葫蘆素E抑制HeLa細(xì)胞mTORC1的活性并誘導(dǎo)細(xì)胞自噬

張曉鈺，徐麗慧，趙高翔，潘 浩，周 單，歐陽東云，何賢輝

（暨南大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院1.免疫生物學(xué)系、2.細(xì)胞生物學(xué)系，廣東廣州 510632）

葫蘆素E（cucurbitacin E，CuE）是從葫蘆科植物中提取的一種四環(huán)三萜類化合物［1］，是葫蘆素家族的一個成員。研究表明［2-3］，CuE具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎等多種藥理作用。細(xì)胞自噬是一種在真核細(xì)胞中高度保守的自我消化過程，自噬過程中，自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體，降解細(xì)胞中多余或受損的大分子和細(xì)胞器，循環(huán)利用降解產(chǎn)物，從而維持細(xì)胞的內(nèi)穩(wěn)態(tài)［4］。我們發(fā)現(xiàn)，同屬葫蘆素家族的葫蘆素B在Jurkat細(xì)胞中誘導(dǎo)保護(hù)性自噬［5］，然而其誘導(dǎo)自噬的機(jī)制并未闡明。Zhang等［6］報道葫蘆素B和I通過線粒體來源的ROS而誘導(dǎo)自噬，這種作用與其誘導(dǎo)MAPK信號通路的活化有關(guān)，但不依賴STAT3信號通路。以往的研究證實了葫蘆素B在人A357和B16F10黑素瘤細(xì)胞中并不能提升ROS水平［7］，說明葫蘆素B誘導(dǎo)細(xì)胞自噬可能存在其他機(jī)制。Lee等［8］發(fā)現(xiàn)，葫蘆素B能抑制mTOR（mechanistic target of rapamycin）活性。mTOR是一種非典型的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，調(diào)控蛋白質(zhì)、核糖體生成和能量代謝等多種生理功能，在控制細(xì)胞生長和代謝方面發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用［9］。mTOR結(jié)合不同的組分后形成兩種獨特的復(fù)合體：mTORC1和 mTORC2。mTORC1參與調(diào)節(jié)自噬過程，許多細(xì)胞信號匯集到mTORC1調(diào)節(jié)細(xì)胞自噬的上游機(jī)制。在mTOR信號通路中，抑制mTOR活性促進(jìn)細(xì)胞自噬［9-10］。作為葫蘆素B的類似物，CuE是否能夠抑制mTOR的活性，從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬，目前尚不清楚。本研究以HeLa細(xì)胞為模型，分析CuE對mTORC1活性的影響與其誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的相關(guān)性，探討CuE誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的作用機(jī)制，為進(jìn)一步研究CuE的抗腫瘤和抗炎作用機(jī)制提供參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株和主要試劑 HeLa和MCF7細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；高糖型DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）、青霉素和鏈霉素為 Gib-co／Invitrogen產(chǎn)品；葫蘆素E（純度98%）購自上海順勃生物工程技術(shù)有限公司；氯喹（CQ）、二甲基亞砜（dimethylsulfoxide，DMSO）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）購自 Sigma-Aldrich；WST-1試劑為Roche公司產(chǎn)品；RIPA裂解液（RIPA lysis buffer）和BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天公司；所有免疫印跡抗體均購自Cell Signaling Technology公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HeLa和MCF7細(xì)胞均用含有10%FBS、100 kU·L-1青霉素和 100 mg·L-1鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5%CO2濕度飽和的培養(yǎng)箱中，每2～3 d換液傳代。取對數(shù)生長期的細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 細(xì)胞增殖測定 WST-1法檢測細(xì)胞增殖。取對數(shù)期細(xì)胞，接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔3 300個細(xì)胞，24 h后將培養(yǎng)液換成含藥物的新鮮培養(yǎng)液。分別培養(yǎng)24 h和48 h后，加入10μl WST-1試劑，37℃孵育0～4 h，每隔30 min用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測量吸光值（A450nm），參考波長為630 nm。空白組只含有培養(yǎng)基而無細(xì)胞，增殖率／%＝（實驗組A450nm-空白A450nm）／（對照組A450nm-空白A450nm）×100%。每個濃度點做3個復(fù)孔。通過GraphPad Prism 4.0軟件繪制細(xì)胞增殖活性曲線，并算出半數(shù)抑制濃度（IC50）值。

1.2.3 免疫印跡分析 參照前文［11］報道方法進(jìn)行，簡述如下：將HeLa細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶中，24 h后加入相應(yīng)的藥物和新鮮培養(yǎng)液，處理所需時間后，用冷PBS清洗，再用RIPA裂解液裂解細(xì)胞，離心后收集上清，取等量總蛋白上樣進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后，將分離的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，封閉液封閉1 h，之后加入一抗于4℃搖床孵育過夜，洗滌后，加入相應(yīng)的HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，最后用BeyoECL Plus化學(xué)發(fā)光試劑盒顯色，X線片顯影，F(xiàn)luor Chem 8000成像儀（AlphaInnotech）記錄結(jié)果，并用Alpha Ease FC軟件（AlphaInnotech）分析結(jié)果。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析 所有免疫印跡實驗均獨立重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以±s表示，用GraphPad Prism 4.0軟件進(jìn)行單因素方差分析，組間比較采用Newman-Keuls檢驗。

2 結(jié)果

2.1 CuE對HeLa細(xì)胞增殖的影響 如Fig 1所示，CuE對HeLa細(xì)胞增殖的抑制效應(yīng)呈劑量依賴性。藥物處理24 h，半數(shù)抑制濃度（IC50）為4.01 μmol·L-1；藥物處理 48 h，IC50為 0.06μmol·L-1。以下實驗藥物處理時間最長為24 h，因此選用24 h的 IC50附近的3個濃度（0.1、1、10μmol·L-1）用于進(jìn)一步的實驗。

Fig 1 Inhibitory effect of cucurbitacin E（CuE）on proliferation of HeLa cells**P＜0.01 vs control

2.2 CuE劑量依賴性抑制p70S6K的磷酸化作用p70S6K是已知的mTORC1的底物蛋白，是蛋白質(zhì)翻譯的關(guān)鍵調(diào)控因子之一，其磷酸化水平顯示mTORC1的活性［10］。如Fig 2A所示，使用不同濃度的藥物處理HeLa細(xì)胞2 h后，p70S6K的磷酸化水平受到明顯抑制，且呈劑量依賴性。CuE在1μmol·L-1濃度時，p-p70S6K的水平下調(diào)明顯，10μmol·L-1時已檢測不到磷酸化蛋白的表達(dá)。同時，1 μmol·L-1濃度的CuE處理另一細(xì)胞株MCF7細(xì)胞后，p70S6K的磷酸化水平也受到明顯抑制，且呈時間依賴性；在藥物處理2 h后，已檢測不到磷酸化蛋白的表達(dá)。

2.3 CuE對mTORC1下游信號蛋白磷酸化的時間依賴性效應(yīng) 進(jìn)一步以1μmol·L-1的CuE分析其對mTORC1下游信號蛋白活化的時間依賴性效應(yīng)。除了p70S6K，4E-BP1是mTORC1的另外一個底物，它通過和真核細(xì)胞翻譯啟動因子4E（elF-4E）結(jié)合，從而抑制蛋白質(zhì)翻譯；核糖體 S6蛋白是p70S6K的下游蛋白，經(jīng)p70SK激酶作用磷酸化，增強 mRNA的翻譯［10］。如 Fig 3所示，CuE（1μmol·L-1）處理細(xì)胞后，可明顯下調(diào)p-p70S6K和p-S6的水平，且呈時間依賴性；然而，CuE同時上調(diào)4E-BP1和p-4E-BP1的表達(dá)，也呈時間依賴性。這提示CuE對mTORC1活性的抑制作用具有底物特異性。

Fig 2 Inhibitory effect of CuE on phosphorylation of mTORC1 substrate p70S6KA：CuE inhibited the phosphorylation of p70S6K in a dose-dependent manner in HeLa cells；B：CuE inhibited the phosphorylation of p70S6K in a time-dependent manner in MCF7 cells.The relative densitometry ratios of p-p70S6K against its total p70S6K are shown under each band.

Fig 3 Time-dependent effect of CuE on phosphorylation of downstream signaling proteins of mTORC1 in HeLa cellsThe relative densitometry ratios of the downstream signaling proteins of mTORC1 against their respective total proteins orβ-tubulin（for p-S6）are shown under each band.

2.4 CuE對自噬相關(guān)蛋白 LC3和 p62／SQSTM1的影響 LC3（microtubule-associated protein 1 light chain 3）是哺乳動物中的Atg8同源蛋白，細(xì)胞自噬過程中，可溶性的LC3-Ⅰ轉(zhuǎn)化為膜結(jié)合型的LC3-Ⅱ，后者較前者具有更高的電泳遷移率；LC3-Ⅱ的相對含量以及兩者的比例能夠反映自噬小體的數(shù)量，是常用的自噬小體標(biāo)志物，用于評價細(xì)胞自噬的水平［12］。p62／SQSTM1蛋白起著連接 LC3蛋白和泛素化底物的作用，從而將被降解物納入自噬小體中，并最終被自噬溶酶體降解。CuE處理細(xì)胞24 h后能使LC3-Ⅱ的表達(dá)明顯上調(diào)，并呈劑量依賴性（Fig 4A，4B）。以溶酶體抑制劑 CQ（20μmol·L-1）預(yù)處理細(xì)胞1 h后，再以CuE處理細(xì)胞不同時間后，LC3-Ⅱ的表達(dá)比單獨CuE處理更高（Fig 4C，4D），說明CuE確實誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬，而不是由于阻斷自噬小體與溶酶體的融合和降解。同時，CuE處理后，細(xì)胞內(nèi) p62／SQSTM1的水平下降（Fig 4E，4F），進(jìn)一步說明CuE確實誘導(dǎo)了HeLa細(xì)胞發(fā)生了細(xì)胞自噬。

2.5 CuE抑制ULK1的磷酸化 ULK（Unc-51-like kinase）是哺乳動物細(xì)胞內(nèi)存在的Atg1的同源蛋白，mTORC1可通過使ULK1磷酸化而抑制細(xì)胞自噬。CuE處理細(xì)胞不同時間后，p-ULK1S757的表達(dá)量降低（Fig 5），說明CuE可能通過抑制mTORC1下調(diào)p-ULK1S757水平，從而解除對自噬啟動步驟的抑制，誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。

3 討論

細(xì)胞自噬是一種自我降解的過程，是調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的重要途徑，也是細(xì)胞面對各種環(huán)境應(yīng)激（包括藥物）時的主要存活機(jī)制［4］；細(xì)胞自噬的激活能為處于營養(yǎng)缺乏等應(yīng)激條件下的細(xì)胞提供氨基酸、脂類等營養(yǎng)物質(zhì)，有助于細(xì)胞抵抗死亡信號而度過難關(guān)；另一方面，自噬的過度活躍則會過度損傷細(xì)胞器，促進(jìn)自噬性細(xì)胞死亡或通過激活凋亡／壞死通路誘導(dǎo)細(xì)胞死亡［4］。mTORC1在調(diào)控細(xì)胞自噬過程中發(fā)揮重要作用。p70S6K作為mTOR的重要底物，其磷酸化水平反映了mTORC1的活性［10］。我們在本研究中發(fā)現(xiàn)，CuE可能通過抑制mTORC1活性（通過測定p-p70S6K的磷酸化水平顯示），進(jìn)而抑制自噬啟動環(huán)節(jié)的ULK1的磷酸化水平，上調(diào)LC3-Ⅱ的表達(dá)（自噬小體的形成），從而誘導(dǎo)細(xì)胞自噬的發(fā)生。

自噬小體的形成是自噬過程中的核心步驟。PI3K（class Ⅲ phoshatidylinositol 3-kinase）復(fù)合體參與早期吞噬泡膜的組裝［13］。PI3K復(fù)合體與Atg13、Atg20及Atg24等蛋白結(jié)合，進(jìn)而招募兩類泛素結(jié)合系統(tǒng)Atg12-Atg5-Atg16和Atg8-PE到吞噬泡（phagophore）上，最后形成完整的自噬小體。哺乳動物內(nèi)Atg8的同源物L(fēng)C3與磷脂酰乙醇胺（PE）結(jié)合，形成LC3-Ⅱ（即LC3-PE），定位于自噬小體的內(nèi)膜和外膜，作為自噬小體形成的標(biāo)記蛋白［12］。我們發(fā)現(xiàn)，CuE使細(xì)胞中LC3-Ⅱ表達(dá)量增加，使用CQ預(yù)處理細(xì)胞，LC3-Ⅱ表達(dá)量進(jìn)一步升高，說明CuE確實誘導(dǎo)了細(xì)胞自噬。而p62的降解，說明自噬小體與溶酶體融合并被降解，細(xì)胞自噬進(jìn)程是完整的。

我們進(jìn)一步探討了CuE抑制mTORC1與誘導(dǎo)自噬的相關(guān)性。mTORC1可磷酸化ULK1的S757位點而抑制細(xì)胞自噬，抑制 mTORC1活性則使S757位點磷酸化水平下降，ULK1的多個其它位點被磷酸化，從而激活ULK1，進(jìn)而磷酸化Atg13和FIP200，最終誘導(dǎo)自噬的發(fā)生［14］。本研究顯示，CuE能抑制mTORC1的活性，進(jìn)而下調(diào)p-ULK1S757的表達(dá)，CuE引起的ULK1S757磷酸化水平下調(diào)可能是其誘導(dǎo)自噬的重要機(jī)制。然而，CuE是否影響到ULK1其它位點的磷酸化，則需要進(jìn)一步的研究闡明。

Fig 4 Effect of CuE on levels of autophagy-associated proteins in HeLa cellsA：CuE elevated the expression of LC3-Ⅱ in a dose-dependent manner；B：Histograms of the relative densitometry ratios of LC3-Ⅱ againstβ-tubulin；C：CuE further increased the expression of LC3-Ⅱ in the presence of CQ；D：Histograms of the relative densitometry ratios of LC3-Ⅱ againstβ-tubulin；E：CuE decreased the levels of p62／SQSTM1；F：Histograms of the relative densitometry ratios of p62／SQSTM1 againstβ-tubulin.*P＜0.05，**P＜0.01 vs control.

Fig 5 CuE decreased the phosphorylation levels of ULK1 in HeLa cellsThe relative densitometry ratios of p-ULK1 against the total ULK1 are shown under each band.

據(jù)我們所知，CuE抑制mTORC1的現(xiàn)象尚未見報道，但以往的研究已報告了葫蘆素 B能抑制mTOR的活性［8］，這與我們的研究結(jié)果相一致。Zhang等［6］報道葫蘆素B和I通過促進(jìn)線粒體來源的ROS產(chǎn)生，激活MAPK信號通路而誘導(dǎo)自噬，這與我們的研究結(jié)果不一致，其原因尚不清楚。然而，以往的研究在人A357和小鼠B16F10黑素瘤細(xì)胞中證明葫蘆素B并不能提升ROS水平［7］，這提示在不同的細(xì)胞中，葫蘆素B誘導(dǎo)自噬的機(jī)制可能不同。我們還在另一細(xì)胞株MCF7細(xì)胞上發(fā)現(xiàn)CuE能抑制mTORC1的活性，提示CuE對mTORC1的抑制作用可能是一種普遍現(xiàn)象。

雷帕霉素作為mTORC1的特異性抑制劑，能夠明顯下調(diào)p-p70S6K的水平，但卻可上調(diào)p-4E-BP1的表達(dá)水平［15］。這與我們在CuE上的研究結(jié)果相似，說明CuE抑制mTORC1的作用具有底物特異性。需要指出，本研究觀察到CuE抑制mTORC1活性，但這種抑制作用的分子機(jī)制尚不清楚。以往的研究表明，CuE影響肌動蛋白聚集，破壞肌動蛋白細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)［2］，而肌動蛋白聚集與mTORC1是否存在相互作用，還需進(jìn)一步研究闡明。

綜上所述，CuE通過抑制mTORC1活性，調(diào)控mTORC1信號通路，在HeLa細(xì)胞中誘導(dǎo)細(xì)胞自噬。這一研究結(jié)果為進(jìn)一步探索CuE的作用機(jī)制及其在抗腫瘤、抗病毒、抗炎中的作用提供實驗依據(jù)。

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