利用Flo1p錨定蛋白在釀酒酵母表面展示三種纖維素酶的纖維素乙醇發(fā)酵

莫春玲，楊越悅，陳寧，楊秀山，田沈

首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048

利用Flo1p錨定蛋白在釀酒酵母表面展示三種纖維素酶的纖維素乙醇發(fā)酵

莫春玲，楊越悅，陳寧，楊秀山，田沈

首都師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100048

莫春玲, 楊越悅, 陳寧, 等. 利用Flo1p錨定蛋白在釀酒酵母表面展示三種纖維素酶的纖維素乙醇發(fā)酵. 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(9): 1401?1413.

Mo CL, Yang YY, Chen N, et al. Display cellulolytic enzymes on Saccharomyces cerevisiae cell surface by using Flo1p as an anchor protein for cellulosic ethanol production. Chin J Biotech, 2014, 30(9): 1401?1413.

為了簡(jiǎn)化纖維素乙醇生產(chǎn)工藝，實(shí)現(xiàn)纖維素利用與乙醇發(fā)酵的同步進(jìn)行，通過(guò)酵母細(xì)胞表面展示技術(shù)，以釀酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae Y5為受體，通過(guò)絮凝素 (Flo1p) 錨定方式，將來(lái)自絲狀真菌里氏木霉Trichoderma reesei的內(nèi)切葡聚糖酶Ⅱ(EGII)、纖維二糖水解酶Ⅱ(CBHII)以及來(lái)自棘孢曲霉Aspergillus aculeatus的β-葡糖苷酶Ⅰ(BGLI) 展示在細(xì)胞表面，構(gòu)建同時(shí)表達(dá)3種纖維素酶的酵母菌群系統(tǒng)。經(jīng)過(guò)免疫熒光驗(yàn)證展示酶的細(xì)胞蛋白定位，酶活測(cè)定，乙醇發(fā)酵性能驗(yàn)證，結(jié)果表明：展示表達(dá)的3種纖維素酶具有良好的穩(wěn)定性和功能活性；在EGII、CBHII和BGLI協(xié)同作用下重組酵母菌株能夠水解溶脹磷酸纖維素 (Phosphoric acid swollen cellulose，簡(jiǎn)稱PASC) 并產(chǎn)生乙醇，乙醇濃度達(dá)到最大值0.77 g/L，乙醇產(chǎn)量為0.35 g/g，相當(dāng)于理論值的68.6%。本研究成功構(gòu)建了利用Flo1p作為錨定蛋白的絮凝素展示系統(tǒng)，初步實(shí)現(xiàn)了纖維素利用與乙醇發(fā)酵的同步進(jìn)行，為利用釀酒酵母表面展示技術(shù)固定并表達(dá)纖維素酶提供了一定的理論依據(jù)。

細(xì)胞表面展示，F(xiàn)lo1錨定蛋白，酵母菌群，纖維素乙醇

以石油等不可再生資源為基礎(chǔ)的現(xiàn)代工業(yè)化社會(huì)的發(fā)展模式正面臨能源枯竭的嚴(yán)重威脅，作為一種安全的液體燃料和石油添加劑，燃料酒精是公認(rèn)為最具發(fā)展前景的可再生清潔能源之一[1]。以農(nóng)作物秸稈、垃圾纖維等纖維素類物質(zhì)為代表的生物質(zhì)物質(zhì)具有來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉、可再生等諸多優(yōu)點(diǎn)，因此研究開發(fā)木質(zhì)纖維素類物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化技術(shù)對(duì)于開發(fā)新能源，保護(hù)環(huán)境具有重要的現(xiàn)實(shí)意義[2]。

目前，釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae是工業(yè)上生產(chǎn)乙醇的優(yōu)良菌株。然而，在利用纖維素物質(zhì)進(jìn)行乙醇生產(chǎn)的過(guò)程中，酵母不能直接利用纖維素類物質(zhì)，同時(shí)由于纖維素酶制劑的生產(chǎn)成本過(guò)高也制約纖維素乙醇的大規(guī)模應(yīng)用。為了簡(jiǎn)化加工過(guò)程，降低能耗，酵母表面展示技術(shù)應(yīng)運(yùn)而生，該項(xiàng)技術(shù)是近年來(lái)隨著基因工程的發(fā)展而興起的可將外源蛋白錨定在細(xì)胞壁上并表達(dá)的重要生物技術(shù)，近年來(lái)頗受關(guān)注[3]，酵母表面展示系統(tǒng)以釀酒酵母表面展示系統(tǒng)發(fā)展較為完善。根據(jù)外源目的蛋白與酵母細(xì)胞壁蛋白的融合部位不同，釀酒酵母表面展示系統(tǒng)主要分為凝集素系統(tǒng)和絮凝素系統(tǒng)。絮凝素Flo1p是一種在絮凝中起重要作用的酵母細(xì)胞壁蛋白，由Flo1基因編碼，F(xiàn)lo1p的功能結(jié)構(gòu)域包括兩部分，一部分是C-端的GPI錨定區(qū)，可以與細(xì)胞膜、細(xì)胞壁結(jié)合；另一部分是N-端的絮凝結(jié)構(gòu)域，可以與胞壁糖類相結(jié)合。以絮凝素為錨定蛋白，外源靶蛋白酶分子可實(shí)現(xiàn)在釀酒酵母表面C-端和N端錨定兩種截然不同的展示方式[4]。一些大小在0.93–136 kDa的外源蛋白已經(jīng)成功地利用絮凝素展示系統(tǒng)固定在酵母細(xì)胞表面，如淀粉酶、脂肪酶等[5-7]。

在酵母表面展示纖維素酶的眾多研究中，采用凝集素展示系統(tǒng)的研究居多[8-10]，而利用絮凝素展示系統(tǒng)的鮮有報(bào)道。絮凝素展示系統(tǒng)作為后續(xù)發(fā)展系統(tǒng)，已被證實(shí)具有更多的展示方式和更好的展示能力[11]。通過(guò)構(gòu)建釀酒酵母絮凝素展示系統(tǒng)將纖維素酶展示在酵母細(xì)胞表面，以固定化酶的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)纖維素水解和乙醇發(fā)酵同步進(jìn)行，從而大大簡(jiǎn)化了乙醇生產(chǎn)工藝流程，降低生產(chǎn)成本，提高纖維素的利用效率；同時(shí)該展示系統(tǒng)可以依據(jù)不同的目的蛋白來(lái)選擇不同的展示方式，被展示的外源蛋白能夠保持相對(duì)獨(dú)立的空間結(jié)構(gòu)和生物活性，推動(dòng)了纖維素酶固定化的進(jìn)一步研究和開發(fā)。

在前期的研究中，已成功構(gòu)建基于a-凝集素的S. cerevisiae Y5表面展示系統(tǒng)并成功使EGII、CBHII及BGLI在Y5細(xì)胞表面得以展示[12]。S. cerevisiae Y5為實(shí)驗(yàn)室專利授權(quán)菌株，它具有較高的乙醇產(chǎn)率，代謝副產(chǎn)物少，耐受乙醇及其他抑制劑能力強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。因此本研究利用S. cerevisiae Y5絮凝素為錨定蛋白構(gòu)建絮凝素展示系統(tǒng)，將3種纖維素酶都以較優(yōu)良的活性形式展示在宿主細(xì)胞表面。通過(guò)這一安全無(wú)污染、環(huán)境友好型的改造，很大程度上簡(jiǎn)化燃料乙醇的生產(chǎn)流程，降低能耗，同時(shí)為實(shí)現(xiàn)全細(xì)胞催化纖維素乙醇的生物轉(zhuǎn)化提供基礎(chǔ)，所以此系統(tǒng)具有較廣的應(yīng)用前景[13-14]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

S. cerevisiae Y5[15]作為纖維素酶展示的宿主菌；大腸桿菌Escherichia coli Top 10 (Tiangen生化) 用于亞克??；里氏木霉Trichoderma reesei 40358和棘孢曲霉Aspergillus aculeatus 2193購(gòu)自中國(guó)工業(yè)微生物菌種保藏管理中心 (CICC)，作為纖維素酶基因的來(lái)源。

酵母表面展示載體pYD1購(gòu)自Invitrogen;酵母整合載體YIP5-KanR由本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件

LB培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉 5，胰蛋白胨10，NaCl 10，pH 7.0，添加100 μg/mL氨芐青霉素于37 ℃，200 r/min 條件下用于E. coli 轉(zhuǎn)化子的篩選。

YPD培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，葡萄糖20，添加600 μg/mL的G418于30 ℃，150 r/min條件下篩選酵母轉(zhuǎn)化子。

YPG培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，半乳糖20，20 ℃、120 r/min條件下用于酵母轉(zhuǎn)化子的誘導(dǎo)。

YP-PASC培養(yǎng)基 (g/L)：酵母粉10，蛋白胨20，磷酸膨脹纖維素[16]10，30 ℃、150 r/min條件下用于纖維素水解及乙醇發(fā)酵。

表1總結(jié)了本研究涉及的相關(guān)展示載體及重組菌株的特性。

1.1.3 工具酶和化學(xué)試劑

限制性內(nèi)切酶購(gòu)自TaKaRa公司；DNA連接酶購(gòu)自Fermentas；Taq DNA聚合酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)粒提取試劑盒、瓊脂凝膠回收試劑盒購(gòu)自天根生化科技有限公司；微晶纖維素Avicel PH-101及羧甲基纖維素 (CMC) 購(gòu)自Sigma；其他抗生素與生化試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口分析純；引物合成和基因序列測(cè)定均由北京三博遠(yuǎn)志生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1 絮凝素展示系統(tǒng)基因的獲得及表達(dá)載體的構(gòu)建

根據(jù)S. cerevisiae Y5基因組的相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)引物，以S. cerevisiae Y5的cDNA為模板，分別擴(kuò)增得到絮凝素展示系統(tǒng)的信號(hào)肽基因片段(MF.SS)和絮凝素C端錨定的基因片段(FLO1)。MF.SS片段經(jīng)SacⅠ/NheⅠ雙酶切后插入pYD1質(zhì)粒的GAL1啟動(dòng)子下游，F(xiàn)LO1片段經(jīng)SphⅠ/SalⅠ雙酶切后插入pYD1質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)的下游；根據(jù)已知的kanr基因序列設(shè)計(jì)引物，以質(zhì)粒YIP5-KanR為模板擴(kuò)增獲得kanr.ORF片段，經(jīng)SpeⅠ/SalⅠ雙酶切得到kanr基因的ORF片段，插入質(zhì)粒pYD1的相應(yīng)位點(diǎn)。以上構(gòu)建所得中間載體稱為pFlo1。

表1 重組菌株及展示載體特征Table 1 Relevant features of recombinant strains and plasmids used in this study

根據(jù)T. reesei的EGII與CBHII基因序列和A. aculeatus的BGLI基因序列設(shè)計(jì)引物，分別以已構(gòu)建好的質(zhì)粒pEGII (EBNA)、pCBHII (EBNA)、pBGLI (NB)為模板，通過(guò)PCR的方法擴(kuò)增獲得egl2與cbh2及bgl1去除本身信號(hào)肽的成熟區(qū)域。將由KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切得到的egl2片段插入到pYD1的相應(yīng)位點(diǎn)之間，獲得的最終表達(dá)載體命名為pEGII (KB)；將由KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切的cbh2片段替換掉pEGII (KB)的egl2得到表達(dá)載體pCBHII (KB)；將NotⅠ/SphⅠ雙酶切得到的bgl1片段插入到pYD1的相應(yīng)位點(diǎn)之間，獲得表達(dá)載體pBGLI (NS)。篩選獲得重組質(zhì)粒陽(yáng)性克隆，并進(jìn)行測(cè)序和鑒定。

本研究中使用的引物序列及對(duì)應(yīng)酶切位點(diǎn)見表2。

1.2.2 酵母轉(zhuǎn)化及篩選

將測(cè)序結(jié)果正確的表面展示載體pEGII(KB)、pCBHII(KB)、pBGLI(NS)利用LiAc完整細(xì)胞法[17]分別轉(zhuǎn)化Y5，轉(zhuǎn)化后在含不同濃度G418 (500 μg/mL、600 μg/mL和700 μg/mL)的YPD平板上篩選得到轉(zhuǎn)化子。挑取單克隆進(jìn)行細(xì)胞的擴(kuò)大培養(yǎng)，分別提取酵母質(zhì)粒作為模板，進(jìn)行PCR驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序正確后，將陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子分別命名為Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI。

1.2.3 表面展示蛋白的定位驗(yàn)證

參照文獻(xiàn)[18]進(jìn)行：取經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)48 h的重組酵母菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI，以Y5為陰性對(duì)照，進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。樣品經(jīng)1×PBS溶液洗滌后，取沉淀懸浮于250 μL的1×PBS、1 mg/mL BSA中，抗Xpress標(biāo)簽的小鼠單克隆抗體 (Invitrogen anti-Xpress mouse monoclonal IgG 按體積比1∶1 000稀釋加入)，室溫放置1.5 h，每隔15 min輕微振蕩1次。1×PBS離心洗滌若干次后，加入1×PBS、1 mg/mL BSA和異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的山羊抗鼠源的二抗 (Jackson, FITC-conjugated goat anti-mouse IgG(H+L)，按體積比1∶200稀釋加入)，在黑暗處放置1 h。離心，1×PBS洗滌2次后，在免疫熒光顯微鏡下觀察。

表2 引物序列及相應(yīng)酶切位點(diǎn)Table 2 Primer sequences and restriction sites used in this study

1.2.4 重組菌株酶活測(cè)定

菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI經(jīng)預(yù)培養(yǎng)后在YPG中誘導(dǎo)48 h，將1 mL菌液離心后取細(xì)胞沉淀用于酶活測(cè)定。酶活性測(cè)定采用DNS顯色法與pNPG顯色法[19]。

EGII活性測(cè)定方法如下：以2 mL 1% (W/V)的CMC (50 mmol/L檸檬酸緩沖液 (pH 5.0) 配制) 為底物，50 ℃保溫3 min后，加入0.5 mL適當(dāng)稀釋的酶液50 ℃反應(yīng)30 min，再加入2.5 mL DNS沸水浴5 min，最后加蒸餾水定容至10 mL，在540 nm處測(cè)吸光值。對(duì)于CBHII活性測(cè)定，是以 2 mL 0.4% (W/V)的 PASC (50 mmol/L醋酸鈉緩沖液 (pH 5.0) 配制) 為底物，其他條件同EGII活性測(cè)定過(guò)程。一個(gè)EGII/CBHII活性單位定義為：每分鐘水解底物產(chǎn)生1 μmol/L 還原糖所需要的酶量[16]。

BGLI活性的測(cè)定方法如下：1 mL適當(dāng)稀釋的酶液與1 mL 1.7 mmol/L的對(duì)硝基苯-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG)溶液 (0.1 mmol/L醋酸鈉溶液配制，pH 5.0) 混合后，于37 ℃下保溫10 min后，立即加入2 mL 1 mol/L Na2CO3，添加蒸餾水定容至10 mL，搖勻，在400 nm下測(cè)定吸光度。一個(gè)BGLI活力單位定義為：每分鐘水解生成1 μmol/L對(duì)硝基苯酚所需要的酶量[20]。

1.2.5 單展示菌群的纖維素乙醇發(fā)酵

重組菌株經(jīng)預(yù)培養(yǎng)，誘導(dǎo)48 h后，將菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI按1∶1∶1混合為單展示酵母菌群，重懸于100 mL YP-PASC培養(yǎng)基中，總的酵母菌群細(xì)胞量為30 g/L濕重，于30 ℃、150 r/min條件下進(jìn)行纖維素乙醇發(fā)酵。發(fā)酵起初每隔4 h取樣1次，12 h后每隔12 h取樣1次，連續(xù)取樣108 h。測(cè)定發(fā)酵樣品總糖、葡萄糖和乙醇濃度。總糖測(cè)定采用苯酚-硫酸法[18]；葡萄糖濃度以高效液相色譜(HPLC, 安捷倫1260) 測(cè)定，條件：H(Hi-Plex H)柱 (300 mm×7.7 mm)，柱60 ℃，示差檢測(cè)器RID，檢測(cè)器溫度40 ℃，流動(dòng)相稀硫酸 (0.005 mol/L)，流速0.6 mL/min，進(jìn)樣量5 μL。乙醇濃度以氣相色譜 (GC，安捷倫7890A GC；HS，model Agilent 7694E) 測(cè)定，條件：色譜柱為HJ-PEG-20M，柱溫120 ℃，檢測(cè)器溫度200 ℃，N2為載氣，流速4 mL/min，樣品離心后過(guò)濾除菌 (濾頭規(guī)格13 mm、0.22 μm)，自動(dòng)進(jìn)樣1 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 絮凝素系統(tǒng)所需基因的獲得

以S. cerevisiae Y5的cDNA為模板，利用設(shè)計(jì)的引物擴(kuò)增MF.SS和FLO1基因 (含MAT終止子) 的有效編碼序列，大小分別為282 bp和1 351 bp。PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證，分別在282 bp與1 351 bp處顯示清晰明亮條帶 (圖1A, B)；根據(jù)質(zhì)粒YIP5-KanR的序列特點(diǎn)，kanr兩端的啟動(dòng)子和終止子序列互補(bǔ)性較高，較難一步擴(kuò)增得到kanr的全長(zhǎng)序列，設(shè)計(jì)引物時(shí)人工去除kanr基因的終止子部分，只擴(kuò)增該基因的ORF片段，大小為1 293 bp，kanr.ORF的PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳驗(yàn)證，在1 293 bp處顯示正確條帶(圖2C)；分別以T. reesei及A. aculeatus的cDNA為模板擴(kuò)增到EGII、CBHII與BGLI去除信號(hào)肽的編碼序列，大小分別為1 194 bp、1 341 bp和2 526 bp (圖1D, E, F)，經(jīng)電泳驗(yàn)證，PCR產(chǎn)物均在相應(yīng)位置顯示正確條帶。以上基因的測(cè)序結(jié)果表明，與NCBI公布的序列同源性均達(dá)到100%。

2.2 表面展示載體的構(gòu)建

表達(dá)載體pEGII (KB)、pCBHII (KB)和pBGLI (NS) 的構(gòu)建流程見圖2。

圖1 本研究所需的DNA片段Fig. 1 DNA fragments used in this study. Gene encoding for MF.SS (A), FLO1 (B), open reading frame of kanr (C), egl2 (D), cbh2 (E), bgl1 (F).

圖2 展示載體構(gòu)建示意圖Fig. 2 Plasmids for cell surface display.

將經(jīng)KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切的egl2片段與cbh2片段分別插入到酵母展示中間載體pFLO1相應(yīng)位點(diǎn)，獲得載體pEGII (KB)與pCBHII (KB)；再利用NotⅠ/SphⅠ雙酶切得到bgl1片段，該片段插入中間載體pFLO1相應(yīng)位點(diǎn)獲得載體pBGLI (NS)。以KpnⅠ單酶切驗(yàn)證，pEGII (KB)與pCBHII (KB)大小分別為8 776 bp和8 923 bp，以NotⅠ單酶切驗(yàn)證，pBGLI (NS)的大小為10 109 bp，以上單酶切結(jié)果均與理論值相符 (圖3A)；再以KpnⅠ/BamHⅠ雙酶切驗(yàn)證，分別切下大小為7 937 bp的pFLO1片段和1 194 bp的egl2片段與1 341 bp的cbh2片段，以NotⅠ/SphⅠ雙酶切驗(yàn)證，分別切下大小為7 937 bp的pFLO1片段和2 526 bp的bgl1，以上雙酶切結(jié)果均符合理論值 (圖3B)。測(cè)序結(jié)果表明所有插入片段在表達(dá)載體中均有正確的閱讀框。

圖3 重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig. 3 Recombinant plasmids digested with restriction enzyme. (A) KpnⅠ, NotⅠ. (B) KpnⅠ/BamHⅠ, NotⅠ/SphⅠ.

2.3 酵母轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化子驗(yàn)證

表達(dá)載體pEGII (KB)、pCBHII (KB)與pBGLI (NS)通過(guò)LiAc完整細(xì)胞轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化到S. cerevisiae Y5中，涂布于含G418的YPD固體培養(yǎng)基上得到轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取篩選得到的轉(zhuǎn)化子單菌落預(yù)培養(yǎng)24 h后依次進(jìn)行質(zhì)粒提取，分別以質(zhì)粒作為模板進(jìn)行PCR，通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的正確性。結(jié)果如圖4所示，重組菌株Y5/fEGII的質(zhì)粒擴(kuò)增出大小為1 194 bp的特異性條帶；菌株Y5/fCBHII的質(zhì)粒擴(kuò)增出大小為1 341 bp的特異性條帶；菌株Y5/fBGLI的質(zhì)粒擴(kuò)增出大小為2 526 bp的特異性條帶。三株重組菌株均擴(kuò)增得到目的基因片段egl2、cbh2、bgl1。測(cè)序結(jié)果表明，三段PCR產(chǎn)物的序列正確性均達(dá)100%，表明纖維素酶表達(dá)載體已成功導(dǎo)入到酵母中。

2.4 表面展示蛋白定位驗(yàn)證

挑取經(jīng)鑒定正確的重組菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII、Y5/fBGLI和對(duì)照菌株Y5分別接種至中預(yù)培養(yǎng)24 h，收集菌體后，轉(zhuǎn)接YPG培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。重組菌株誘導(dǎo)表達(dá)48 h后，采用免疫熒光顯微鏡 (FITC，激發(fā)波長(zhǎng)488 nm)觀察表面展示重組酵母菌株在半乳糖的誘導(dǎo)下是否能夠表達(dá)纖維素酶與Xpress標(biāo)簽形成融合蛋白展示在細(xì)胞表面。由圖5觀察結(jié)果顯示，在488 nm通道下，表面展示重組酵母菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI在誘導(dǎo)表達(dá)48 h后均可以檢測(cè)到綠色免疫熒光，野生菌株Y5沒(méi)有觀察到熒光。該結(jié)果表明來(lái)自釀酒酵母Y5的GPI蛋白可作為表面展示的錨定蛋白，帶有Xpress標(biāo)簽的外源蛋白EGII、CBHII及BGLI均已經(jīng)成功被錨定在細(xì)胞壁上。盡管重組菌株的表面展示蛋白分布是不均勻的，這可能是由于蛋白的表達(dá)水平不同造成的。

2.5 表面展示纖維素酶的酶活分析

圖4 重組菌株的質(zhì)粒PCR鑒定Fig. 4 Identification of recombinant strains by plasmid PCR.

圖5 重組菌株Y5/fEG II、Y5/CBH II和Y5/BGLI免疫熒光驗(yàn)證 (100×)Fig. 5 Immunofluorescence labeling of transformants ZEISS Laser Scan Confocal micrographs (column 1) and immunofluorescence micrograph (column 2) of S. cerevisiae Y5/FEG II, Y5/fCBH II and Y5/fBGL I (100×).

表3 展示在Y5細(xì)胞表面的纖維素酶活性測(cè)定Table 3 Activity of enzymes displayed on cell surface of Y5 strain

對(duì)照菌株Y5與單展示纖維素酶的3株重組菌Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI經(jīng)預(yù)培養(yǎng)24 h后接種于YPG培養(yǎng)基誘導(dǎo)48 h。Y5為對(duì)照組，3株重組菌為實(shí)驗(yàn)組。經(jīng)誘導(dǎo)后，取一定量菌液進(jìn)行酶活測(cè)定。測(cè)定結(jié)果如表3所示，對(duì)照菌株Y5酶活性不足0.1 U/mL；實(shí)驗(yàn)組菌株均表現(xiàn)出一定酶活性，證明纖維素酶成功展示在Y5表面。EGII和CBHII活性較高，分別為1.401 U/mL和1.845 U/mL，絮凝素表面展示系統(tǒng)中這兩種纖維素酶的活性均比本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的凝集素表面展示系統(tǒng)的重組菌株Y5/EGII的EGII酶活 (1.144 U/mL) 和Y5/CBHII的CBHII酶活 (1.265 U/mL) 稍高，菌株Y5/fBGLI的活性較低，為0.81 U/mL，與凝集素表面展示系統(tǒng)的重組菌株Y5/BGLI的BGLI酶活0.722 U/mL相近[15]。分析原因是絮凝素表面展示系統(tǒng)可根據(jù)酶活性末端來(lái)調(diào)節(jié)錨定區(qū)域以發(fā)揮展示酶類的最優(yōu)活性，所以纖維素酶在絮凝素展示系統(tǒng)中較凝集素展示系統(tǒng)稍高。這些結(jié)果表明絮凝素展示系統(tǒng)中的纖維素酶EGII、CBHI和BGLI都已成功展示釀酒酵母Y5表面，并且具有一定的功能活性。

求解水電站日負(fù)荷優(yōu)化分配的混合整數(shù)非線性規(guī)劃模型//申建建,張秀飛,王健,程春田,李秀峰//(19):34

2.6 重組酵母菌群的纖維素乙醇發(fā)酵

以10 g/L PASC為唯一碳源，對(duì)照菌群Y5為對(duì)照組，混合菌群 (Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI按1∶1∶1組合) 為實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行纖維素乙醇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。菌株經(jīng)預(yù)培養(yǎng)24 h后接種于100 mL的YP-PASC發(fā)酵培養(yǎng)基中30 ℃連續(xù)發(fā)酵108 h。結(jié)果如圖6所示，對(duì)照組不能降解PASC，體系中的總糖基本不消耗，沒(méi)有乙醇的產(chǎn)生；實(shí)驗(yàn)組能水解PASC并產(chǎn)生一定量的乙醇，前48 h菌群生長(zhǎng)較快 (數(shù)據(jù)未展示)，體系中的總糖消耗迅速，乙醇產(chǎn)量快速上升，48 h后菌群生長(zhǎng)速度減慢，總糖消耗速度下降，乙醇產(chǎn)量積累也減緩，在發(fā)酵96 h后達(dá)到最高乙醇濃度0.77 g/L，以消耗每克糖生成的乙醇量計(jì)算，產(chǎn)量為0.35 g/g，相當(dāng)于理論值的68.6%。盡管最終的乙醇產(chǎn)量并不理想，最高僅達(dá)到了理論值的68.6%，與本實(shí)驗(yàn)室已構(gòu)建的凝集素系統(tǒng)的單展示混合菌群 (Y5/EGII、Y5/CBHII和Y5/BGLI按1∶1∶1組合) 的乙醇產(chǎn)量0.32 g/g，相當(dāng)于理論值的62.6%這個(gè)結(jié)果相比，基于絮凝素系統(tǒng)的纖維素乙醇發(fā)酵的產(chǎn)量有所上升，取得了一定的進(jìn)步。

圖6 不同酵母菌群以PASC為唯一碳源的乙醇發(fā)酵Fig. 6 Ethanol production from PASC by different yeast consortium. The concentrations of total sugar (A) and ethanol (B). Data are averages from three independent experiments.

3 討論

本研究基于釀酒酵母絮凝素表面展示系統(tǒng)，利用S. cerevisiae Y5內(nèi)源蛋白Flo1p作為錨定蛋白，將外源纖維素酶EGII、CBHII和BGLI以較優(yōu)的活性形式分別固定在S. cerevisiae Y5細(xì)胞表面，并以PASC為唯一碳源進(jìn)行了纖維素乙醇生物統(tǒng)合加工的初步研究。研究結(jié)果顯示，基于Y5的重組菌株均具有相應(yīng)的纖維素催化活性，酶活測(cè)定結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)室前期a-凝集素表面展示纖維素酶活性相比，有了較為明顯的提升。分析原因，Y5本身具有自絮凝的工業(yè)化生產(chǎn)特性，使得細(xì)胞之間接觸緊密，空間位阻較大，一定程度上阻礙了纖維素酶與底物的接觸吸附[22]，而新型的絮凝素表面展示系統(tǒng)利用Flo1p進(jìn)行纖維素酶的錨定，一定程度上減輕了酵母的自絮凝現(xiàn)象，增大了細(xì)胞間隙，從而增加了酶與底物的接觸面積，提高了酶的催化效率。此外，發(fā)酵結(jié)果顯示，絮凝素系統(tǒng)的重組酵母菌株Y5/fEGII、Y5/fCBHII和Y5/fBGLI以1∶1∶1的比例組成菌群后，對(duì)PASC具有明顯的降解利用能力，反應(yīng)體系中未檢測(cè)出葡萄糖積累，說(shuō)明降解得到的葡萄糖迅速被酵母吸收利用產(chǎn)生乙醇，最高乙醇濃度達(dá)到0.77 g/L，乙醇產(chǎn)量為0.35 g/g，相當(dāng)于最高理論值的68.6%，與本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的a-凝集素表面展示纖維素酶菌群最優(yōu)發(fā)酵結(jié)果 (菌群比例2∶1∶1，最高乙醇濃度達(dá)到0.76 g/L，乙醇產(chǎn)量為0.33 g/g，相當(dāng)于理論值的64.9%) 相比，絮凝素表面展示系統(tǒng)體現(xiàn)出了一定的優(yōu)勢(shì)。這是本實(shí)驗(yàn)室首次嘗試基于專利菌株Y5構(gòu)建絮凝素表面展示系統(tǒng)進(jìn)行纖維素水解與乙醇發(fā)酵生物聯(lián)合加工研究，以上結(jié)果說(shuō)明，利用絮凝素展示系統(tǒng)表達(dá)外源纖維素酶進(jìn)行纖維素乙醇發(fā)酵具有一定的發(fā)展前景，為開發(fā)生物統(tǒng)和加工 (Consolidated bioprocess，CBP) 菌種提供了理論依據(jù)，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。此外，本研究構(gòu)建的酵母菌群系統(tǒng)通過(guò)調(diào)節(jié)菌群中不同組分的比例對(duì)纖維素水解及乙醇產(chǎn)量的影響來(lái)探究不同纖維素酶間的協(xié)同作用，該菌群系統(tǒng)可作為研究纖維素酶降解效率的有效工具。

即使如此，利用酵母表面展示技術(shù)表達(dá)纖維素酶的新型酵母菌群進(jìn)行纖維素乙醇發(fā)酵效果還不是很理想，乙醇產(chǎn)率較低，難以滿足實(shí)際生產(chǎn)需求，因此在今后的工作中，我們主要在以下兩個(gè)方面進(jìn)行改進(jìn)：1) 開發(fā)基于N-端錨定的表面展示工作[23]，完善釀酒酵母絮凝素表面展示系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)針對(duì)不同外源酶類靈活選擇錨定方式的目標(biāo)，盡可能降低對(duì)酶類的束縛，實(shí)現(xiàn)酶催化效率的最大化；2) 調(diào)控3種酵母菌群間的比例，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)3種協(xié)同作用纖維素酶之間比例的調(diào)控，摸索出最優(yōu)模式，利用優(yōu)化的菌群進(jìn)行纖維素乙醇統(tǒng)合生物加工，提高底物利用率，提升乙醇產(chǎn)量[24]。

利用釀酒酵母表面技術(shù)展示纖維素酶實(shí)現(xiàn)同步發(fā)酵纖維素產(chǎn)乙醇的研究已取得一定的研究成果，但是在這一領(lǐng)域里仍存在一些亟待解決的問(wèn)題，例如：展示在細(xì)胞表面的纖維素酶的活性與游離酶相比有所下降；成功展示的纖維素酶穩(wěn)定性有待提高；對(duì)于該技術(shù)的研究目前仍停留在實(shí)驗(yàn)室階段，還未實(shí)現(xiàn)工業(yè)化等[25-26]。今后此領(lǐng)域的研究還需更多的發(fā)展和完善，包括開發(fā)更多具有固定化展示功能的細(xì)胞壁甘露糖蛋白；進(jìn)一步提高現(xiàn)有展示的纖維素酶的穩(wěn)定性、表達(dá)量及活性；克服工業(yè)化生產(chǎn)中擴(kuò)大培養(yǎng)、乙醇抑制等難題。

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(本文責(zé)編 郝麗芳)

Display cellulolytic enzymes on Saccharomyces cerevisiae cell surface by using Flo1p as an anchor protein for cellulosic ethanol production

Chunling Mo, Yueyue Yang, Ning Chen, Xiushan Yang, and Shen Tian
College of Life Science, Capital Normal University, Beijing 100048, China

In this study, we constructed a yeast consortium surface-display expression system by using Flo1 as an anchor protein. Endoglucanase II (EGII) and cellobiohydrolase II (CBHII) from Trichoderma reesei, and β-glucosidase 1 (BGLI) from Aspergillus aculeatus were immobilized on Saccharomyces cerevisiae Y5. We constructed the cellulose-displaying expression yeast consortium (Y5/fEGII:Y5/fCBHII:Y5/fBGLI=1:1:1) and investigated the enzymatic ability and ethanol fermentation. The displayed cellulolytic enzymes was stabile during the 96-h fermentation. The yeast consortium produced 0.77 g/L ethanol from 10 g/L phosphoric acid swollen cellulose (PASC) within 96 h. The yield (in grams of ethanol produced per gram of carbohydrate consumed) was 0.35 g/g, which correspond to 68.6% of the theoretical yield.

cell surface display, Flo1 protein, yeast consortium, cellulosic ethanol

December 3, 2013; Accepted: January 7, 2014

Shen Tian. Tel: +86-10-68902330; E-mail: cnu_tianshen@sina.com

Supported by: National Science and Technology Support Plan (No. 2013BAD22B03), National Natural Science Foundation of China (No. 31100578), Key Project of Beijing Scientific Research Plan (No. KZ201310028034).

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No. 2013BAD22B03)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31100578)，北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No. KZ201310028034) 資助。

Received: December 3, 2013; Accepted: January 7, 2014

Supported by: National Science and Technology Support Plan (No. 2013BAD22B03), National Natural Science Foundation of China (No. 31100578), Key Project of Beijing Scientific Research Plan (No. KZ201310028034).

Corresponding author: Shen Tian. Tel: +86-10-68902330; E-mail: cnu_tianshen@sina.com

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No. 2013BAD22B03)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31100578)，北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No. KZ201310028034) 資助。

Received: December 3, 2013; Accepted: January 7, 2014

Supported by: National Science and Technology Support Plan (No. 2013BAD22B03), National Natural Science Foundation of China (No. 31100578), Key Project of Beijing Scientific Research Plan (No. KZ201310028034).

Corresponding author: Shen Tian. Tel: +86-10-68902330; E-mail: cnu_tianshen@sina.com

國(guó)家科技支撐計(jì)劃(No. 2013BAD22B03)，國(guó)家自然科學(xué)基金(No. 31100578)，北京市教育委員會(huì)科技計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目(No. KZ201310028034) 資助。