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    越南伯克霍爾德氏菌B418殺線蟲活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性研究

    2014-07-05 04:08:49王貽蓮郭凱陳凱李紀(jì)順楊合同
    湖北農(nóng)業(yè)科學(xué) 2014年5期
    關(guān)鍵詞:伯克霍氏菌爾德

    王貽蓮 郭凱 陳凱 李紀(jì)順 楊合同

    摘要:研究越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)B418產(chǎn)生的殺線蟲活性代謝產(chǎn)物,采用根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)2齡幼蟲生物測定法對(duì)B418發(fā)酵液上清液的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,B418代謝產(chǎn)物的處理溫度最高不應(yīng)超過60 ℃;pH穩(wěn)定范圍為7.0~10.0,其中pH為7.0時(shí)B418代謝產(chǎn)物活性最高,B418代謝產(chǎn)物處理后8 h試蟲最高校正致死率為76.63%;以乙酸乙酯、石油醚、丙酮、正丁醇均降低了B418代謝產(chǎn)物的殺線蟲活性,氯仿不影響代謝產(chǎn)物活性,氯仿處理后的代謝產(chǎn)物線蟲死亡率穩(wěn)定在74%以上。

    關(guān)鍵詞:越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)B418;代謝產(chǎn)物;殺線蟲活性;穩(wěn)定性

    中圖分類號(hào):TQ453.5;S432.4+5 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A 文章編號(hào):0439-8114(2014)05-1066-03

    植物寄生線蟲是一類重要的植物病原物,其危害超過細(xì)菌和病毒,僅次于致病真菌 [1,2]。據(jù)估計(jì),全球每年由植物寄生線蟲造成的損失達(dá)1 250億美元[2],這一損失的70%是由根結(jié)線蟲(Meloidogyne spp.)引起[3]。根結(jié)線蟲寄主范圍廣,可危害多種常見蔬菜,且以種植面積較大的番茄、黃瓜、芹菜等受害較重,已成為蔬菜生產(chǎn)中的嚴(yán)重問題之一[4]。

    保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲的治理非常困難,在實(shí)際生產(chǎn)中,傳統(tǒng)的耕作措施,如輪作、種植抗病品種、施用農(nóng)家肥、日曬等往往難以奏效。長期大量施用化學(xué)殺線蟲劑防治根結(jié)線蟲,會(huì)導(dǎo)致農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留超標(biāo)和環(huán)境污染,破壞生態(tài)平衡[5]。生物防治因具有除害增產(chǎn)、保護(hù)生態(tài)平衡、減輕環(huán)境污染等優(yōu)勢[6],越來越受到人們的關(guān)注。

    多功能生防菌越南伯克霍爾德氏菌(Burkholderia vietnamiensis)B418由山東省科學(xué)院生物中心農(nóng)業(yè)微生物研究室保存,該菌分離自白俄羅斯大麥根際土壤,能夠有效防治根結(jié)線蟲病。田間試驗(yàn)表明[7,8],B418對(duì)番茄根結(jié)線蟲病的防治效果為63.42%,對(duì)茄子根結(jié)線蟲的防治效果為75.60%。室內(nèi)毒力測定結(jié)果顯示, B418發(fā)酵液上清液處理2齡根結(jié)線蟲6 h后校正死亡率達(dá)70%以上,可見,B418代謝產(chǎn)物含有殺線蟲活性物質(zhì)。本研究對(duì)越南伯克霍爾德氏菌B418發(fā)酵液上清液的熱穩(wěn)定性、酸堿穩(wěn)定性及有機(jī)溶劑的穩(wěn)定性進(jìn)行了檢測,旨在為其殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    越南伯克霍爾德氏菌B418、南方根結(jié)線蟲(Meloidogyne incongnita),由山東省科學(xué)院生物中心農(nóng)業(yè)微生物研究室保存;乙醚、石油醚、丙酮、正丁醇、氯仿、乙酸乙酯和鹽酸均為市售分析純。

    B418 固體培養(yǎng)基每升含 K2HPO4 0.5 g、MgSO4·7H2O 0.2 g、NaCl 0.02 g、CaCl2 0.2 g、NaMoO4·2H2O 0.002 g、乙二胺四乙酸鐵鈉鹽0.066 g、谷氨酸鈉0.05 g、葡萄糖5 g、瓊脂15 g,pH 7.2~7.4;B418 液體培養(yǎng)基每升含蛋白胨10 g、酵母浸出物1 g、CaCl2 0.2 g,pH 7.2~7.4。

    1.2 方法

    1.2.1 生物測定方法

    1)根結(jié)線蟲2齡幼蟲的獲得。根結(jié)線蟲用室內(nèi)盆栽番茄(中蔬4號(hào))保存。當(dāng)番茄根系有大量卵囊出現(xiàn)時(shí),取出根系,用自來水輕輕沖洗,小心取下卵囊,0.5% 次氯酸鈉中浸泡3 min,無菌水沖洗3次,放在盛有少量無菌水的培養(yǎng)皿里,25 ℃恒溫箱中培養(yǎng)4 d,每隔24 h收集1次2齡幼蟲。

    2)B418發(fā)酵上清液活性測定。B418發(fā)酵上清液(原液)加入24孔培養(yǎng)板中,每孔加入0.1 mL,5次重復(fù),并設(shè)無菌水作對(duì)照(CK)。分別向各孔中加入根結(jié)線蟲2齡幼蟲,每孔50條左右。放入25 ℃培養(yǎng)箱中,觀察記錄線蟲死亡情況,計(jì)算(校正)死亡率。

    1.2.2 B418殺線蟲活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性測定

    1)不同溫度及酸堿度下的穩(wěn)定性。取B418發(fā)酵上清液5倍稀釋后分別在常溫、60、80、100 ℃ 水浴鍋中處理60 min,-20 ℃處理12 h,115 ℃ 處理30 min,測定處理后的B418發(fā)酵上清液的殺線蟲活性,以6 h校正死亡率來體現(xiàn)。用1 mol /L NaOH 和1 mol /L HCl 將pH 分別調(diào)至2.0、3.0、4.0、5. 0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0,靜置12 h 后將pH 調(diào)到7. 0,取原液和處理后的發(fā)酵上清液分別5倍稀釋后測定殺線蟲活性,以8 h校正死亡率來體現(xiàn)。

    2)不同有機(jī)溶劑下的穩(wěn)定性。取B418發(fā)酵上清液,分別加入等體積乙醚、石油醚、丙酮、正丁醇、氯仿和乙酸乙酯,原液混合搖勻靜置12 h,如分層則將上下層各取400 μL、不分層的取800 μL,另取原液400 μL滴加到濾紙片上,60 ℃ 烘干,加入與滴加量等體積的無菌水浸泡濾紙片2 h,取浸泡液和原液測定。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 B418代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性測定

    B418代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性測定結(jié)果見表1。由表1可知, 經(jīng)60 、80、100、115 ℃熱處理后,B418發(fā)酵上清液的殺線蟲活性隨處理溫度的升高而下降。表明活性物質(zhì)的處理溫度最高不應(yīng)超過60 ℃。

    2.2 B418代謝產(chǎn)物的酸堿穩(wěn)定性

    B418代謝產(chǎn)物酸堿穩(wěn)定性測定結(jié)果見表2。由表2可知,B418代謝產(chǎn)物的殺線蟲活性穩(wěn)定的pH范圍為7.0~10.0。其中,pH為7.0時(shí)活性最強(qiáng),線蟲校正死亡率最高為76.63%。表明B418殺線蟲活性產(chǎn)物能耐pH 10.0以下的堿性環(huán)境。

    2.3 B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

    B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表3。由表3可知,B418代謝產(chǎn)物經(jīng)有機(jī)溶劑處理后,除氯仿和乙醚處理外,殺線蟲活性均有較大程度降低,其中乙酸乙酯處理活性降低最多,其上依次為石油醚、丙酮、正丁醇。氯仿處理原液、原液、60 ℃烘干原液殺線蟲活性相當(dāng)。表明氯仿處理對(duì)B418代謝產(chǎn)物的殺線蟲活性影響不大。

    3 小結(jié)與討論

    越南伯克霍爾德氏菌B418是多功能生防菌株,具有解磷、解鉀、固氮、促生及防治根結(jié)線蟲病的作用。但B418菌株作為活菌制劑直接施于田間防治根結(jié)線蟲病時(shí),其定殖受環(huán)境(如土壤有機(jī)質(zhì)、水分、pH、溫度、微生物區(qū)系)的影響[9,10],制約著B418菌株的使用效果。因此,本試驗(yàn)對(duì)越南伯克霍爾德氏菌B418殺線蟲活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,旨在為殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化奠定基礎(chǔ),為新的生物農(nóng)藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

    通過對(duì)B418菌株發(fā)酵上清液穩(wěn)定性測定,表明活性物質(zhì)的處理溫度最高不應(yīng)超過60 ℃。代謝產(chǎn)物殺線蟲活性穩(wěn)定的pH范圍為7.0~10.0,pH為7.0時(shí)活性最高,8 h最高校正死亡率為76.63%。另外,在測定B418代謝產(chǎn)物生長曲線及pH變化中發(fā)現(xiàn),初始pH為7.4時(shí),接菌后前6 h發(fā)酵上清液的pH下降,但在7.0以上;6 h后pH持續(xù)上升,6 d時(shí)pH達(dá)到9.3。由此可知,在分離純化B418代謝產(chǎn)物時(shí),可不考慮其發(fā)酵上清液pH的影響。B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性測定結(jié)果表明,氯仿處理不影響活性成分的殺線蟲作用;乙醚處理殺線蟲活性雖然最高,因其有易揮發(fā)特性,可能存在溶劑相減少,樣品濃縮的可能,故試驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

    參考文獻(xiàn)

    [1] 韓生成,劉清利,孟頌東,等.植物寄生線蟲分子生物學(xué)和抗線蟲基因工程策略的研究進(jìn)展[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),1999,7(4):395-400.

    [2] 陳儒鋼.番茄和辣椒抗根結(jié)線蟲基因的克隆與鑒定[D].武漢:華中農(nóng)業(yè)大學(xué),2006.

    [3] 莫明和,牟貴平.利用食線蟲真菌防治植物寄生線蟲的研究進(jìn)

    展[J].大理學(xué)院學(xué)報(bào),2009, 18(12):71-76.

    [4] 趙 磊,段玉璽,白春明,等.遼寧省保護(hù)地蔬菜根結(jié)線蟲發(fā)生規(guī)律及防治對(duì)策[J].植物保護(hù), 2011,37(1):105-109.

    [5] 時(shí)立波,王振華,劉 靜,等.幾種殺線劑對(duì)土壤微生物數(shù)量及真菌多樣性影響[J].農(nóng)藥,2008,47(12):917-919.

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    [7] 李紀(jì)順,陳 凱,楊合同,等.伯克霍爾德氏菌B418的生物學(xué)特性[A].楊懷文.中國植物病理學(xué)會(huì)2004年學(xué)術(shù)年會(huì)論文集[C].北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社,2004.

    [8] 李善梅,李紀(jì)順,徐維生,等.生防菌劑YKT41及B418防治茄子根結(jié)線蟲病的田間試驗(yàn)[J].山東科學(xué),2011,24(5):10-13.

    [9] 張炳欣,張 平,陳曉斌.影響引入微生物根部定殖的因素[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2000,11(6):951-953.

    [10] 年洪娟,陳麗梅.土壤有益細(xì)菌在植物根際競爭定殖的影響因素[J].生態(tài)學(xué)雜志,2010,29(6):1235-1239.

    2.3 B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

    B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表3。由表3可知,B418代謝產(chǎn)物經(jīng)有機(jī)溶劑處理后,除氯仿和乙醚處理外,殺線蟲活性均有較大程度降低,其中乙酸乙酯處理活性降低最多,其上依次為石油醚、丙酮、正丁醇。氯仿處理原液、原液、60 ℃烘干原液殺線蟲活性相當(dāng)。表明氯仿處理對(duì)B418代謝產(chǎn)物的殺線蟲活性影響不大。

    3 小結(jié)與討論

    越南伯克霍爾德氏菌B418是多功能生防菌株,具有解磷、解鉀、固氮、促生及防治根結(jié)線蟲病的作用。但B418菌株作為活菌制劑直接施于田間防治根結(jié)線蟲病時(shí),其定殖受環(huán)境(如土壤有機(jī)質(zhì)、水分、pH、溫度、微生物區(qū)系)的影響[9,10],制約著B418菌株的使用效果。因此,本試驗(yàn)對(duì)越南伯克霍爾德氏菌B418殺線蟲活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,旨在為殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化奠定基礎(chǔ),為新的生物農(nóng)藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

    通過對(duì)B418菌株發(fā)酵上清液穩(wěn)定性測定,表明活性物質(zhì)的處理溫度最高不應(yīng)超過60 ℃。代謝產(chǎn)物殺線蟲活性穩(wěn)定的pH范圍為7.0~10.0,pH為7.0時(shí)活性最高,8 h最高校正死亡率為76.63%。另外,在測定B418代謝產(chǎn)物生長曲線及pH變化中發(fā)現(xiàn),初始pH為7.4時(shí),接菌后前6 h發(fā)酵上清液的pH下降,但在7.0以上;6 h后pH持續(xù)上升,6 d時(shí)pH達(dá)到9.3。由此可知,在分離純化B418代謝產(chǎn)物時(shí),可不考慮其發(fā)酵上清液pH的影響。B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性測定結(jié)果表明,氯仿處理不影響活性成分的殺線蟲作用;乙醚處理殺線蟲活性雖然最高,因其有易揮發(fā)特性,可能存在溶劑相減少,樣品濃縮的可能,故試驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

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    2.3 B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性

    B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性檢測結(jié)果見表3。由表3可知,B418代謝產(chǎn)物經(jīng)有機(jī)溶劑處理后,除氯仿和乙醚處理外,殺線蟲活性均有較大程度降低,其中乙酸乙酯處理活性降低最多,其上依次為石油醚、丙酮、正丁醇。氯仿處理原液、原液、60 ℃烘干原液殺線蟲活性相當(dāng)。表明氯仿處理對(duì)B418代謝產(chǎn)物的殺線蟲活性影響不大。

    3 小結(jié)與討論

    越南伯克霍爾德氏菌B418是多功能生防菌株,具有解磷、解鉀、固氮、促生及防治根結(jié)線蟲病的作用。但B418菌株作為活菌制劑直接施于田間防治根結(jié)線蟲病時(shí),其定殖受環(huán)境(如土壤有機(jī)質(zhì)、水分、pH、溫度、微生物區(qū)系)的影響[9,10],制約著B418菌株的使用效果。因此,本試驗(yàn)對(duì)越南伯克霍爾德氏菌B418殺線蟲活性產(chǎn)物的穩(wěn)定性進(jìn)行了研究,旨在為殺線蟲活性物質(zhì)的分離純化奠定基礎(chǔ),為新的生物農(nóng)藥開發(fā)提供理論依據(jù)。

    通過對(duì)B418菌株發(fā)酵上清液穩(wěn)定性測定,表明活性物質(zhì)的處理溫度最高不應(yīng)超過60 ℃。代謝產(chǎn)物殺線蟲活性穩(wěn)定的pH范圍為7.0~10.0,pH為7.0時(shí)活性最高,8 h最高校正死亡率為76.63%。另外,在測定B418代謝產(chǎn)物生長曲線及pH變化中發(fā)現(xiàn),初始pH為7.4時(shí),接菌后前6 h發(fā)酵上清液的pH下降,但在7.0以上;6 h后pH持續(xù)上升,6 d時(shí)pH達(dá)到9.3。由此可知,在分離純化B418代謝產(chǎn)物時(shí),可不考慮其發(fā)酵上清液pH的影響。B418代謝產(chǎn)物的有機(jī)溶劑穩(wěn)定性測定結(jié)果表明,氯仿處理不影響活性成分的殺線蟲作用;乙醚處理殺線蟲活性雖然最高,因其有易揮發(fā)特性,可能存在溶劑相減少,樣品濃縮的可能,故試驗(yàn)結(jié)果有待進(jìn)一步證實(shí)。

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