重組組蛋白去乙?；?-p EGFP-C2質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

章 慧，黃 成，卞爾保，趙 斌，吳寶明，劉昌偉，陳小霞，李 俊

（安徽醫(yī)科大學(xué)1.藥學(xué)院、2.肝病研究所，安徽 合肥 230032）

組蛋白去乙?；?（HDAC2）為組蛋白去乙酰化酶家族中重要的I型成員之一，能夠激活組蛋白的氨基端，使組蛋白發(fā)生去乙?；?，從而導(dǎo)致相關(guān)腫瘤抑制因子的缺失或表達(dá)降低［1-2］。HDAC2參與多種腫瘤如肝癌、胃癌、卵巢癌及前列腺癌等等的發(fā)生發(fā)展過(guò)程，同時(shí)對(duì)炎癥的生成也起到一定的促進(jìn)作用［3-4］。其廣泛表達(dá)于多種癌細(xì)胞和炎癥細(xì)胞中，但HDAC2在體外相關(guān)細(xì)胞的過(guò)表達(dá)作用及蛋白的表達(dá)定位有待進(jìn)一步研究。本研究利用pEGFP-C2載體帶有熒光蛋白序列為報(bào)告基因的特點(diǎn)，將HDAC2基因克隆入pEGFP-C2載體，構(gòu)建能夠融合表達(dá)綠色熒光蛋白與HDAC2蛋白的重組質(zhì)粒，并在非洲綠猴腎成纖維細(xì)胞COS-7中分析HDAC2基因的表達(dá)及分布部位，為進(jìn)一步研究HDAC2蛋白的生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料 Tag1感受態(tài)細(xì)胞由安徽醫(yī)科大學(xué)生命科學(xué)院饋贈(zèng)。真核表達(dá)重組質(zhì)粒 pEGFP-C2和COS-7細(xì)胞為安徽省天然藥物活性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。胰蛋白酶高糖DMEM液體培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國(guó)）；Xho I、BamH I內(nèi)切酶（Fermentas生物工程公司，加拿大）；T4 DNA Ligase（Fermentas公司，加拿大）；Lipofectamine 2000、Opti-MEM、TRIzol Reagent（Invitrogen公司，美國(guó)）；膠回收試劑盒（AxyGen公司，美國(guó)）、質(zhì)粒提取試劑盒（TIANGEN公司，中國(guó)）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司，日本）；LA Taq酶（TaKaRa公司，日本）；LB-Kana瓊脂培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室配置；倒置熒光顯微鏡（Olympus公司，日本）；顯微數(shù)碼攝影機(jī)（Nikon公司，日本）。HDAC2、β-actin和GFP抗體購(gòu)于Anbo公司和博士德公司。

1.2 方法

1.2.1 目的基因HDAC2 DNA片段的擴(kuò)增制備根據(jù)目的基因序列、引物設(shè)計(jì)原則設(shè)計(jì)PCR特異性引物，引物序列上游引物：5′-CAGCTCGAGTATGGCGTACAGTCAAG-3′；下游引物：5′-ATAGGATCCTCAGGGGTTGCTGAGCTGT-3′，上、下游引物分別引入酶切位點(diǎn)Xho I、BamH I及保護(hù)性堿基，并保持HDAC2閱讀框正確；所有引物由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，擴(kuò)增長(zhǎng)度為1 467 bp。PCR擴(kuò)增HDAC2 cDNA條件：以逆轉(zhuǎn)錄所得HepG2 cDNA為模板，采用 PCR擴(kuò)增 HDAC2全長(zhǎng) PCR體系（25 μl），其中上、下游引物（10μmol·L-1）各 1μl、cDNA 1μl、dNTPMix 4μl、10×LA buffer 2.5μl、TaKa-Ra LA Taq 0.5μl和無(wú)酶水15μl。反應(yīng)條件為94℃，預(yù)變性 5 min；94℃變性 1 min；59℃退火 40 s；72℃延伸1 min 45 s；循環(huán)35次后72℃延伸5 min。1%的瓊脂糖凝膠電泳分離PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，按照試劑盒說(shuō)明回收DNA并純化。

1.2.2 重組真核表達(dá)載體pEGFP-C2-HDAC2的構(gòu)建 “1.2.1”步驟中回收得到的HDAC2擴(kuò)增產(chǎn)物和pEGFP-C2質(zhì)粒分別用Xho I、BamH I內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，凝膠電泳分離，回收HDAC2基因和質(zhì)粒，用T4 DNA連接酶連接，在16℃條件下連接反應(yīng)進(jìn)行12 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化Tag 1感受態(tài)細(xì)菌，轉(zhuǎn)化的菌液涂布于LB-Kana瓊脂培養(yǎng)基上，37℃正置20 min，然后繼續(xù)倒置過(guò)夜。挑取單克隆菌落接種到LB-Kana液體培養(yǎng)基，37℃、210 r·min-1搖菌過(guò)夜。采用XhoⅠ和BamHⅠ雙酶切方法篩選、鑒定陽(yáng)性重組質(zhì)粒，并由上海生工生物技術(shù)有限公司作進(jìn)一步的測(cè)序鑒定。

1.2.3 pEGFP-C2-HDAC2重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞 COS-7細(xì)胞在含10%胎牛血清的高糖NMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的COS-7細(xì)胞，取2 ml于6孔板中，置37℃、5%CO2培養(yǎng)24 h后細(xì)胞融合生長(zhǎng)至90%～95%，分別將3μg質(zhì)粒和3μl脂質(zhì)體溶于150μl OPTI-MEM培養(yǎng)基中，5 min后將兩者混合室溫靜置20 min；用PBS洗滌細(xì)胞3次，加入質(zhì)粒-脂質(zhì)體混合物，置37℃、5%CO2培養(yǎng)6 h后，更換10%胎牛血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)置未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為對(duì)照。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)細(xì)胞中HDAC2的基因表達(dá)

實(shí)驗(yàn)分為3組：未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒對(duì)照組、HDAC2質(zhì)粒組。處于對(duì)數(shù)期生長(zhǎng)的COS-7細(xì)胞消化后接種于細(xì)胞瓶中，每瓶細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)，轉(zhuǎn)染后6 h后轉(zhuǎn)為全培養(yǎng)基培養(yǎng)，并繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞。按TRIzol試劑盒操作說(shuō)明提取細(xì)胞總RNA，凝膠電泳判斷有無(wú)降解。按TaKaRa試劑盒操作程序，取2 μl總RNA，2μl Primer Mix，6μl Water反轉(zhuǎn)錄成cDNA。設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增HDAC2的引物序列，上游引物：5′-ATAAAGCCACTGCCGAAGAA-3′，下游引物：5′-TCCTCCAGCCCAATTAACAG-3′，擴(kuò) 增 長(zhǎng) 度 245 bp；β-actin的引物序列，上游引物：5′-CCCACACTGTGCCCATCTACG-3′，下游引物：5′-GCCATCTCTTGCTCGAAGTCC-3′，擴(kuò)增長(zhǎng)度205 bp。取 1μl進(jìn)行PCR反應(yīng)。取 PCR反應(yīng)產(chǎn)物5μl，加6×Loading Buffer 1μl，經(jīng)1.5% 瓊脂糖凝膠（含 EB 0.5 mg·L-1）電泳30 min（80 V），圖像分析儀采集圖像，以內(nèi)參β-actin為基準(zhǔn)分析，即以擴(kuò)增目的片段的灰度比值表示所擴(kuò)增目的基因片段的相對(duì)表達(dá)水平，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5 Western blot檢測(cè)融合蛋白及HDAC2蛋白的表達(dá) 實(shí)驗(yàn)分組、處理同上，轉(zhuǎn)染48 h后PBS洗3次，每組加1 ml裂解液（含10μl PMSF），冰上裂解30 min。4℃離心30 min，取上清加入上樣緩沖液，100℃加熱10 min使蛋白變性。每孔上樣20μl總蛋白，進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳電泳結(jié)束后用BioRAD濕轉(zhuǎn)儀器將蛋白轉(zhuǎn)到PVDF膜上，電流200 mA，時(shí)間分別為 40、60、60 min，膜在室溫下用5%脫脂奶粉封閉3 h，膜清洗后一抗封閉，一抗?jié)舛葹椋害?actin（1∶500）、HDAC2（1∶500），GFP（1∶800），4℃過(guò)夜。膜清洗 4次，每次 10 min，再加入與一抗匹配的二抗（1∶10 000），室溫孵育1 h，膜清洗4次，每次10 min，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6 熒光制片 細(xì)胞爬片的制備：用多聚甲醛潤(rùn)洗蓋玻片，置超凈臺(tái)風(fēng)干，加適量培養(yǎng)液。然后用胰酶消化細(xì)胞，適量密度重新種入放置了蓋玻片的培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2培養(yǎng)過(guò)夜，待轉(zhuǎn)染。即轉(zhuǎn)染24 h后棄培養(yǎng)基。用預(yù)冷的PBS溶液洗3遍。DAPI孵育5～10 min，棄DAPI溶液，PBS溶液洗3次，最后用濾紙盡可能去除蓋玻片上的溶液，用熒光封片膠將蓋玻片封于載玻片上。

2 結(jié)果

2.1 目的基因HDAC2的擴(kuò)增及重組載體p EGFP-C2-HDAC2鑒定 HDAC2引物中引入酶切位點(diǎn)和保護(hù)性堿基，PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分離，與 DNA Marker比對(duì)片段大小符合，pEGFPC2-HDAC2重組質(zhì)粒經(jīng)Xho I和 Bam H I雙酶切，1%瓊脂糖凝膠電泳分離，符合預(yù)期大小的條帶，表明HDAC2已被插入到pEGFP-C2載體中，見Fig 1?；蛐蛄蟹治鰷y(cè)序結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)HDAC2基因正確插入pEGFP-C2載體，HDAC2序列與GenBank上完全一致。

Fig 1 The expression of mRNA was detected by semi-quantitative RT-PCRA：Expression of HDAC2 in COS-7 cells；B：Identification of the recombinant plasmid pEGFP-C2-HDAC2 by XhoI and BamHI digestion（1，4：DNA marker；Lane2：The amplied fragment of HDAC2；Lane3：recombinant plasmid digested with XhoI and BamHI）

2.2 pEGFP-C2-HDAC2在COS-7細(xì)胞中的表達(dá)在轉(zhuǎn)染24 h后觀察即可見綠色熒光細(xì)胞，pEGFPC2在細(xì)胞中呈現(xiàn)彌散性分布表達(dá)，見Fig 2，熒光制片中可看到，pEGFP-C2載體中的綠色熒光彌散于整個(gè)細(xì)胞，而pEGFP-C2-HDAC2質(zhì)粒的熒光只在細(xì)胞核中呈現(xiàn)，表明HDAC2在細(xì)胞核表達(dá)。見Fig 3。

Fig 2 Expression of EGFP in COS-7 cells at 24h after transfection with plasmid pEGFP-C2-HDAC2detected by fluorescence staining；1：Bright field；2：Dark field；A：Normal COS-7 cells，B：pEGFP-C2 transfected COS-7 cells；C：pEGFP-C2-HDAC2 transfected COS-7 cells.

Fig 3 Expression of EGFP in COS-7 cells at 24h after transfection with plasmid pEGFP-C2-HDAC2detected by fluorescence staining；A：pEGFP-C2 transfection；A1：DAPI；A2：The localization of pEGFP-C2；A3：Composite diagram B：pEGFP-C2-HDAC2；B1：DAPI；B2：The localization of pEGFP-C2-HDAC2；B3：Composite diagram

2.3 pEGFP-C2-HDAC2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)COS-7細(xì)胞中HDAC2的表達(dá)檢測(cè) 經(jīng)RT-PCR和Western blot結(jié)果顯示：連接質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞中可見HDAC2的表達(dá)，而空質(zhì)粒組和未轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞中HDAC2的表達(dá)較低，見Fig 4A和B。同時(shí)Western blot顯示空質(zhì)粒組和連接質(zhì)粒組分別在27 ku和85 ku處有表達(dá)，表明pEGFP-C2與HDAC2發(fā)生了融合，更進(jìn)一步說(shuō)明pEGFP-C2-HDAC2的構(gòu)建成功。見Fig 4C。

3 討論

HDACs為組蛋白去乙酰化酶，其主要的功能是從N-乙酰賴氨酸中刪除乙酰基團(tuán)，發(fā)生去乙?；种苹虻霓D(zhuǎn)錄［5］。組蛋白去乙酰化酶根據(jù)結(jié)構(gòu)分為3類：Ⅰ類包括 HDAC1-3和 HDAC8；Ⅱ類包括：HDAC4-7和 HDAC9-11；Ⅲ類包括：SIRT 1-7［6］。HDAC2是Yang等［7］在1996年從人的HeLa細(xì)胞的cDNA文庫(kù)中篩選得到的。HDAC2高表達(dá)于子宮癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌及胃癌等多種腫瘤的器官和組織中［8-9］。HDAC2 siRNA對(duì) HepG2細(xì)胞的增殖具有抑制作用，轉(zhuǎn)染24 h后，細(xì)胞生長(zhǎng)逐漸減慢［10］。COS-7細(xì)胞是研究蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的有力工具，多種載體可以在COS-7細(xì)胞中表達(dá)外源基因。本研究采用成功構(gòu)建的真核表達(dá)載體pEGFP-C2-HDAC2轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞COS-7對(duì)HDAC2基因的真核表達(dá)進(jìn)行了初步研究。

PEGFP-C2就是一種可編碼增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）的真核質(zhì)粒載體，其上攜帶有EGFP表達(dá)報(bào)告基因，EGFP則是GFP的一個(gè)突變體，其熒光強(qiáng)度及光漂白抗性明顯增強(qiáng)，是迄今為止最佳的活體分子標(biāo)志物之一［11-12］。本研究通過(guò)基因重組技術(shù)，將包含起始密碼子和終止密碼子的HDAC2 cDNA插入pEGFP-C2載體EGFP的上游5′端，并保持相同的閱讀框，成功構(gòu)建HDAC2和綠色蛋白融合基因的真核表達(dá)載體，經(jīng)雙酶切鑒定證實(shí)目的片段插入到載體相應(yīng)的位置，載體經(jīng)基因測(cè)序證實(shí)基因構(gòu)建成功，序列和GenBank上完全符合。本研究將HDAC2基因成功構(gòu)建至pEGFP-C2載體并轉(zhuǎn)染至COS-7細(xì)胞，通過(guò)PCR和Western blot檢測(cè)，與未轉(zhuǎn)染組和空質(zhì)粒組比較，連接質(zhì)粒組有HDAC2高表達(dá)。熒光顯微鏡觀察，空質(zhì)粒組熒光呈彌散型，同時(shí)通過(guò)免疫熒光制片觀察到HDAC2在COS-7細(xì)胞中定位于細(xì)胞核，且熒光清晰可見。使用GFP抗體檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)，結(jié)果顯示空質(zhì)粒組和連接質(zhì)粒組分別在不同位置有表達(dá)。進(jìn)一步說(shuō)明質(zhì)粒的構(gòu)建成功，也為進(jìn)一步研究HDAC2在體內(nèi)細(xì)胞發(fā)生表達(dá)作用奠定基礎(chǔ)。

Fig 4 The expression of mRNA and protein were detected by RT-PCR and Western blotA：The mRNA expression levels of HDAC2 in COS-7 cells（M：Marker；Lane1： Control； Lane2： pEGFP-C2； Lane3： pEGFP-C2-HDAC2）；B：The protein expression levels of HDAC2 in COS-7 cells（Lane1：Control；Lane2：pEGFP-C2；Lane3：pEGFP-C2-HDAC2）；C：The protein expression levels of GFP in COS-7 cells.（Lane1：Control；Lane2：pEGFP-C2；Lane3：pEGFP-C2-HDAC2）

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