細(xì)胞膜的主要成分，維持著細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能。當(dāng)植物受到低溫脅迫時(shí)，其細(xì)胞膜中的磷脂含量會(huì)隨著低溫脅迫的嚴(yán)重程度而發(fā)生變化，以適應(yīng)外界環(huán)境的變化。磷脂酶作為降解磷脂的主要酶，其活性直接影響了細(xì)胞膜磷脂的含量，進(jìn)而間接影響植物對(duì)低溫的抵抗作用[26]。Welti等[27]的試驗(yàn)表明，經(jīng)過低溫處理后PLD基因缺失型植株膜離子滲漏率與野生型植株明顯不同，而膜離子滲漏率是反映膜穩(wěn)定性的重要指標(biāo)，同時(shí)發(fā)現(xiàn)低溫處理后的兩種植株的膜成分均發(fā)生了明顯的變化。曾正兵等[28]的試驗(yàn)同樣證明在8～16 ℃的凍害脅迫下，PLDα缺失型植株的離子滲漏率不同于野生型，可見PLD基因主要通過影響膜的穩(wěn)定性來抵抗低溫環(huán)境。

3.2 干旱脅迫

當(dāng)植物處于干旱狀態(tài)時(shí)，為了維持體內(nèi)的水分充足，由脫落酸（ABA）誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉的敏感性將會(huì)升高，從而氣孔關(guān)閉，蒸騰作用會(huì)減弱，進(jìn)而減少水分的流失。同時(shí)經(jīng)過大量的試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，PLD參與ABA介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。因此，在干旱條件下，PLD的活性增強(qiáng)，進(jìn)而促使ABA誘導(dǎo)氣孔關(guān)閉，使植株內(nèi)的水分不會(huì)大量流失，更能適應(yīng)干旱條件。Sang等[29]的試驗(yàn)表明，PLD基因抑制型植株葉片的蒸騰失水率顯著高于野生型。孫磊[26]的試驗(yàn)表明，當(dāng)PLD的活性增強(qiáng)時(shí)，植物的氣孔導(dǎo)度顯著下降，水分喪失明顯減少，抗旱能力有所提高。由此可見，PLD基因主要通過參與水分脅迫條件下的氣孔調(diào)節(jié)作用來影響植物的抗旱性。

3.3 機(jī)械損傷

PA是磷脂酶水解磷脂的產(chǎn)物，同時(shí)也是信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的第二信使，參與許多細(xì)胞內(nèi)生化反應(yīng)。植物中的PA不僅可以激活一些激酶來共同參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，也可以作為中間體來參與其他脂質(zhì)體的合成[30]。當(dāng)植物受到機(jī)械損傷時(shí)，PLD活性增強(qiáng)，PA含量顯著增加，誘導(dǎo)細(xì)胞的信號(hào)反應(yīng)，同時(shí)膜上的鈣離子的含量也調(diào)節(jié)了PLD的含量，從而影響PA含量。Ryu等[31]報(bào)道，Ca2+會(huì)引起與膜結(jié)合PLD的增加，表明植物在干旱條件下Ca2+參與PLD的調(diào)控，趙宇瑛[32]的試驗(yàn)表明，植物在干旱條件下，細(xì)胞膜Ca2+含量減少，黃瓜PLD酶活性增強(qiáng)，進(jìn)而PA含量顯著增加。由此可見，植物通過膜上Ca2+的濃度來影響PLD和PA的含量，以達(dá)到抗旱效果。

3.4 其他

植物在受到其他逆境脅迫時(shí)，如病原微生物、植物激素等也會(huì)發(fā)生一系列的抗逆反應(yīng)，如當(dāng)植物遭受病原微生物侵害時(shí)，PLD會(huì)集中于微生物與質(zhì)膜的接觸部位，發(fā)生活性和定位的改變，以抵御病原菌的感染[33]。當(dāng)植物遇到植物激素如乙烯時(shí)，部分植物激素激發(fā)PLD的生成，繼而使PA的含量增加，共同作用來延緩植物的衰老過程。

4 PLD活性的檢測(cè)

由于PLD在植物的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆反應(yīng)及植物油脫膠等方面有著重要作用，因此對(duì)PLD活性的研究逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)，PLD活性的測(cè)定方法一般是以檢測(cè)其催化磷脂水解所生成的產(chǎn)物的量為依據(jù)的，如分光光度法、化學(xué)發(fā)光法、滴定法、直接標(biāo)記法等，當(dāng)前最常用的方法主要有底物放射標(biāo)記法、酶聯(lián)比色法和高效液相色譜法等。

4.1 底物放射標(biāo)記法

底物放射標(biāo)記法是通過直接對(duì)PLD反應(yīng)的底物進(jìn)行標(biāo)記而測(cè)定其活性[34]。它是PLD活性檢測(cè)中最敏感的一種方法，且其結(jié)果穩(wěn)定，準(zhǔn)確性高，誤差小，重復(fù)性好，但其試驗(yàn)過程具有放射性，易對(duì)操作人員身體造成傷害，對(duì)試驗(yàn)設(shè)備要求較高，所以較難普及。

4.2 酶聯(lián)比色法

酶聯(lián)比色法是以PLD催化水解磷脂酰膽堿末端的磷酸二酯鍵生成膽堿，進(jìn)而生成的H2O2為基準(zhǔn)進(jìn)行測(cè)定PLD活性的一種方法[35]。該方法具有高效便捷、靈敏度高、危害性小和結(jié)果穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但是耗費(fèi)藥品量大，操作繁瑣，所以一般適用于在測(cè)定材料的PLD含量很低，且難于提取的情況。

4.3 高效液相色譜法

高效液相色譜法是以熒光標(biāo)記的磷脂酰膽堿作為底物，利用轉(zhuǎn)磷脂酰反應(yīng)原理來測(cè)定PLD 活性的一種方法[36]。高效液相色譜法是一種簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、靈敏的方法，已被廣泛地應(yīng)用于PLD活性的檢測(cè)，具有良好的科研和臨床應(yīng)用價(jià)值，是一種很好的測(cè)定PLD的方法。

4.4 試劑盒法

用上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司出售的PLD 總活性比色定量檢測(cè)試劑盒來測(cè)定PLD的活性，操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，可以被普遍應(yīng)用。目前用于測(cè)定PLD活性的方法已越來越多，但在人們的日?？蒲兄?，由于測(cè)定的材料、目的及實(shí)驗(yàn)室條件限制等因素，應(yīng)根據(jù)具體情況來選擇適宜的測(cè)定方法。

5 前景與展望

PLD在人們的生活生產(chǎn)領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用，雖然目前人們已經(jīng)意識(shí)到PLD具有良好的發(fā)展前景，但是其來源仍然只局限于在植物和動(dòng)物中提取，對(duì)微生物來源的研究甚少，同時(shí)對(duì)其活性的檢測(cè)方法雖然很多，但是其或多或少存在不足，因此，要致力于培育優(yōu)良的微生物菌種，以能大量提取PLD，并且要研究出更適合檢測(cè)PLD活性的簡(jiǎn)便通用的方法，為PLD 的發(fā)展提供更好的依據(jù)。

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