耐熱鏈霉菌4″-O-異戊酰基轉(zhuǎn)移酶基因在變鉛青鏈霉菌TK24中的表達(dá)

張家瑚，鐘晶晶，戴劍漉，王以光，夏煥章，赫衛(wèi)清

1 沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016

2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 衛(wèi)生部抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

耐熱鏈霉菌4″-O-異戊?；D(zhuǎn)移酶基因在變鉛青鏈霉菌TK24中的表達(dá)

張家瑚1，鐘晶晶2，戴劍漉2，王以光2，夏煥章1，赫衛(wèi)清2

1 沈陽(yáng)藥科大學(xué)生命科學(xué)與生物制藥學(xué)院，遼寧 沈陽(yáng) 110016

2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)醫(yī)藥生物技術(shù)研究所 衛(wèi)生部抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050

張家瑚, 鐘晶晶, 戴劍漉, 等. 耐熱鏈霉菌4″-O-異戊酰基轉(zhuǎn)移酶基因在變鉛青鏈霉菌TK24中的表達(dá). 生物工程學(xué)報(bào), 2014, 30(9): 1390–1400.

Zhang JH, Zhong JJ, Dai JL, et al. Expression of 4"-O-isovaleryltransferase gene from Streptomyces thermotolerans in Streptomyces lividans TK24. Chin J Biotech, 2014, 30(9): 1390–1400.

擬研究異源調(diào)控系統(tǒng)提高耐熱鏈霉菌Streptomyces thermotolerans 4″-O-異戊酰基轉(zhuǎn)移酶基因 (ist) 表達(dá)的可能性。在麥迪霉素產(chǎn)生菌Streptomyces mycarofaciens 1748中曾克隆到BamHⅠ～8.0 kb片段，含此基因片段的變鉛青鏈霉菌TK24 Streptomyces lividans TK24轉(zhuǎn)化子可將螺旋霉素高效轉(zhuǎn)化為丙酰螺旋霉素。序列分析表明此片段除包含麥迪霉素4″-O-丙?；D(zhuǎn)移酶基因 (mpt) 外還存在與其連鎖的兩個(gè)正調(diào)控基因orf27和orf28。將這個(gè)基因簇中mpt基因的orf替換為ist基因的orf，然后與兩個(gè)正調(diào)控基因或者單獨(dú)一個(gè)orf27連接，將這些構(gòu)建好的片段分別克隆到中等拷貝數(shù)及高拷貝數(shù)載體pKC1139和pWHM3上，再轉(zhuǎn)化到S. lividans TK24中。通過測(cè)定S. lividans TK24轉(zhuǎn)化子中螺旋霉素生物轉(zhuǎn)化為4″-O-?；菪顾氐漠a(chǎn)率來(lái)評(píng)價(jià)mpt和ist基因的表達(dá)水平。結(jié)果表明只有高拷貝載體pWHM3構(gòu)建的重組質(zhì)粒S. lividans TK24轉(zhuǎn)化子中才能明顯檢測(cè)到4″-O-異戊酰螺旋霉素的產(chǎn)生。mpt基因的正調(diào)節(jié)系統(tǒng)可以提高ist基因的表達(dá)水平，含兩個(gè)調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)化子轉(zhuǎn)化效率高于含單一調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)化子。

螺旋霉素，4″-O-?；D(zhuǎn)移酶基因，正調(diào)控基因，異源表達(dá)

碳霉素、麥迪霉素、泰樂菌素和螺旋霉素均為結(jié)構(gòu)十分相似的16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素(圖1)，除了碳霉素以外，它們均廣泛應(yīng)用于臨床或畜牧業(yè)[1-4]。16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯如螺旋霉素在胃腸道中的穩(wěn)定性好，組織分布廣，體內(nèi)持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，無(wú)其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素所致的肝損害，對(duì)胃腸道的反應(yīng)比14元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類少[5]。對(duì)16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素構(gòu)效關(guān)系的研究表明，碳霉糖4″位親脂?；鶊F(tuán)對(duì)于分子向細(xì)胞的滲透有重要作用，而增加?；兼湹拈L(zhǎng)度可以提高其親脂性，并提高其在體內(nèi)的抗菌活性[6-7]。日本學(xué)者Okamoto先后利用碳霉素產(chǎn)生菌Streptomyces thermotolerans內(nèi)酯環(huán)合成阻斷變株或克隆4″-O-異戊?；D(zhuǎn)移酶基因(4"-O-isovaleryltransferase gene, ist)，轉(zhuǎn)化或在泰樂菌素產(chǎn)生菌中表達(dá)均獲得了4″-O-酰基化泰樂菌素[8-9]。本實(shí)驗(yàn)室在1994年從我國(guó)自主分離的麥迪霉素產(chǎn)生菌Streptomyces mycarofaciens1748中克隆了麥迪霉素4″-O-丙酰基轉(zhuǎn)移酶基因(Midecamycin 4″-O-propionyltransferase gene, mpt)，并在螺旋霉素產(chǎn)生菌Streptomyces spiramyceticus中表達(dá)，首次獲得了基因工程技術(shù)制造的新抗生素丙酰螺旋霉素[10-11]。藥效學(xué)研究證明其體內(nèi)外活性均優(yōu)于螺旋霉素[12]。繼而克隆出S. thermotolerans中的ist基因，并在S. spiramyceticus中表達(dá)，獲得了基因工程必特螺旋霉素 (現(xiàn)在的商品名為可利霉素)產(chǎn)生菌[13]，研究證實(shí)螺旋霉素在4″位的異戊酰化更加增強(qiáng)其親脂性，從而增加其組織濃度和體內(nèi)抗菌活性[14]，可利霉素已經(jīng)完成Ⅲ期臨床試驗(yàn)，目前已進(jìn)入新藥證書待批階段。

圖1 16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯類抗生素Fig. 1 16 membered macrolide antibiotics.

在鏈霉菌的抗生素生物合成基因簇中常包含一個(gè)或多個(gè)途徑特異性調(diào)控基因，它們一般調(diào)控一種抗生素或幾種具有共同生物合成途徑的抗生素的生物合成，這些途徑特異性調(diào)控基因還受到其他調(diào)控基因的調(diào)控，通過改造這些調(diào)控基因可以提高抗生素的產(chǎn)量[15-17]。原來(lái)研究發(fā)現(xiàn)從S. mycarofaciens 1748中克隆的BamHⅠ ～8.0 kb片段含有mpt基因，而從S. thermotolerans中克隆的ist基因位于BamHⅠ～2.3 kb片段中，mpt基因與ist基因都是編碼催化16元環(huán)大環(huán)內(nèi)酯4″-O-?；D(zhuǎn)移酶，二者在蛋白序列上有70%的一致性，但mpt在S. lividans TK24中的表達(dá)效果較好，推測(cè)在BamHⅠ～8.0 kb序列中存在mpt的正調(diào)控基因[10]。文中將分析S. mycarofaciens 1748中含mpt的BamHⅠ～8.0 kb片段的基因信息，并探索在S. lividans TK24中利用mpt的調(diào)控基因提高ist基因表達(dá)的可能性，為構(gòu)建新的必特螺旋霉素基因工程菌奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種、基因和載體

S. lividans TK24為異源表達(dá)宿主，本實(shí)驗(yàn)室保存。大腸桿菌Escherichia coli DH5α感受態(tài)細(xì)胞，基因克隆和重組質(zhì)粒構(gòu)建受體菌，購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司。pKC1139溫敏型鏈霉菌/大腸埃希菌穿梭載體，pWHM3鏈霉菌/大腸埃希菌穿梭高拷貝載體，pUC19重組質(zhì)粒構(gòu)建載體，本實(shí)驗(yàn)室保存。pSW4質(zhì)粒攜帶有從S. thermotolerans 中克隆的含ist基因BamHⅠ～2.3 kb片段[13]，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。pWF5質(zhì)粒含mpt基因的BamHⅠ～8.0 kb片段[10]，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建。pKC-e-ist-ist質(zhì)粒含鏈霉菌中組成型啟動(dòng)子PermE*和兩個(gè)連鎖的ist基因，本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[18]。

1.1.2 試劑

螺旋霉素購(gòu)自河南天方藥業(yè)股份有限公司，主要組分為螺旋霉素Ⅱ (SPⅡ) 和螺旋霉素Ⅲ(SP Ⅲ)。必特螺旋霉素對(duì)照品，本實(shí)驗(yàn)室自制，主要組分為4″-異戊酰螺旋霉素 (Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)。阿普拉霉素 (Apramycin, Am) 購(gòu)自武漢遠(yuǎn)城科技發(fā)展有限公司。限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶購(gòu)自TaKaRa公司。KOD Taq DNA聚合酶購(gòu)自北京天佑恒遠(yuǎn)生物科技有限公司。TLC硅膠板(GF254) 購(gòu)自山東煙臺(tái)吉德精化工有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基

MY固體培養(yǎng)基 (100 mL)：酵母提取物0.4 g，麥芽提取物1.0 g，葡萄糖0.4 g，瓊脂粉1.5 g；用于S. lividans TK24的固體培養(yǎng)。含有重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)在培養(yǎng)基中加入終濃度為50 μg/mL的Am。

R2YE培養(yǎng)基配方見文獻(xiàn)[19]，用于S. lividans TK24原生質(zhì)體的制備和再生。

生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基 (100 mL)：淀粉2.0 g，葡萄糖2.0 g，硫酸銨0.3 g，酵母粉0.5 g，黃豆餅粉1.0 g，磷酸二氫鉀0.05 g，MgSO4·7H2O 0.02 g，碳酸鈣0.5 g。

1.2 方法

1.2.1 分子克隆

PCR產(chǎn)物純化，限制性酶切，DNA連接反應(yīng)，轉(zhuǎn)化和重組質(zhì)粒篩選，按照文獻(xiàn)[20]進(jìn)行。將pWF5質(zhì)粒上的BamHⅠ～8.0 kb片段亞克隆到pUC19載體，利用M13通用引物在中美泰和生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.2.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

利用SalⅠ酶切 (圖2) pUC19重組質(zhì)粒中BamHⅠ～8.0 kb外源片段，回收4.2 kb片段，此SalⅠ片段只包含orf27 (acyB2同源基因) 和mpt連鎖基因，將其克隆至pUC19載體，再用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切，亞克隆至pKC1139或者pWHM3載體上獲得重組質(zhì)粒pKC-orf27-mpt或者pWH-orf27-mpt。

根據(jù)ist基因的核苷酸序列 (GenBank Accession No. D31821.1) 設(shè)計(jì)PCR引物 (表1)。上游引物為ist-F，在5'端加上mpt基因起始密碼子上游相鄰的50 bp堿基；下游引物為ist-R，在5'端加上mpt基因終止密碼子下游相鄰的50 bp堿基。以pSW4質(zhì)粒為模板，通過PCR得到包含mpt基因orf上下游各50 bp序列的ist基因片段，在重疊PCR中當(dāng)作其中一個(gè)模板 (圖3)。以pUC19-8.0 kb質(zhì)粒為DNA模板，利用orf27上下游基因序列引物mpt-LF和mpt-LR擴(kuò)增出1.6 kb的PCR產(chǎn)物 (mpt-L)，包含orf27基因和mpt基因起始密碼子之前序列。利用mpt基因下游引物mpt-RF和mpt-RR擴(kuò)增出250 bp的PCR產(chǎn)物 (mpt-R)，包含了mpt基因的下游終止區(qū)序列。再以mpt-L片段、mpt-R片段和帶有50 bp同源臂的ist-orf為模板，用mpt-LF和mpt-RR為引物，利用重疊PCR反應(yīng)得到3.0 kb產(chǎn)物，這樣就將mpt基因的orf替換為ist基因的orf，并直接使ist基因位于orf27基因的下游。將PCR產(chǎn)物克隆至pUC19載體，測(cè)序驗(yàn)證后，再分別亞克隆到pKC1139和pWHM3載體上得到重組質(zhì)粒pKC-orf27-ist和pWH-orf27-ist。

用ScaⅠ酶切BamHⅠ～8.0 kb外源片段 (圖2)，回收3.9 kb片段，此片段包含orf28基因和部分orf27序列，將orf27-ist外源片段也用ScaⅠ酶切，回收2.0 kb片段，連接3.9 kb和2.0 kb片段得到orf28-orf27-ist連鎖基因，將此片段通過BamHⅠ和Hind Ⅲ位點(diǎn)連接到pKC1139和pWHM3載體上獲得重組質(zhì)粒pKC-orf28-orf27-ist和pWH-orf28-orf27-ist。

本實(shí)驗(yàn)室原來(lái)構(gòu)建的pKC-e-ist-ist質(zhì)粒帶有PermE*啟動(dòng)子和兩個(gè)連鎖的ist基因，利用EcoRⅠ和XbaⅠ酶切可以獲得PermE*啟動(dòng)子和一個(gè)ist基因，將此片段亞克隆到pWHM3載體的相同位點(diǎn)得到質(zhì)粒pWH-PermE*-ist，此質(zhì)粒作為ist基因表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照。

1.2.3 S. lividans TK24原生質(zhì)體制備和轉(zhuǎn)化具體操作按文獻(xiàn)[19]進(jìn)行。

1.2.4 生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物檢測(cè)

S. lividans TK24轉(zhuǎn)化子在含Am (50 μg/mL)的MY平板上28 ℃培養(yǎng)6–8 d，挖塊至生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基 (50 mL生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)基/500 mL三角瓶)，每種轉(zhuǎn)化子各接3瓶，28 ℃振蕩 (200 r/min)培養(yǎng)48 h，加入螺旋霉素至終濃度50 μg/mL，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，離心取10 mL上清液，用NaOH (1.0 mol/L)調(diào)至pH 8.5–9.0，等體積乙酸乙酯萃取，萃取液等分兩份，室溫吹干。一份溶于100 μL乙酸乙酯，用于TLC檢測(cè)，展開劑為乙酸乙酯：環(huán)己烷：丙酮：氨水=5∶5∶1∶0.1 (V/V)；碘熏顯跡；另一份溶于300 μL甲醇，取4 μL進(jìn)行HPLC檢測(cè) (日本島津高效液相色譜儀，LC-10ATvp CLASS-VP V6.10)，色譜柱為Kromasil C18 4.6 mm×150 mm，流動(dòng)相為乙腈/10 mmol/L乙酸銨溶液 (50/50)，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)231 nm。LC-MS (美國(guó)Thermo公司LTQ型液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀) 檢測(cè)在本所儀器室進(jìn)行，質(zhì)譜條件：ESI源；正離子檢測(cè)；鞘氣 (N2) 流速0. 3 L/min；輔助氣 (He)流速0.1 L/min；源電壓4. 5 kV；毛細(xì)管溫度350 ℃；毛細(xì)管電壓4.5 V。

表1 本文所用的引物Table 1 Primers used in this study

圖2 調(diào)控基因在3種大環(huán)內(nèi)脂類抗生素生物合成基因簇中的位置Fig. 2 Organization of regulatory genes in biosynthetic gene clusters of three macrolide producers.

2 結(jié)果

2.1 S. myc arofaciens 1748克隆的BamHⅠ～8.0 kb片段測(cè)序結(jié)果與生物信息學(xué)分析

BamHⅠ～8.0 kb片段實(shí)際測(cè)序結(jié)果為8.9 kb，與Mido等[22]報(bào)道S. mycarofaciens中麥迪霉素生物合成基因簇 (GenBank Accession No. BD420675) 完全一致，位于其14 616 bp至23 507 bp之間，通過生物信息學(xué)分析其中包含orf28到orf23共6個(gè)基因，orf23是不完整的基因片段 (圖2)。從S. mycarofaciens 1748克隆的BamHⅠ8.9 kb片段中orf26是mpt基因，與之連鎖的是兩個(gè)調(diào)控基因orf27和orf28。orf25、orf24和orf23是與糖基合成相關(guān)基因，分別為dTDP-4-酮-6-脫氧葡萄糖-2,3-脫水酶基因、Ⅱ型硫酯酶基因和dTDP-葡萄糖-4,6-脫水酶基因。BlastP分析顯示S. mycarofaciens的Orf27與生二素鏈霉菌Streptomyces ambofaciens中Srm40在蛋白水平的同源性為68%，與S. thermotolerans中的AcyB2的同源性為70%。Orf28與S. ambofaciens中的SrmR的同源性為68%，在S. thermotolerans中至今尚無(wú)類似蛋白的報(bào)道。srm40和srmR均為螺旋霉素生物合成的正調(diào)控基因，并且這兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄處于級(jí)聯(lián)反應(yīng)系統(tǒng)，SrmR正調(diào)控srm40的轉(zhuǎn)錄，后者再激活螺旋霉素生物合成基因的轉(zhuǎn)錄[21,23]。推測(cè)orf27和orf28在麥迪霉素生物合成中起類似調(diào)控作用。但是orf27和orf28與4″-O-?；D(zhuǎn)移酶基因orf26 (mpt) 是連鎖的，而在S. ambofaciens中srmR和srm40是不連鎖的，相隔約22 kb (圖2)。類似的兩個(gè)調(diào)控基因還存在于其他大環(huán)內(nèi)酯類抗生素安哥拉霉素(GenBank Accession No. EU232693) 和薔薇霉素生物合成基因簇[24]。

圖3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建Fig. 3 Construction of the recombinant plasmids. → primer; a: mpt-LF; b: mpt-LR; c: mpt-RF; d: mpt-RR.

2.2 重組質(zhì)粒的異源表達(dá)和生物轉(zhuǎn)化

將按方法1.2.2構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法導(dǎo)入到S. lividans TK24中，經(jīng)Am抗性篩選獲得包含相應(yīng)重組質(zhì)粒的TK24轉(zhuǎn)化子：TK24 (pKC-orf27-mpt) 和TK24 (pWH-orf27-mpt)、TK24 (pKC-orf28-orf27-mpt) 和TK24 (pWH-orf28-orf27-mpt)、TK24 (pKC-orf27-ist) 和TK24 (pWH-orf27-ist)、TK24 (pKC-orf28-orf27-ist) 和TK24 (pWH-orf28-orf27-ist)。這些陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR方法確證后，再進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化螺旋霉素的檢測(cè)。TLC檢測(cè)表明，以pKC1139為載體構(gòu)建的4種重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，沒有發(fā)現(xiàn)Rf值類似于4″-O-異戊酰螺旋霉素的產(chǎn)物。而以pWHM3為載體構(gòu)建的4種重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化子，在其產(chǎn)物中都檢測(cè)到Rf值類似于4″-O-異戊酰螺旋霉素的產(chǎn)物 (圖4，泳道5–8所示)。

為了評(píng)價(jià)ist基因的表達(dá)情況，又構(gòu)建了TK24 (pWH-PermE*-ist) 轉(zhuǎn)化子作為ist基因表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照，通過HPLC檢測(cè)TK24 (pWH-PermE*-ist) 和其他轉(zhuǎn)化子中?；菪顾氐姆迕娣e，根據(jù)峰面積的大小估算ist基因的表達(dá)情況，每種轉(zhuǎn)化子重復(fù)3次取平均值，利用LC-MS測(cè)定典型生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的分子量和碎片峰，以確定其?；a(chǎn)物，結(jié)果見圖5和表2。

圖4 TLC檢測(cè)生物轉(zhuǎn)化螺旋霉素的產(chǎn)物Fig. 4 Detection of bio-transformation products of spiramycin by TLC. 1: spiramycin; 2: bitespiramycin; 3: TK24 (pWHM3); 4: TK24 (pWHM3) with addition of spiramyicn, as a control; 5: TK24 (pWH-orf27-ist); 6: TK24 (pWH-orf27-mpt); 7: TK24 (pWH-orf28-orf27-ist); 8: TK24 (pWH-orf28-orf27-mpt). A: 4"-O- isovalerylspiramycin ; ⅢB: 4"-O-isovalerylspiramycin;Ⅱ C: spiramycin ; D: Ⅲspiramycin.ⅡThe product with Rf value similar to 4"-O-isovalerylspiramycin.

圖5 HPLC檢測(cè)生物轉(zhuǎn)化螺旋霉素的產(chǎn)物Fig. 5 Detection of bio-transformation products of spiramycin by HPLC. (A) Bitespiramycin. (B) Spiramycin. (C) TK24 (pWHM3). (D) TK24 (pWH-PermE*-ist). (E) TK24 (pWH-orf27-mpt). (F) TK24 (pWH-orf28-orf27-mpt). (G) TK24 (pWH-orf27-ist). (H) TK24 (pWH-orf28-orf27-ist). 1: 4″-O-propionylspiramycin Ⅲ; 2: 4″-O-isobutyrylspiramycinⅡ; 3: 4″-O-isovalerylspiramycinⅠ; 4: 4″-O-isobutyrylspiramycin Ⅲ; 5: 4″-O-isovalerylspiramycinⅡ; 6: 4″-O-isovalerylspiramycin Ⅲ; 7: spiramycin Ⅰ; 8: spiramycin Ⅱ; 9: spiramycinⅢ.

表2 5種轉(zhuǎn)化子中4″-O-?；菪顾氐腍PLC峰面積Table 2 HPLC peak area of 4″-O-acylated spiramycins in the 5 transformants

以必特螺旋霉素標(biāo)準(zhǔn)品為對(duì)照，5種轉(zhuǎn)化子中的4″-O-酰化螺旋霉素都進(jìn)行了HPLC、LC-MS及其各自碎片峰的鑒定。產(chǎn)物1為4″-O-丙酰螺旋霉素Ⅲ，分子量為955.62，產(chǎn)物2為4″-O-異丁酰螺旋霉素Ⅱ，分子量和產(chǎn)物1一致為955.69，但二者的碎片峰不一樣，丙酰螺旋霉素Ⅲ的碎片峰為755.50、596.53和355.20，而異丁酰螺旋霉素Ⅱ的碎片峰為741.50、582.38和388.27。產(chǎn)物3、5和6分別是4″-O-異戊?；菪顾丌?、Ⅱ和Ⅲ，分子量分別為927.61、969.74和983.65。產(chǎn)物4是4″-O-異丁酰螺旋霉素Ⅲ，分子量為969.65，和產(chǎn)物5一致，但二者碎片峰有區(qū)別。與TK24 (pWH-PermE*-ist)相同，TK24 (pWH-orf27-ist)以及TK24 (pWH-orf28-orf27-ist) (圖5 G、H) 均可以將螺旋霉素轉(zhuǎn)化為4″-O-異戊?；菪顾丌?、Ⅱ和Ⅲ，也有少量丙酰和丁?；漠a(chǎn)物，而含兩個(gè)正調(diào)控基因的TK24 (pWH-orf28-orf27-ist) 比含單一調(diào)控基因的TK24 (pWH-orf27-ist) 轉(zhuǎn)化效率要高，總的4″-O-?；菪顾胤迕娣e大于含單一調(diào)控基因的轉(zhuǎn)化子，其轉(zhuǎn)化效率與TK24 (pWH-PermE*-ist)相當(dāng)。同樣，含兩個(gè)正調(diào)控基因的TK24 (pWH-orf28-orf27-mpt) 轉(zhuǎn)化效率也明顯高于TK24 (pWH-orf27-mpt) (圖5E、F)。

3 討論

在研制必特螺旋霉素時(shí)，將來(lái)自S. thermotolerans中的ist基因 (ist-BamHⅠ2.3 kb片段，圖2所示) 導(dǎo)入到S. spiramyceticus中，可以很容易檢測(cè)到4″-O-異戊酰螺旋霉素的產(chǎn)生，但將該片段通過pKC1139或pSET152等載體導(dǎo)入到S. lividans TK24中，其轉(zhuǎn)化子中卻很難檢測(cè)到4″位酰化的螺旋霉素。在ist基因前面加上強(qiáng)啟動(dòng)子PermE* 后才在S. lividans TK24中檢測(cè)到螺旋霉素的4″-O-異戊酰化的產(chǎn)物[18]。本研究表明，利用S. mycarofaciens1748中的正調(diào)控基因orf27和orf 28可以實(shí)現(xiàn)異源ist基因在S. lividans TK24中的表達(dá)，其轉(zhuǎn)化效率與組成型啟動(dòng)子調(diào)控下的ist基因相當(dāng)。而且無(wú)論是mpt基因還是ist基因在兩個(gè)調(diào)控基因存在時(shí)比在單個(gè)調(diào)控基因的情況下表達(dá)效率高。mpt和ist基因產(chǎn)物對(duì)底物有較大的寬容性，都能催化丙?；?、丁?；彤愇祯；鶎?duì)螺旋霉素4″位進(jìn)行?；皇荕pt傾向使用短鏈的丙?；蚨□＃鳬st更偏好長(zhǎng)鏈的異戊酰基。在本研究中采用mpt基因的orf替換為ist基因的orf，即利用mpt啟動(dòng)子對(duì)ist的異源表達(dá)進(jìn)行了初步研究。只有在RNA和蛋白表達(dá)水平深入研究不同調(diào)控蛋白對(duì)ist基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響，才能真正了解ist在異源宿主菌中的調(diào)控和表達(dá)情況。

李佳等[25]在測(cè)定一些強(qiáng)啟動(dòng)子，如PermE*或者Psf在不同鏈霉菌中表達(dá)活性時(shí)，發(fā)現(xiàn)S. lividans與天藍(lán)色鏈霉菌Streptomycescoelicolor和委內(nèi)瑞拉鏈霉菌Streptomyces venezuelae相比，S. lividans的表達(dá)活性最低，所以在變鉛青鏈霉菌中外源基因的表達(dá)量是偏低的。我們也發(fā)現(xiàn)ist基因在S. lividans TK24宿主中即使在正調(diào)控基因acyB2存在的條件下，其表達(dá)量也偏低，因此，采用不同拷貝數(shù)的質(zhì)粒載體明顯影響其表達(dá)效率。用復(fù)制子為pSG5型pKC1139載體構(gòu)建的重組載體，拷貝數(shù)在鏈霉菌中一般是20–50個(gè)之間，但在S. lividans TK24轉(zhuǎn)化子的產(chǎn)物中也只能檢測(cè)到微量螺旋霉素的4″?；a(chǎn)物。而采用高拷貝pWHM3載體構(gòu)建重組質(zhì)粒，其復(fù)制子是pIJ型，拷貝數(shù)40–300個(gè)，其轉(zhuǎn)化效率明顯提高。因此，可以看出ist基因在S. lividans TK24中的表達(dá)量比較低，下一步準(zhǔn)備將這些重組質(zhì)粒導(dǎo)入到螺旋霉素產(chǎn)生菌中，檢測(cè)這些轉(zhuǎn)化子中ist基因的表達(dá)情況，為構(gòu)建新型高產(chǎn)的必特螺旋霉素產(chǎn)生菌奠定基礎(chǔ)。

REFERENCES

[1] Bunnag C, Jareoncharsri P, Voraprayoon S, et al. Efficacy of spiramycin as an alternative to amoxicillin in the treatment of acute upper respiratory tract infections. Clin Drug Investig, 1998, 15(6): 461–466.

[2] Paquet C, Yudin MH. Toxoplasmosis in pregnancy: prevention, screening, and treatment. J Obstet Gynaecol Can, 2013, 35(1): 78–79.

[3] Mazzariol A, Koncan R, Vitali LA, et al. Activities of 16-membered ring macrolides and telithromycin against different genotypes of erythromycin-susceptible and erythromycinresistant Streptococcus pyogenes and Streptococcus pneumoniae. J Antimicrob Chemother, 2007, 59(6): 1171–1176.

[4] Corns SM, Ashlock DA, Bryden KM. Development of antibiotic regimens using graph based evolutionary algorithms. Biosystems, 2013, 114(3): 178–185.

[5] Rubinstein E, Kellern N. Spiramycin renaissance. J Antimicrob Chemother, 1998, 42: 572–576.

[6] Omura S, Sano H, Sunazuka T. Structure activity relationships of spiramycins. J Antimicrob Chemother, 1985, 16(Suppl A): 1–11.

[7] Sano M, Sunazuka T, Tanaka H, et al. Chemical modification of spiramycins VI. Synthesis and antibacterial activities of 3,3″-di-O-acyl-4″-O-sulfonyl and 3,3″-di-O-acyl-4″-O-alkyl derivatives of spiramycin I. J antibiot (Tokyo), 1985, 38: 1350–1358.

[8] Arisawa A, Kawamura N, Tsunekawa H, et al. Cloning and nucleotide sequences of two genes involved in the 4″-O-acylation of macrolide antibiotics from Streptomyces thermotolerans. Biosci Biotechnol Biochem, 1993, 57(12): 2020–2025.

[9] Arisawa A, Kawamura N, Narita T, et al. Direct fermentative production of acyltylosins by genetically-engineered strains of Streptomyces fradiae. J Antibiot (Tokyo), 1996, 49(4): 349–354.

[10] Wang YG, Jin LF, Xu XM, et al. A genetically engineered hybrid antibiotic propionyl spiramycin. Chin J Antibiot, 1994(2): 109–116 (in Chinese).王以光, 金蓮舫, 徐小敏，等. 基因工程丙酰螺旋霉素. 中國(guó)抗生素雜志, 1994(2): 109–116.

[11] Zhang XL, Wang YG. Stydies on midecamycin 4″-O-propionyltransferase gene structure. Acta Microbiol Sin, 1996, 36(6): 417–422 (in Chinese).張敘倫, 王以光. 麥迪霉素4″-O-丙?；D(zhuǎn)移酶(mpt) 基因結(jié)構(gòu)的研究. 微生物學(xué)報(bào), 1996, 36(6): 417–422.

[12] Chen HZ, Zhang WX, Lou RH, et al. Pharmacological study on propionylspiramycin. Chin J New Drags, 1992, 1(1): 11–15 (in Chinese).陳慧貞, 張偉新, 婁人慧, 等. 丙酰螺旋霉素的藥理研究. 中國(guó)新藥雜志, 1992, 1(1): 11–15.

[13] Shang GD, Dai JL, Wang YG. Construction of a stable bioengineered strain of Biotechmycin. Chin J Biotech, 1999, 15(2): 171–175 (in Chinese).尚廣東, 戴劍漉, 王以光. 生技霉素穩(wěn)定型基因工程菌的構(gòu)建. 生物工程學(xué)報(bào)，1999, 15(2): 171–175.

[14] Shi XG, Sun YM, Zhang YF, et al. Tissue distribution of bitespiramycin and spiramycin in rats. Acta Pharmacol Sin, 2004, 25(11): 1396–1401.

[15] Gilles PW, Kenneth JM. The regulation of the secondary metabolism of Streptomyces: new links and experimental advances. Nat Prod Rep, 2011, 28: 1311–1333.

[16] Aigle B, Corre C. Waking up Streptomyces secondary metabolism by constitutive expression of activators or genetic disruption of repressors. Methods Enzymol, 2012, 517: 343–366.

[17] Martín JF, Liras P. Engineering of regulatory cascades and networks controlling antibiotic biosynthesis in Streptomyces. Curr Opin Microbiol, 2010, 13(3): 263–273.

[18] Yang YH, He WQ, Li RF, et al. Incorporation of PermE*, a strong promoter, at 5'-upstream of 4″-isovaleryltransferase gene improves the bioconversion of spiramycin to 4″-isovaleryspiramycin in Streptomyces lividans TK24. Chin J Antibiot, 2010, 35(11): 826–830 (in Chinese).楊永紅, 赫衛(wèi)清, 李瑞芬, 等. 利用強(qiáng)啟動(dòng)子PermE*提高4″-異戊?；D(zhuǎn)移酶基因在變鉛青鏈霉菌TK24中對(duì)螺旋霉素的4″-異戊酰化水平.中國(guó)抗生素雜志, 2010, 35(11): 826–830.

[19] Tobias K, Bibb MJ, Mark JB. Practical Streptomyces Genetics. Norwich: The John Innes Foundation, 2000: 232–236.

[20] Sambrook J, Fritsh EF, Maniatis T. Molecular cloning: A Laboratory Manual. 2nd ed. New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989: 20–25.

[21] Fatma K, Emmanuelle D, Nathalie O, et al. Organization of the biosynthetic gene cluster for the macrolide antibiotic spiramycin in Streptomyces ambofaciens. Microbiology, 2007, 153: 4111–4122.

[22] Mido N, Hoshigo S, Murakami T. Medicamycin biosynthetic gene cluster: JP 2004049100-A/1. 2004-02-19.

[23] Karray F, Darbon E, Nguyen HC, et al. Regulation of the biosynthesis of the macrolide antibiotic spiramycin in Streptomyces ambofaciens. J Bacteriol, 2010, 192(21): 5813–5821.

[24] Farnet CM, Staffa A, Yang XS. Genes and proteins for the biosynthesis of rosaramicin: US 2003/0113874 A1. 2003-06-19.

[25] Li J, Xiang SH, Yang XS, et al. Evaluation of the activities of two promoters in Streptomycetes by reporter gene method. Acta Microbiol Sin, 2009, 49(11): 1454–1458 (in Chinese).李佳, 向四海, 楊秀山, 等. 報(bào)告基因法比較兩種放線菌啟動(dòng)子的活性. 微生物學(xué)報(bào), 2009, 49(11): 1454–1458.

(本文責(zé)編 郝麗芳)

Expression of 4″-O-isovaleryltransferase gene from Streptomyces thermotolerans in Streptomyces lividans TK24

Jiahu Zhang1, Jingjing Zhong2, Jianlu Dai2, Yiguang Wang2, Huanzhang Xia1, and Weiqing He2
1 College of Life Science and Biopharmaceuticals, Shenyang Pharmaceutical University, Shenyang 110016, Liaoning, China 2 Key Lab of Antibiotic Biotechnology, Minister of Health, Institute of Medicinal Biotechnology Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China

4″-O-isovaleryltransferase gene (ist) was regulated by positive regulatory genes of midecamycin 4″-O-propionyltransferase gene (mpt) in Streptomyces lividans TK24. A BamHⅠ～8.0 kb fragment from Streptomyces mycarofaciens 1748 was proved that it contained mpt gene and linked with two positive regulatory genes, orf27 and orf28. Orf of mpt was replaced by orf of ist and linked with two regulatory genes or orf27 single, and individually cloned into the vectors pKC1139 or pWHM3 (high copy number), and then transformed into S. lividans TK24. The levels of mpt and ist expression were evaluated by the bio-tramsformation efficacy of spiramycin into 4″-O-acylspiramycins in these transformants. The results showed that 4"-O-isovalerylspiramycins could be detected only in the transformants containing the plasmids constructed with pWHM3. The efficacy of bio-transformation of the transformants containing two regulatory genes was higher than that of orf27 single. So, the positive regulatory genes system of mpt gene could enhance ist gene expression.

spiramycin, 4"-O-acyltransferase gene, positive regulatory gene, heterologous expression

November 19, 2013; Accepted: February 28, 2014

Weiqing He. Tel: +86-10-83157099; Fax: +86-10-60638137; E-mail: weiqing_he@hotmail.com;

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 81172972), the Fundamental Research Funds for the Central Universities (No. 2012N09).

Huanzhang Xia. E-mail: xiahz612@sina.com

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81172972), 中央高?；究蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金 (No. 2012N09) 資助。