創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙大鼠海馬、杏仁核神經(jīng)元自噬和凋亡改變

隋竹欣，劉 昊，王海濤，李 慧，楊占嶺，徐愛軍，呂翠平，李月春

(河北聯(lián)合大學(xué)：1. 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院組織胚胎學(xué)系；2. 附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，河北唐山 063000)

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙(posttraumatic stress disorder, PTSD)是由異常威脅性或?yàn)?zāi)難性心理創(chuàng)傷而導(dǎo)致的延遲出現(xiàn)持續(xù)的精神障礙，是應(yīng)激疾病中最為典型的一種。隨著戰(zhàn)爭(zhēng)、社會(huì)暴力事件、重大交通事故和自然災(zāi)害等創(chuàng)傷意外不斷增多，PTSD發(fā)生逐年增高[1-2]。PTSD詳細(xì)的發(fā)病機(jī)制仍未被闡明。有研究表明，PTSD患者海馬、杏仁核等部位出現(xiàn)明顯的萎縮、體積縮小現(xiàn)象[3-6]，提示在PTSD發(fā)病過程中，海馬和杏仁核部位神經(jīng)細(xì)胞存在丟失或死亡等病理改變。有學(xué)者利用單一連續(xù)應(yīng)激(single-prolonged stress, SPS)復(fù)制PTSD大鼠模型，并在海馬和杏仁核部位觀察到明顯的凋亡現(xiàn)象[7-9]。這可能和PTSD海馬與杏仁核體積異常有關(guān)。自噬(autophagy)和凋亡都屬于細(xì)胞的程序性死亡方式。PTSD發(fā)病中海馬、杏仁核部位是否存在異常的自噬現(xiàn)象，尚待進(jìn)一步研究。本研究利用PTSD模型，探討海馬、杏仁核神經(jīng)元的自噬和凋亡現(xiàn)象，為海馬、杏仁核體積異常提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑健康成年雄性SD大鼠40只，體質(zhì)量180～210 g(河北聯(lián)合大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK京2009-0004)，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(Roch公司)，LC-3兔多克隆抗體、Beclin-1羊多克隆抗體和β-actin鼠單克隆抗體(Santz Cruz公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG和免疫印跡相關(guān)試劑(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及PTSD模型的建立 將大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組，每組20只。模型組采用改良的單一連續(xù)應(yīng)激(SPS & S)制備PTSD大鼠模型，即先給予單一連續(xù)應(yīng)激(single-prolonged stress，SPS)，包括禁錮2 h、強(qiáng)迫游泳15 min、乙醚麻醉至昏迷，然后給予足底電擊(a single inescapable electric foot shock, 10 mA、5 s)。電擊后靜養(yǎng)7 d，飼養(yǎng)條件：22～25 ℃、晝夜節(jié)律、自由飲水?dāng)z食。模型組大鼠于靜養(yǎng)結(jié)束后處死。對(duì)照組不做處理。

1.2.2Western blotting檢測(cè)海馬、杏仁核LC-3和Beclin-1的表達(dá) 將兩組大鼠麻醉后斷頭取腦，根據(jù)圖譜在體視顯微鏡下快速分離海馬和杏仁核，提取組織總蛋白。定量后按照30 μg蛋白量上樣，進(jìn)行120 g/L SDS-PAGE電泳，PVDF膜電轉(zhuǎn)印，脫脂奶粉封閉，一抗(LC-3，1∶400；Beclin-1，1∶400，Santz Cruz)4℃孵育過夜，二抗IgG(1∶5 000，Santz Cruz)室溫孵育1 h，ECL顯色。同樣方法進(jìn)行內(nèi)參照β-actin的Western blotting分析。以目的條帶與內(nèi)參照的吸光度比值表示目的蛋白的相對(duì)表達(dá)。

1.2.3TUNEL檢測(cè)海馬、杏仁核神經(jīng)元的凋亡情況 兩組大鼠用40 mL/L水合氯醛溶液(1 mL/100g)腹腔注射麻醉后處死，快速取出腦組織，常規(guī)石蠟包埋，5 μm切片。采用TUNEL法原位末端標(biāo)記DNA片段檢測(cè)杏仁核神經(jīng)元凋亡，操作按照檢測(cè)試劑盒說明書進(jìn)行。計(jì)算TUNEL陽性細(xì)胞百分率：陽性細(xì)胞百分率=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

1.2.4流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)海馬、杏仁核神經(jīng)元的凋亡率 兩組大鼠麻醉后斷頭取腦組織，分離海馬和杏仁核，制成細(xì)胞懸液，密度為5×105～1×106/mL。取1 mL細(xì)胞，4 ℃離心后棄上清，加入1 mL預(yù)冷PBS，懸浮細(xì)胞。重復(fù)操作3次，棄上清。將細(xì)胞重懸于200 μL Binding Buffer液中，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL Propidium Iodide，混勻，避光室溫反應(yīng)15 min。加入300 μL Binding Buffer液，上機(jī)檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1LC-3和Beclin-1的表達(dá)水平對(duì)照組LC-3有少量的基礎(chǔ)表達(dá)。定量分析結(jié)果顯示，對(duì)照組、模型組大鼠海馬組織LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ表達(dá)比值分別為1.07±0.12、2.84±0.19，Beclin-1相對(duì)表達(dá)分別為0.67±0.10、1.75±0.21。兩組大鼠杏仁核組織LC-3Ⅱ/LC-3Ⅰ表達(dá)比值分別為0.91±0.10、2.53±0.27，Beclin-1相對(duì)表達(dá)分別為0.88±0.02、2.35±0.27。模型組高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2兩組大鼠海馬和杏仁核TUNEL染色結(jié)果光鏡下對(duì)照組可見少量TUNEL陽性細(xì)胞，模型組可見較多的TUNEL陽性細(xì)胞。分析結(jié)果表明，模型組海馬、杏仁核TUNEL陽性細(xì)胞百分率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖1)。

圖1兩組大鼠海馬和杏仁核TUNEL陽性細(xì)胞百分率的比較

Fig.1 Comparison of TUNEL positive cell percentage of hippocampus and amygdala in rats of the two groups

與對(duì)照組比較，**P<0.01。

2.3兩組大鼠海馬和杏仁核流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果模型組海馬、杏仁核組織凋亡率明顯高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖2)。

圖2兩組大鼠海馬和杏仁核細(xì)胞凋亡率的比較

Fig.2 Comparison of cell apoptosis rate of hippocampus and amygdala in rats of the two groups

與對(duì)照組比較，**P<0.01。

3 討 論

對(duì)PTSD的基礎(chǔ)研究得益于動(dòng)物模型的建立。SPS后立即給予不可逃避的足底電擊，能使大鼠表現(xiàn)出PTSD臨床癥狀，是研究PTSD較好的動(dòng)物模型[10]。因此，本研究中采用SPS&S應(yīng)激建立PTSD模型。海馬、杏仁核等結(jié)構(gòu)體積異常是PTSD的病理特征之一[3-6]，其原因可能與PTSD大鼠海馬、杏仁核部位存在明顯的神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象有關(guān)[7-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PTSD大鼠海馬和杏仁核神經(jīng)元存在明顯的凋亡，這與國(guó)內(nèi)學(xué)者的研究結(jié)果一致[7-9]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，SPS&S應(yīng)激后大鼠海馬、杏仁核自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ比例增高，Beclin-1明顯上調(diào)，提示應(yīng)激后海馬、杏仁核神經(jīng)元存在明顯的細(xì)胞自噬。

細(xì)胞自噬是有別于凋亡的另外一種程序性死亡方式，也稱為Ⅱ型程序性死亡?；具^程是細(xì)胞通過單層或雙層膜包裹待降解物形成自噬體，然后運(yùn)送到溶酶體形成自噬溶酶體并進(jìn)行多種酶的消化和降解，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和細(xì)胞器的更新。哺乳動(dòng)物自噬相關(guān)基因產(chǎn)物L(fēng)C3-Ⅱ是自噬體的標(biāo)志分子，LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比例增大與自噬泡的形成數(shù)量相關(guān)，是檢測(cè)自噬的分子指標(biāo)[11]。自噬另一種相關(guān)基因beclin-1的編碼產(chǎn)物Beclin-1參與自噬體的早期形成過程，是自噬重要的正調(diào)節(jié)因子[12]。研究表明，在成年大鼠大腦海馬等部位存在Beclin-1的表達(dá)[13]，提示大鼠海馬等部位存在明顯的細(xì)胞自噬現(xiàn)象。自噬過程在維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)正常功能方面具有重要作用[14]。自噬在掌控細(xì)胞命運(yùn)中起著雙重作用，與凋亡關(guān)系復(fù)雜[15]。正常情況下，自噬處在比較低的基礎(chǔ)水平。在輕度應(yīng)激時(shí)，自噬作為促生存機(jī)制，被適度激活以保護(hù)細(xì)胞免于凋亡和壞死；在嚴(yán)重刺激時(shí)，自噬被過度激活引起細(xì)胞發(fā)生程序性死亡，參與多種疾病的發(fā)生與發(fā)展。在PTSD發(fā)病過程中，海馬、杏仁核神經(jīng)細(xì)胞存在明顯的細(xì)胞凋亡和自噬，兩者在PTSD發(fā)病中的關(guān)系有待進(jìn)一步研究。

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