我國高致病性藍耳病研究進展

薛平　曲向陽

摘要 自2006年5月起藍耳病的高致病毒株導致豬群以持續(xù)高熱、繁殖障礙、高死亡率為特征的疾病，并迅速蔓延至我國其他養(yǎng)豬省份及周邊國家，成為影響我國養(yǎng)豬業(yè)的最重要的疾病，造成重大經濟損失。近年來，國家、科研院所及大型養(yǎng)豬企業(yè)對我國高致病性藍耳病的流行病學調查、病原分子進化與特性分析、診斷、疫苗研發(fā)及其防控措施上進行了大量的研究與實踐工作。從我國HPPRRS的流行病學狀況、HPPRRSV的分子生物學特征、診斷、疫病研發(fā)與使用以及防控措施等方面對我國高效病性藍耳病的研究進展進行了綜述。

關鍵詞 豬高致病性藍耳?。籋PPRRSV；病原分子特征；診斷；疫苗研發(fā)；防控措施；

中圖分類號 S852.65+1 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2014）05-01389-04

豬繁殖與呼吸道綜合征（Procine reproductive and respiratory syndrome ，PRRS）又稱為藍耳病，是目前全球養(yǎng)豬業(yè)所面臨的最重要的傳染病，據(jù)估計該病每年給美國的養(yǎng)豬業(yè)造成6.44億美元（2011年，存欄豬6400萬）的經濟損失[1]。該病以造成母豬繁殖障礙、仔豬呼吸道疾病為主要臨床癥狀，1987年美國與加拿大首次報道該疾病[2]，隨后歐洲也報道了類似疾病，1991年荷蘭成功分離藍耳病病毒（Lelystad virus）并依照科赫法則復制了該病的臨床癥狀，1992年美國也分離到PRRV VR 2332[3-4]。 至今為止，除瑞士、瑞典、新西蘭、澳大利亞等少數(shù)國家藍耳病檢測結果呈陰性外，其他養(yǎng)豬國家均感染了該疾病[5]。

我國是世界上最大的生豬養(yǎng)豬與豬肉消費國，2013年我國母豬存欄5 068萬，生豬存欄量4.68億。隨著我國養(yǎng)豬業(yè)規(guī)?；M程的加快，為提高生產成績與品種改良，從國外（特別是美國與加拿大）引種與場間種畜交流的頻率與規(guī)模也隨之增加，生豬運輸伴隨著巨大的生物安全風險，藍耳病也借此在我國廣泛流行，特別是2006年高致病性藍耳病（Highly pathogenic PRRS，HPPRRS）毒株出現(xiàn)以來，經濟損失與防控壓力日趨嚴重，已經成為威脅我國養(yǎng)豬業(yè)健康發(fā)展的重要疾病。雖然我國學者尚未對HPPRRS對養(yǎng)豬業(yè)經濟的影響進行評估，但從美國的經驗看，藍耳病所造成的損失中12%與母豬的繁殖性障礙有關，43%與生長豬的死亡有關，45%與生長豬飼料轉化率變差、生長緩慢有關。

1 我國HPPRRS的流行病學狀況

1995年我國報道了首例藍耳病臨床案例[5]。1996年哈爾濱獸醫(yī)研究所郭寶清等在我國分離到首株藍耳病病毒株CH-1a。臨床上主要以懷孕豬后期流產、死胎、木乃伊胎等繁殖性障礙及保育、生長豬出現(xiàn)呼吸道癥狀、生長緩慢、高發(fā)病率，高死亡率，臨床癥狀也與美洲、歐洲的報道非常類似。因為PRRSV主要在肺泡巨噬細胞及其他單核細胞中復制，可以抑制宿主的免疫應答，導致宿主對其他病原的易感性增加。特別是圓環(huán)病毒病在我國傳播后PRRS常與圓環(huán)病毒2型、偽狂犬病毒、豬鏈球菌、大腸桿菌與副豬嗜血桿菌等病原混合感染[6]。

自2006年5月以來，江西省發(fā)生了以持續(xù)高熱（41～42 ℃）、體表發(fā)紺、呼吸困難、高發(fā)病率（50%～100%）、死亡率（20%～100%）為主要特征的熱性病，發(fā)病豬場幾乎各階段的豬均會受到影響，通常哺乳仔豬發(fā)病率達100%，保育仔豬的發(fā)病率為70%，育肥豬的發(fā)病率為20%。懷孕各階段的母豬均受到影響，40%以上的妊娠母豬會發(fā)生流產，甚至有10%的母豬死亡。因為未及時采取措施限制豬群的交易與運輸，至2006年8月河南、河北、山東、北京、廣東等省份也出現(xiàn)了類似疾病[7]，經實驗室診斷確認是由于HPPRRS感染所致[8]。2007年初，HPPRRS已蔓延至我國大部分的養(yǎng)豬地區(qū)，發(fā)病豬數(shù)量超過200萬頭，生豬價格也因此出現(xiàn)較大波動。與此同時，越南（2007年3月）、老撾、柬埔寨、緬甸、泰國、韓國、不丹等周邊國家也確認了高致病豬藍耳病的發(fā)生（OIE網站）。

Bin Li等[9]對2006～2010年來自全國主要養(yǎng)豬省份的2 981份臨床樣品分析表明，2006年，56.3%的樣品HPPRRSV檢測結果呈陽性，7.85%樣品呈經典PRRSV陽性，而2007～2010年檢測病例HPPRRSV陽性率分別為64.86%、55.06%、71.71%和54.03%，而經典PRRSV的檢出率為0。5年間所檢發(fā)病豬樣品的HPPRRSV平均陽性率為60.85%，說明HPPRRSV變異株占據(jù)了我國PRRS感染的主導地位。從區(qū)域分布來看，安徽、湖北與河南地區(qū)樣品的陽性率最高，超過68%。Zhao Zhanzhong[6]等于2008～2010年對4個藍耳病陽性的豬場（位于上海、浙江、湖北

、江西）的801個樣品進行了檢測，結果表明68.9%的樣品RTPCR檢測結果呈陽性，且PRRS的感染沒有明顯的季節(jié)性差異。Shang Y[10]等于2007～2010年對我國西北部的15豬場的322份來自于流產或仔豬呼吸道癥狀豬的樣品進行了檢測，發(fā)現(xiàn)PRRSV的陽性率為35.9%，全部屬于HPPRRSV，但陽性率低于全國其他地區(qū)。Yu X[11]等檢測了來自我國、老撾、越南等多個東南亞國家的919份樣品，結果發(fā)現(xiàn)HPPRRSV的陽性率達45.2% （415/919），僅0.1% （1/919） 的樣品屬于經典PRRSV。以上的PRRSV的流行病學調查均表明目前我國所流行的PRRSV基本上均屬于HPPRRSV，且臨床樣品的陽性率為35.9%～60.8%[6，9-11] ，存在一定的區(qū)域差異。

因為HPPRRSV具有免疫抑制作用，因此HPPRRS常與其他病原（如圓環(huán)病毒、鏈球菌、副豬嗜血桿菌及大腸桿菌）發(fā)生混合感染[6]。當HPPRRSV與圓環(huán)病毒2型同時感染時，2種病毒的復制都會得到增強，從而導致更嚴重的臨床癥狀，故HPPRRSV與PCV2在感染豬時具有協(xié)同作用[12]。另外研究也證實HPPRRSV感染能夠促進副豬嗜血桿菌病的發(fā)生[13]。

2 HPPRRSV的分子生物學特征

PRRSV屬于單股、正鏈有囊膜的RNA病毒，基因組大小為15～15.5 kb，可分為美洲型（VR2332，1型）與歐洲型（Lelystad virus，2型）2種基因型，2個基因型間的同源性約為60%[14]。我國分離的PRRSV毒株與美洲型的同源性為89%，與歐洲型的同源型為60%，至今為止我國所分離的PRRSV毒株基本上都屬于美洲型[9-10，15]。2011年Chen N等[16]報道了我國首例歐洲型毒株（與美洲型基因組的同源性僅為58.0%～58.2%），目前PRRS在歐洲與美洲也打破了區(qū)域的專屬性。PRRSV容易發(fā)生變異，以其基因、抗原性、致病性的多變異性著稱。同一基因型不同毒株間的基因差異性可達20%，特別是NSP2、ORF5區(qū)域變異較大，常作為研究PRRSV基因變異與分子流行特征調查的2個目標靶位。

自2006年HPPRRSV出現(xiàn)伊始，該病毒一直在發(fā)生著快速的變異。與經典的PRRSV相比，導致2006年HPPRRS的毒株的NSP2缺失90個堿基（即30個氨基酸）[8]，其與所分離的CH1a（1996年分離）間同源性為94.9～95.4%，與NB/04（2004年）同源性為97.6%～98.2%，與HB-1（sh）/2002的同源性為96.7%～97.2%[7] 。近年來所分離的PRRSV毒株NSP2均存在30堿基的缺失，與2006年所分離的HPPRRSV相同，因此NSP2 缺失30堿基可作為鑒別HPPRRSV的主要分子生物學特征。但是也有研究表明，NSP2所編碼區(qū)域缺失30個堿基并非是HPPRRSV毒力增強的根本原因[17]。因此，目前HPPRRSV的致病機理與毒力增強的因素尚有待進一步研究。

除NSP2以外，由ORF5編碼的GP5蛋白也是PRRSV最易發(fā)生變異的蛋白，該蛋白含有主要的中和抗原表位且具有免疫原性。對ORF5的氨基酸序列分析，可將我國的PRRSV病毒分成3個基因亞型。Xie J等[15]自2007～2011年從來自南方276個豬場的3 199份臨床樣品中選取51份PRRSV陽性的樣品，對ORF5基因進行了測序分析，結果發(fā)現(xiàn)這51份樣品分屬3個亞基因型，其中45份樣品屬于亞基因型1，與經典的HPPRRSV（JXA1）非常接近；只有1份樣品屬于亞基因型2，即與美洲型代表株V2332非常接近；其他5份屬于亞基因型3，其與亞基因型1的46份樣品間只有79.6%～83.6%的同源性，ORF5變異顯著。這說明雖然目前HPPRRSV在南方豬場占主導（與Bin Li等[9]的研究結果一致），但有部分毒株的GP5蛋白/ORF5正發(fā)生顯著變異。特別是2009～2010年的華中地區(qū)樣品的GP5與JXA1相比已經不處于同一個進化分支，1個誘變位點發(fā)生突變（V29 → A29）[18]。Shang Y[10]等的研究也發(fā)現(xiàn)我國西北部自2009年以后樣品的GP5蛋白的抗體誘發(fā)位點的核苷酸發(fā)生了突變。HPPRRSV GP5主要中和表位上的關鍵氨基酸的改變可能會導致這些HPPRRSV野毒能夠逃脫由CH1a與JXA1R等疫苗所誘導產生的免疫保護，使HPPRRSV在豬體內形成持續(xù)性感染[9]。此外，新分離HPPRRSV中也可能會出現(xiàn)GP3蛋白抗原漂移及5′UTR與3′UTR發(fā)生氨基酸缺失等變異[19]。

從致病力的角度來看，雖然HPPRRSV在2006～2012年正快速發(fā)生著變異，但仍保持著相似的高致病力，比如病豬體溫升高（>41 ℃，至少4 d），可使4～10周齡仔豬出現(xiàn)100%的發(fā)病率，40%～100%的死亡率[11]。從組織嗜性來看，HPPRRSV比低毒力的PRRSV表現(xiàn)出更廣泛的組織嗜性，這可能是其致病力增強的原因之一[20]。

3 診斷

PRRS的診斷目前主要采用臨床診斷與實驗室診斷相結合的方式。

（1）臨床診斷：當HPPRRS發(fā)生感染時，通常妊娠母豬或育肥豬先出現(xiàn)臨床癥狀，持續(xù)高熱（41～42 ℃），傳播快（3～5 d即可傳播至整群），病程約為1～3周，體表發(fā)紺并伴隨著高發(fā)病率與高死亡率。因為它經常與其他病原混合感染，因此也難以根據(jù)剖檢病變來做出準確判斷。（2）

實驗室診斷主要依靠血清學方法與分子生物學方法。①ELISA。雖然已經研究出針對所缺失的29個氨基酸建立了ELISA診斷方法，用于鑒別高致病性毒株與經典毒株的所產生的抗體[21]，但目前尚未在實踐中推廣使用。目前HPPRRS疫苗的大量使用也為這種試劑盒的應用帶來了障礙。②分子生物學方法。根據(jù)HPPRRSV缺失90個堿基序列的特點，建立RTPCR、實時熒光RTPCR、多重實時定量RTqPCR（可對歐洲型與美洲型進行分型，并鑒定出HPPRRSV[22]）等方法對HPPRRSV與PRRSV進行鑒別診斷。

4 疫苗研發(fā)與應用

我國于2000年批準上市首個藍耳病滅活疫苗（CH-1a），2005年批準上市了首個藍耳病弱毒疫苗（Ingelvac，V2332）。2006年發(fā)生高致病性藍耳病以后，國家又批準上市了利用HPPRRS分離株研發(fā)的滅活疫苗JXA1。但這些疫苗對高致病性藍耳病無法提供有效的免疫保護，或僅能提供部分免疫保護。此后，我國研究人員又先后研發(fā)上市了CH-1R（2009年）、R98（2009年）等經典毒株弱毒苗以及JXA1R（2009年）、HuN4F112（2011年）、TJMF92（2011年2月）等不同毒株HPPRRS疫苗。其中，TJMF92與所分離的TJ野毒株相比，在NSP2上有120個氨基酸發(fā)生了連續(xù)缺失，48個氨基酸發(fā)生了基因變異，毒力明顯降低[23]。因為與其他HPPRRSV野毒株相比連續(xù)缺失120個氨基酸（360個堿基），可通過ELISA或RTPCR的方法將疫苗株與野毒進行鑒別區(qū)分[24]。因為該產品上市時間較短，其對HPPRRS的臨床保護效果還有待進一步驗證。

研究表明，PRRS的滅活疫苗無法提供針對HPPRRS的有效保護。具有標記的弱毒疫苗的開發(fā)成為目前藍耳疫苗研發(fā)的熱點。新的HPPRRSV野毒株的弱化篩選工作仍在進行。Wang X[25]等將所分離的HPPRRSV JX143傳代 100次后得到JXM100，JXM100的NSP2位點有88個連續(xù)的氨基酸發(fā)生缺失，其毒力顯著降低，免疫仔豬后對JX143有保護力，也可用于鑒別自然感染與疫苗毒，但目前尚未進行進一步的安全性、穩(wěn)定性等方面的研究。Wei Y 等[26 ]利用同樣的方法將野毒傳代 125次后，發(fā)現(xiàn)有45個氨基酸發(fā)生了變異，2個氨基酸缺失，毒力也大幅降低。Yu X等[27]的研究表明將JXA1連續(xù)傳代超過110次后得到的變異毒株的免疫原性與免疫保護力均顯著降低，說明野毒株經過110次傳代后被過度弱化。

我國有些學者也在嘗試研發(fā)新型PRRS疫苗，比如利用重組的偽狂犬病毒或腺病毒來表達GP5、M或其他蛋白，或利用重組質粒來表達GP5/Gp3蛋白，以開發(fā)DNA疫苗[28]，但這些新型疫苗尚未應用于臨床上。

因為目前我國已批準上市的PRRS疫苗種類繁多，如經典弱毒株（V2332、CH-1R與R98）和高致病性藍耳病弱毒株（江西株JXA1-R、湖南株HuN4-F112、天津株TJMF92），再加上國內外學者與養(yǎng)豬企業(yè)對PRRS疫苗使用觀點的差異，導致我國目前藍耳疫苗的使用非?；靵y，多種疫苗株的同時使用很可能會導致疫苗株間的同源重組，導致疫苗株毒性返強的可能。

2011年Zhanzhong Zhao等[6]對我國滅活疫苗（JXA1、CH-1a）與經典株弱毒疫苗（CH-1R、V2322）的免疫效果及我國17個省的723家豬場的PRRS使用狀況進行了調查。結果發(fā)現(xiàn)，經典弱毒疫苗的免疫效果優(yōu)于滅活疫苗。母豬群與仔豬群不進行免疫的豬場比例分別為51.73%和59.75%。從免疫策略來看，對母豬進行全群免疫優(yōu)于“660”方案（母豬分娩后6 d與配種后60 d），對仔豬斷奶前免疫優(yōu)于斷奶后免疫。

5 防控措施

自藍耳病出現(xiàn)以來，養(yǎng)豬行業(yè)已經與該病斗爭、共存了20多年。由于該病毒的快速變異、免疫逃避及分布廣泛等原因，全球尚沒有控制該疾病直接而有效的方式。目前藍耳病的防控已成為全球養(yǎng)豬業(yè)共同面臨的難題。常用的措施包括生物安全、疫苗免疫、生產管理（特別是后備母豬管理）、同群感染、清群/重新引入（Depopulation/Repolulation）、封群等。

我國僅有少數(shù)的養(yǎng)豬企業(yè)通過嚴格的管理與生物安全措施維持著HPPRRS的雙陰性。但是，因為生產方式多樣化、管理水平較低和生物安全意識比較淡薄，使疫苗免疫成為目前大部分豬場防控藍耳病的主要選擇。母豬群使用PRRS 弱毒疫苗每季度全群免疫1次，可使母豬群的免疫狀態(tài)趨于一致，降低群體中易感豬的比例。因為藍耳疫苗建立有效的免疫至少需要4周的時間[29]，因此免疫時間的選擇非常重要，斷奶前免疫（如15～18日齡）的效果應優(yōu)于斷奶后免疫。建議進行實驗室的檢測，以確定豬場藍耳病在仔豬上的暴露時間以判斷最佳的免疫時間[6]。但目前多種不同類型的經典PRRS弱毒疫苗與HPPRRS弱毒疫苗的上市，使豬場面臨疫苗選擇的困惑，不同疫苗株之間或野毒株與HPPRRS疫苗毒間存在同源重組，從而加速了HPPRRSV的變異進程。各種新上市疫苗的臨床有效性及安全性（毒力返強）也有待進一步評估。

HPPRRS爆發(fā)時常伴隨著豬鏈球菌、副豬嗜血桿菌及大腸桿菌等細菌性疾病的混合感染。因此，在感染的高峰期（如保育階段）添加抗生素進行藥物預防具有重要意義。此外，體內外試驗表明替米考星等藥物可間接抑制藍耳病毒的復制，從而降低藍耳病所造成的影響[30-31]。我國科研人員還發(fā)現(xiàn)隱孔菌提取物可在體內與體外抑制高致病性藍耳病病毒的復制，病毒在體內的含量[32]，但尚未應用于臨床。

因為我國豬病感染比較復雜，利用發(fā)病動物的血清進行同群感染的風險較大，目前僅有部分豬場在嘗試。然而，清群/重新引入（Depopulation/Repolulation）的方法成本過大，維持陰性的難度過大，也很難被國內的養(yǎng)豬企業(yè)所采納。

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