糖耐量損害大鼠腦組織NF－κBp65及TNF－α表達(dá)水平與認(rèn)知障礙的關(guān)系

魏 佳 董銀華 趙 嵐 王洪新

隨著人們生活水平提高，飲食結(jié)構(gòu)改變，越來越多糖尿病患者出現(xiàn)，糖尿病成為眾多專家學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)。糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥成為人們近年研究的新領(lǐng)域，其中認(rèn)知障礙是糖尿病中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥的重要表現(xiàn)之一［1，2］。糖耐量損害是介于正常血糖與糖尿病之間的一種代謝異常狀態(tài)，糖耐量損害是否與認(rèn)知障礙有關(guān)，尚無明確報(bào)道。本研究通過建立糖耐量損害大鼠模型，從炎癥機(jī)制角度探討糖耐量損害與認(rèn)知障礙的關(guān)系，為糖耐量損害的認(rèn)知障礙的防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物模型制備 SPF級wistar雄性大鼠60只，體重180～200 g，由中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號：SCXK－（軍）2007－004，隨機(jī)分為對照組和實(shí)驗(yàn)組，每組各30只。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周（不計(jì)入實(shí)驗(yàn)周期），對照組給予普通飼料，實(shí)驗(yàn)組給予高脂高糖飼料，自由進(jìn)水，室溫18～22℃，飼養(yǎng)20周。從第8周開始，以后每2周進(jìn)行1次葡萄糖耐量實(shí)驗(yàn)，測鼠尾血糖?？崭寡?.2～7.5 mmol／L 或者餐后2 h血糖7.9～10.4mmol／l的大鼠提示造模成功［3］。

1.2 行為學(xué)檢測 對照組和實(shí)驗(yàn)組分別于第5、10、15、20周采用自制簡易水迷宮試驗(yàn)測定大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，包括適應(yīng)性訓(xùn)練、定位航行訓(xùn)練、空間探索試驗(yàn)三部分。

1.3 大鼠腦組織石蠟切片 實(shí)驗(yàn)組和對照組大鼠分別于第5、10、15、20周末采用斷頸取腦法，腦組織做石蠟切片。

1.4 免疫組化法檢測大鼠腦組織中NF－κBp65及TNF－α因子的表達(dá)水平 選用武漢博士德公司的免疫組化試劑盒檢測NF－κBp65及TNF－α的表達(dá)水平，空白對照以0.01 mol／L PBS代替一抗。操作步驟嚴(yán)格按說明書進(jìn)行。每張切片在顯微鏡200倍視野下選5個(gè)互不重疊視野，以平均光密度值反映表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

水迷宮試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS20.0軟件，根據(jù)重復(fù)測量的多因方差分析對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以±s表示，組間均數(shù)比較采用q檢驗(yàn)。對大鼠腦組織 NF－κBp65、TNF－α陽性表達(dá)水平與認(rèn)知障礙進(jìn)行Pearson相關(guān)分析。P＜0.05為差異有顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 糖耐量損害大鼠成模情況

高脂高糖飼料飼養(yǎng)10周大鼠成模率60%，飼養(yǎng)15周大鼠成模率100%。

2.2 自制水迷宮實(shí)驗(yàn)

由表1和表2可知，第5周實(shí)驗(yàn)組較對照組逃避潛伏期短，空間探索時(shí)間長，隨著飼養(yǎng)周期的延長，糖耐量損害大鼠逐漸成模，第15周實(shí)驗(yàn)組大鼠全部成模，實(shí)驗(yàn)組大鼠較對照組大鼠逃避潛伏期延長，空間探索時(shí)間縮短 （P＜0.05）；第20周時(shí)實(shí)驗(yàn)組學(xué)習(xí)記憶能力顯著下降（P＜0.01）。

表1 大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期（±s，n＝5，s）

表1 大鼠定位航行實(shí)驗(yàn)的逃避潛伏期（±s，n＝5，s）

注：與同時(shí)間點(diǎn)對照組比較，＊P＜0.05，△P＞0.05，▲P＜0.01

組別 逃避潛伏期第1 d 第2 d 第3 d 第4 d 21實(shí)驗(yàn)組 12.79±0.11＊ 5.21±1.1＊ 2.78±0.29＊ 2.1±0.07＊第10周對照組 15.69±0.28 5.35±0.72 3.41±0.27 2.96±0.17實(shí)驗(yàn)組 22.55±0.54△ 5.65±0.16△ 3.90±1.70△ 2.85±0.32△第15周對照組 20.55±1.98 10.34±1.07 5.22±0.87 2.9±1.10實(shí)驗(yàn)組 32.73±5.73＊11.75±1.90＊ 6.73±0.24＊ 4.53±0.34＊第20周對照組 20.12±3.85 12.38±2.74 5.43±0.92 3.01±0.98實(shí)驗(yàn)組 68.23±5.66▲45.98±12.81▲ 14.03±2.79▲ 5.63±0.76第5周對照組 14.89±0.56 6.37±0.33 3.25±2.83 2.99±0.▲

表2 大鼠空間探索試驗(yàn)2 min內(nèi)大鼠穿過平臺所在象限的時(shí)間（s）

2.3 大鼠腦組織 NF－κBp65、TNF－α表達(dá)水平

NF－κBp65、TNF－α陽性表達(dá)為胞漿呈現(xiàn)棕黃色，強(qiáng)陽性時(shí)細(xì)胞核也出現(xiàn)棕黃色顆粒，胞核藍(lán)染。采用平均灰度值比較大鼠腦組織 NF－κBp65和TNF－α蛋白陽性表達(dá)水平。在第5周和第10周實(shí)驗(yàn)組與對照組差異不明顯（P＞0.05），第15周實(shí)驗(yàn)組與對照組有明顯差異（P＜0.05），第20周實(shí)驗(yàn)組與對照組有顯著差異（P＜0.01）（圖1、2）。

圖1 空白對照（左）、對照組（中）與實(shí)驗(yàn)組（右）大鼠大腦皮質(zhì)NF－κBp65蛋白陽性表達(dá)水平（DAB染色×200倍）

圖2 空白對照（左）、對照組（中）與實(shí)驗(yàn)組（右）大鼠大腦皮質(zhì)TNF－α蛋白陽性表達(dá)水平（DAB染色×200倍）

2.4 NF－κBp65及 TNF－α的表達(dá)水平與認(rèn)知功能之間的關(guān)系

Pearson直線相關(guān)回歸分析顯示，實(shí)驗(yàn)組大鼠學(xué)習(xí)記憶成績與NF－κBp65陽性表達(dá)水平呈正相關(guān)（r＝0.972，P＜0.05），與 TNF－α陽性表達(dá)水平呈正相關(guān)（r＝0.975，P＜0.05），而對照組兩者無明顯相關(guān)性（r＝0.260，P＞0.05）。

3 討 論

糖耐量損害（IGT）是介于正常血糖與糖尿病之間的異常糖代謝狀態(tài)，不僅是糖尿病的高危人群，而且也較多地聚集了心、腦血管疾病的危險(xiǎn)因素。英國前瞻性糖尿病研究發(fā)現(xiàn)，新診斷的2型糖尿病半數(shù)已有血管病變，提示血管病變可發(fā)生于糖尿病之前，即在IGT階段已經(jīng)有炎性反應(yīng)的發(fā)生，且可能與血管性認(rèn)知障礙有關(guān)［4］。近年研究發(fā)現(xiàn)較多的炎性因子在胰島素抵抗和IGR的發(fā)生中具有重要作用，如C反應(yīng)蛋白 、腫瘤壞死因子－a等都與糖耐量損害有關(guān)［5］。

NF－κB是一種廣泛的核轉(zhuǎn)錄因子，在靜息狀態(tài)下以二聚體狀態(tài)在細(xì)胞漿內(nèi)與Ik B結(jié)合，激活后與IkB解離，NF－k B核因子定位序列暴露，NF－κB進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，以二聚體的形式起轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用，從而誘導(dǎo)白細(xì)胞介素－1、細(xì)胞間粘附分子、腫瘤壞死因子（TNF－α）等的表達(dá)，白細(xì)胞在各種炎性介質(zhì)的介導(dǎo)下向血管內(nèi)皮細(xì)胞移動(dòng)、粘附并滲出，參與炎癥的的級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致缺血性神經(jīng)元的損傷。另外，各項(xiàng)因子如腫瘤壞死因子、白介素的表達(dá)反過來進(jìn)一步增加NF－κB表達(dá)，從而進(jìn)一步促進(jìn)炎癥因子的表達(dá)，進(jìn)一步加重炎癥反應(yīng)，形成惡性循環(huán)［6～8］。

綜上所述，本研究通過觀察糖耐量損害大鼠腦組織NF－κBp65及TNF－α的陽性表達(dá)水平與大鼠學(xué)習(xí)記憶能力減退的關(guān)系，為糖耐量損害導(dǎo)致認(rèn)知障礙的炎癥機(jī)制提供了理論依據(jù)，為血管性認(rèn)知障礙的治療提供新的靶點(diǎn)。

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