瓦他拉尼對乳腺癌耐藥蛋白介導的腫瘤多藥耐藥的逆轉(zhuǎn)研究

張志強，魏寅祥，趙 青，任志廣，彭 暉，李 鵬，夏 笠，許建華

（1.福建醫(yī)科大學藥學院，福建醫(yī)科大學新藥研究所，福建省天然藥物藥理學重點實驗室，福建福州 350004；2.軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所軍事環(huán)境藥學研究室，天津 300050）

腫瘤多藥耐藥（multidrug resistance，MDR）是指化療過程中腫瘤細胞對各種結(jié)構(gòu)和作用機制不同的化療藥物產(chǎn)生抗性的現(xiàn)象。其中，腫瘤細胞表面的一類 ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白（ATP-binding cassette transporters，ABC轉(zhuǎn)運蛋白）的過量表達，是導致腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥的重要因素之一［1-2］。目前在人類基因組中發(fā)現(xiàn)了49個編碼ABC轉(zhuǎn)運蛋白的基因，按其結(jié)構(gòu)差異可分為ABCA至ABCG 7個大類［1］。這些ABC轉(zhuǎn)運蛋白可依靠ATP供能，對包括化療藥物到天然產(chǎn)物在內(nèi)的多種底物進行轉(zhuǎn)運和外排。在ABC轉(zhuǎn)運蛋白超家族中至少有4個ABC蛋白亞家族的13種轉(zhuǎn)運蛋白參與腫瘤MDR的形成［2］，其中 P糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp／ABCB1／MDR1），乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP／ABCG2／MXR）和多藥耐藥相關(guān)性蛋白 1（multidrug resistance protein1，MRP1／ABCC1）與腫瘤MDR關(guān)系最為密切的［3］。通過這些轉(zhuǎn)運蛋白將各種結(jié)構(gòu)和功能不同的化療藥物外排至腫瘤細胞外，進而降低胞內(nèi)化療藥物的有效濃度是導致腫瘤細胞產(chǎn)生多藥耐藥的主要機制之一，而且得到了臨床證實。

乳腺癌耐藥蛋白從1998年發(fā)現(xiàn)至今才15年，但是它已經(jīng)成為了近年新的治療靶點［4］。以BCRP蛋白為治療靶標，設(shè)計合成能與其相互作用的小分子化合物來特異性干擾關(guān)鍵的病理環(huán)節(jié)，終止或減緩癌癥的發(fā)生和發(fā)展，成為當前抗癌藥物研究的一個新方向。一方面，以克服腫瘤MDR為目的主要進行的是研發(fā)P-gp抑制劑［5］，而針對BCRP抑制劑的研發(fā)則相對較少。另一方面，現(xiàn)有的BCRP抑制劑主要是從功能方面來阻斷BCRP外排底物的功能，較少通過影響B(tài)CRP蛋白表達來解決耐藥問題。前者屬于短效機制，而后者屬于長效機制。因此，亟需繼續(xù)尋找針對BCRP介導的MDR的新機制逆轉(zhuǎn)劑。

瓦他拉尼（vatalanib）是由諾華和先靈公司開發(fā)的口服噠嗪類酪氨酸激酶抑制劑，能夠直接作用于VEGF受體的ATP結(jié)合位點，同時還可以抑制FLT-1、FLK-1／KDR、PDGFR-h、FLT-4、C-KIT和 C-FMS等多種酪氨酸激酶，并抑制上皮細胞的遷移和增殖［6］。已有研究顯示瓦他拉尼可以抑制包括表皮、結(jié)腸、前列腺、腎臟和甲狀腺等的異體腫瘤細胞移植瘤的生長，但對不表達VEGF受體的細胞沒有細胞毒性或抗增殖作用［7］。動物實驗表明瓦他拉尼在小鼠腎癌細胞及其轉(zhuǎn)移模型中能夠減少腫瘤細胞血管的流量，進而抑制癌細胞的生長及擴散［8］。目前，瓦他拉尼在臨床上應用于結(jié)腸癌、原發(fā)性腫瘤及實體腫瘤的治療，但是關(guān)于其與BCRP和MDR的研究尚未見報道。本文將瓦他拉尼與底物類抗癌藥共同作用于BCRP、P-gp、MRP1高表達的耐藥細胞株及其親本細胞株上，從功能、細胞、蛋白、基因等多個層次來評價瓦他拉尼逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的效果，并初步探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑 瓦他拉尼購自百靈威公司；Ko143、Bafilomycin A1、SRB、羅丹明123和 DMSO購自美國Sigma公司；阿霉素（ADR）購自浙江海正藥業(yè)有限公司；米托蒽醌（MX）和托泊替康（TOPT）購自江蘇豪森制藥有限公司；維拉帕米（VRP）購自上海禾豐制藥有限公司；MTS細胞毒檢測試劑盒及V3601型P-gp-GloTM檢測系統(tǒng)購自美國Promega公司；BCA蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司；PE標記的抗BCRP抗體 5D3購自美國 eBiosciences公司；抗MRP1的單抗購自美國APR公司；抗BCRP的單抗BXP21及抗P-gp的單抗C219購自英國Abcam公司；Akt，p-Akt（Ser473），ERK和 p-ERK（Thr202／Tyr204）抗體均購自美國 Cell Signaling Technology公司；HRP標記的羊抗兔和羊抗鼠二抗購自美國KPL公司；G418和TRIzol購自美國Invitrogen公司；TransSript First-Stand cDNA Synthesis Supermix逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京全式金公司；SYBR Green Realtime PCR Master Mix購自日本Toyobo公司；RPMI 1640和DMEM細胞培養(yǎng)基購自美國Hyclone公司；胎牛血清購自元亨金馬公司；其余試劑均為進口或國產(chǎn)分析純試劑。

1.2 細胞 人慢性粒細胞白血病細胞株K562由本室保存，相應的P-gp高表達耐藥細胞株K562／A02由中國醫(yī)學科學院血液學研究所藥物室熊冬生教授惠贈［9］。兩種細胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。其中K562／A02細胞的培養(yǎng)基加入濃度為1.0 mg·L-1的阿霉素以維持其耐藥性及P-gp的高表達。

HEK293／ABCG2和 HEK293／ABCC1分別是BCRP與MRP1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達的耐藥細胞株，HEK293／VEC為空載體轉(zhuǎn)染的穩(wěn)定表達的敏感型細胞株，由美國印第安納大學醫(yī)學院藥理和毒理系張建亭教授惠贈［10］。以上細胞株均為貼壁細胞，培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基。此外，需在培養(yǎng)基中加入200 mg·L-1的G418以保證外源基因的高表達。

所有細胞均置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，CO2濃度保持在5%，使用前1周停藥。

1.3 細胞毒及耐藥逆轉(zhuǎn)作用的測定 耐藥與敏感細胞分別以含10%FBS的培養(yǎng)基重懸，按照一定濃度接種于 96孔微孔板，HEK293／ABCG2與HEK293／ABCC1及 HE293／VEC按5×103細胞／孔接種，K562／A02與K562按8×103細胞／孔接種，每孔接種體積為160μl，并在5%CO2、37℃條件下培養(yǎng)24 h。然后分別按濃度梯度加入瓦他拉尼或陽性對照藥溶液20μl，孵育1 h后加入劑量為IC10的底物類抗癌藥。瓦他拉尼在所用實驗中的濃度梯度均為低濃度（CL）：1.25μmol·L-1，中濃度（CM）：2.5 μmol·L-1，高濃度（CH）：5.0μmol·L-1。針對BCRP介導的耐藥逆轉(zhuǎn)活性測定：選取PZ-38為陽性對照［11］，其濃度梯度為，低濃度（CL）：0.62μmol·L-1、中濃度（CM）：1.25μmol·L-1、高濃度（CH）：2.5μmol·L-1；MX、TOPT、ADR在 HEK293／ABCG2細胞中的終濃度依次為200、80 nmol·L-1及 200μg·L-1；MX、TOPT、ADR在 HEK293／VEC中終濃度為 5、20 nmol·L-1及 10μg·L-1。針對P-gp介導的耐藥逆轉(zhuǎn)活性測定：選取VRP為陽性對照藥，濃度梯度為 CL：0.62μmol·L-1，CM：1.25 μmol·L-1，CH：2.5μmol·L-1，ADR在 K562／A02中的終濃度為2 mg·L-1；針對MRP1介導的耐藥逆轉(zhuǎn)活性測定：選取VRP為陽性對照藥，濃度為CL：1.25μmol·L-1，CM：2.5μmol·L-1，CH：5.0 μmol·L-1，ADR在 HEK293／ABCC1中的終濃度為40μg·L-1。除了將0.5%DMSO組設(shè)為溶劑對照外，化合物最高濃度組和抗癌藥物單獨作用組也分別設(shè)置對照。最后，在5%CO2、37℃條件下繼續(xù)培養(yǎng)72 h后檢測細胞的生存率。

1.4 ABC-轉(zhuǎn)運蛋白介導的外排功能和BCRP構(gòu)象變化的檢測

1.4.1 外排功能的檢測 分別收集耐藥細胞和敏感細胞并計數(shù)，按5×108cells·L-1用相應培養(yǎng)基重懸，分裝至1.5 ml EP管中待用。分別加入溶劑對照、陽性對照和不同濃度的瓦他拉尼，37℃恒溫水浴30 min。除裸細胞管外，各管加入相應的底物（終濃度分別為 20μmol·L-1MX、0.5μmol·L-1Rh-123、10μmol·L-1ADR），37℃避光孵育 30 min。取出 EP管，2 500 r·min-1離心5 min，棄去上清，用預冷生理鹽水洗滌兩次，每次1 ml。然后，用300μl預冷的生理鹽水重懸細胞，上流式細胞儀檢測。以MX（檢測通道FL-4）、Rh-123（檢測通道FL-1）、ADR（檢測通道 FL-2）分別為 BCRP、P-gp和MRP1的底物來檢測瓦他拉尼對ABC-轉(zhuǎn)運蛋白外排功能的影響。

1.4.2 構(gòu)象變化的檢測 瓦他拉尼影響B(tài)CRP構(gòu)象變化的檢測方法參照參考文獻所述［12］。主要步驟為：收集HEK293／ABCG2細胞并計數(shù)，按5×108cells·L-1的密度用2%FBS的生理鹽水重懸，按1 ml／管分裝至 1.5 ml EP管中待用。分別加入Na3VO4至終濃度1 mmol·L-1，PZ-38至終濃度10 μmol·L-1，瓦他拉尼至終濃度 5μmol·L-1，并調(diào)整DMSO終濃度至1‰，37℃孵育10 min。在4℃下，2 000 r·min-1離心5 min，棄去培養(yǎng)基并用2%FBS的生理鹽水洗滌1次。將5D3抗體用含2%FBS的生理鹽水按1∶20的比例稀釋，除裸細胞管外，每管加入100μl抗體，冰上震蕩避光孵育30 min，洗滌兩次后重懸上機，檢測通道為FL-2。

1.5 Western blot檢測BCRP蛋白的表達水平

HEK293／ABCG2細胞以5×105細胞／孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜。分別加入 1.25、2.5、5.0μmol·L-1的瓦他拉尼處理48 h或者加入5μmol·L-1的該藥處理2、12、24、48 h后收集細胞，并用含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液提取細胞總蛋白。每孔加入等量的蛋白樣品，用10%的SDS-PAGE進行分離。隨后轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜，并用5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗（1∶1 000稀釋）4℃孵育過夜；1×TBST洗滌3次，每次10 min。接著，二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育2 h，1×TBST洗滌3次，每次10 min。最后，加入ECL進行顯影和暗室曝光。

1.6 qRT-PCR檢測BCRP mRNA的表達水平HEK293／ABCG2細胞以5×105細胞／孔接種于6孔板，培養(yǎng)過夜。分別加入 1.25、2.5、5.0μmol·L-1的瓦他拉尼處理48 h或者加入5.0μmol·L-1的該藥處理24、48和72 h后收集細胞，按照TRIzol試劑說明書提取細胞總RNA，按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒提供的體系將RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

qRT-PCR是以GADPH為參照基因，按照操作說明書用 SYBR Green PCR Super Mix來進行。BCRP引物序列正向為：5′-TCATCAGCCTCGATATTCCATCT-3′，反向：5′-GGCCCGTGGAACATAAGTCT T-3′；GADPH引物序列正向為：5′-CCGTCTAGAAAA ACCTGCC-3′，反向：5′-GCCAAATTCGTTGTCATACC-3′。反應條件：①95℃，3 min；②95℃，30 s；60℃，20 s；72℃，20 s，共計 30個循環(huán)。SYBR Green結(jié)合到雙鏈DNA后發(fā)射的熒光強度的實時檢測使用實時定量PCR儀（美國Bio-rad公司，型號：Icycler Instrument）來進行。PCR結(jié)束后通過繪制溶解曲線來驗證產(chǎn)物的純度。BCRP的相對定量使用2-△△Ct方法來進行。

1.7 BCRP的ATP水解酶活性的測定 BCRP的轉(zhuǎn)運依賴于ATP的水解來驅(qū)動，化合物與BCRP相互作用會影響ATPase活性。通過超速離心分離BCRP膜蛋白，并借用P-gp-GloTMAssay System（Promega V3601）提供的ATP依賴的螢火蟲熒光素酶發(fā)光效應進行檢測。BCRP首先與化合物共孵育，再添加入一定量的ATP，隨后終止BCRP ATPase的反應，未被水解酶代謝的剩余ATP通過熒光素酶反應體系被檢測出來。主要步驟如下：①用Assay Buffer分別稀釋瓦拉他尼、Na3VO4、TOPT、DMSO，DMSO終濃度均調(diào)整至1%，化合物終濃度為0.20 mmol·L-1，同時將提取的P-gp膜蛋白濃度稀釋至1.5 g·L-1，均放于冰上待用。② 取0.5 ml EP管，標記并加入相應化合物，置于冰上，各組均設(shè)3個復孔。DMSO組加入 20μl 1%DMSO的 Assay Buffer；Na3VO4、TOPT、瓦他拉尼各組加入20μl相應的化合物（在50μl體系中，最終工作濃度為40μmol·L-1）。③ 每管加入 20μl BCRP粗膜（1.5 g·L-1），37℃孵育5 min。④取出EP管，置于冰上，每管加 10μl Mg-ATP（25 mmol·L-1），37℃孵育 40 min。⑤取出EP管，將反應液加入到不透光96孔白板孔內(nèi)，每孔另加入50μl ATP檢測試劑。在室溫反應20 min后，用熒光光度計測量熒光強度。

1.8 統(tǒng)計學處理 數(shù)據(jù)以ˉx±s表示，組間比較采用方差分析，兩兩比較用q檢驗。

2 結(jié)果

2.1 瓦他拉尼對ABC-轉(zhuǎn)運蛋白介導腫瘤MDR的逆轉(zhuǎn)效果 無毒劑量的BCRP底物類抗癌藥MX、TOPT、ADR與不同濃度的瓦他拉尼在BCRP高表達的耐藥細胞或相對應的敏感細胞中共同作用，評價其逆轉(zhuǎn)腫瘤MDR的效果，PZ-38為陽性對照。結(jié)果表明，濃度為5μmol·L-1的瓦他拉尼單獨對耐藥和敏感細胞均無毒性（生存率大于90%）。瓦他拉尼在無毒劑量下可明顯增加耐藥細胞HEK293／ABCG2中 MX（Fig 1A）、TOPT（Fig 1B）、ADR（Fig 1C）的殺傷作用，并表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，而對敏感細胞HEK293／VEC無作用，這些結(jié)果表明了瓦他拉尼對BCRP介導的腫瘤MDR具有明顯增敏效果。

為了進一步驗證瓦他拉尼的逆轉(zhuǎn)作用是否具有特異性，我們以同樣的方法研究瓦他拉尼對P-gp和MRP1介導腫瘤MDR的逆轉(zhuǎn)效果。結(jié)果如Fig 1D所示，在P-gp高表達的K562／A02和MRP1高表達的HEK293／ABCC1耐藥細胞中，瓦他拉尼對 P-gp和MRP1介導的腫瘤MDR無明顯的增敏效果，而VRP作為對照，其逆轉(zhuǎn)效果明顯。因此，瓦他拉尼表現(xiàn)出針對BCRP介導MDR的特異性逆轉(zhuǎn)作用。

Fig 1 Reversal effects of vatalanib on ABC-transporters-mediated multidrug resistanceVarious concentrations of vatalanib（CL：1.25μmol·L-1，CM：2.5μmol·L-1，CH：5.0μmol·L-1）with substrates of ABC-transporters，and analyzed its reversal effects on multidrug resistance.A-CReversal effect of vatalanib on BCRP-mediated multidrug resistance，the final concentrations of mitoxantrone（MX），topotecan（TOPT），adriamycin（ADR）were200 nmol·L-1，80 nmol·L-1 and 200μg·L-1 in HEK 293／ABCG 2 cells；the final concentrations of MX，TOPT，ADR were 5 nmol·L-1，20 nmol·L-1 and 10μg·L-1 in HEK 293／Vec cells；Ko143（CL：0.62μmol·L-1，CM：1.25μmol·L-1，CH：2.5μmol·L-1）served as a positive control drug.D Reversal effect of valatinib on P-gp-mediated or MRP1-mediated multidrug resistance.The final concentration of ADR was 2 mg·L-1 in K562／A02 cells and 40μg·L-1 in HEK293／ABCC1 cells.VRP served as a positive control drug，its final concentrations were CL：0.62μmol·L-1，CM：1.25μmol·L-1，CH：2.5μmol·L-1 in K562／A02 cells and were CL：1.25μmol·L-1，CM：2.5μmol·L-1，CH：5.0μmol·L-1 in HEK293／ABCC1 cells.*P＜0.05 vs DMSO control.

2.2 瓦他拉尼與ABC-轉(zhuǎn)運蛋白作用關(guān)系分析

2.2.1 瓦他拉尼對ABC-轉(zhuǎn)運蛋白介導底物外排的影響 通過檢測瓦他拉尼作用后熒光底物在細胞內(nèi)積累量的變化，可反映出化合物對ABC-轉(zhuǎn)運蛋白外排功能的影響。結(jié)果表明，瓦他拉尼對BCRP（Fig 2A）、P-gp（Fig 2C）、MRP1（Fig 2D）介導的底物外排均無明顯的抑制作用。

2.2.2 瓦他拉尼對BCRP構(gòu)象變化的影響 據(jù)文獻報道，5D3抗體的結(jié)合率變化可反映出BCRP蛋白構(gòu)象的改變，因此，我們用5D3抗體進行了構(gòu)象變化的檢測。結(jié)果如Fig 2B所示，瓦他拉尼孵育后5D3抗體結(jié)合率并未明顯上升，表明瓦他拉尼對BCRP構(gòu)象無明顯的影響。

2.2.3 瓦他拉尼對BCRP的ATPase活性的影響為進一步研究瓦他拉尼與BCRP之間的作用關(guān)系，我們進行了ATPase活性分析。結(jié)果表明，瓦他拉尼可明顯激活BCRP的ATPase活性（Fig 2E）。

綜合以上實驗結(jié)果，我們認為瓦他拉尼可能是BCRP的底物，但也許由于親和力低或結(jié)合位點不同，因而不能抑制BCRP的外排活性。此外，對P-gp和MRP1介導的藥物外排功能亦無抑制作用。

2.3 瓦他拉尼對BCRP蛋白表達的影響 由于瓦他拉尼對BCRP的底物外排活性無抑制作用，為明確該藥逆轉(zhuǎn)BCRP介導MDR的具體機制，我們檢測了其對BCRP蛋白表達水平的影響。結(jié)果如Fig 3所示，瓦他拉尼對BCRP具有較明顯的降解作用，且呈時間和劑量依賴的效應。但同時值得注意的是瓦他拉尼的這一降解效果并不如陽性對照藥PZ-38強烈。此外，由于其并不引起B(yǎng)CRP構(gòu)象的變化，所以我們推測其引起B(yǎng)CRP降解的機制可能比較特殊。

Fig 2 Analysis of action relationship of vatalanib with ABC-transportersA：Effect on efflux MX function of BCRP；B：Effect on conformation of BCRP；C：Effect on efflux Rh-123 function of P-gp；D：Effect on efflux ADR function of MRP1；E：Effect on activity of ATPase of BCRP.*P＜0.05 vs DMSO control.

Fig 3 Effect of vatalanib on protein expression level of BCRPA：Dose-dependent effect；B：Time-dependent effect.PZ-38 served as a positive control drug.

2.4 瓦他拉尼對BCRP基因表達的影響 為了驗證瓦他拉尼對BCRP降解機制是否通過下調(diào)基因表達水平而起作用，于是我們進行了更深入的分析。結(jié)果如Fig 4所示，該藥下調(diào)BCRP基因的表達具有明顯的量效關(guān)系（Fig 4A）和一定的時效關(guān)系（Fig 4B）。5.0μmol·L-1的瓦他拉尼處理耐藥細胞72 h后，可導致BCRP表達水平下降至60%左右，而在10μmol·L-1時，藥物處理72 h后則可使BCRP表達水平下降至50%以下。這表明，瓦他拉尼對BCRP表達的調(diào)節(jié)可能發(fā)生在轉(zhuǎn)錄或翻譯前水平上。

Fig 4 Effect of vatalanib on protein expression level of BCRPA：Dose-dependent effect；B：Time-dependent effect.*P＜0.05 vs DMSO control.

Fig 5 Effect of vatalanib on signal moleculars related to cell proliferation

2.5 瓦他拉尼對信號通路相關(guān)蛋白的影響 為了進一步尋找瓦他拉尼對BCRP逆轉(zhuǎn)耐藥的相關(guān)機制，我們分別檢測了瓦他拉尼對耐藥和敏感細胞中的腫瘤增殖相關(guān)信號分子的影響。結(jié)果如Fig 5所示，在有效的逆轉(zhuǎn)濃度下，瓦他拉尼對耐藥和敏感細胞中AKT和ERK及其磷酸化水平無明顯影響。

3 討論

作為一種新近發(fā)現(xiàn)的介導腫瘤MDR的跨膜藥物轉(zhuǎn)運蛋白，BCRP是抗腫瘤藥物難以發(fā)揮效應的關(guān)鍵蛋白。傳統(tǒng)的腫瘤MDR逆轉(zhuǎn)劑如維拉帕米和三苯氧胺等對BCRP介導的MDR并無逆轉(zhuǎn)作用。隨著對BCRP研究的深入，如何逆轉(zhuǎn)由BCRP介導的MDR也成為人們研究的熱點。目前所有針對BCRP外排功能的拮抗劑都處于實驗室的研究階段，其大致分為三類：①MDR廣譜的逆轉(zhuǎn)劑，如最具代表性的第二代逆轉(zhuǎn)劑GF120918；②其它靶標的抑制劑，如BCR-ABL酪氨酸激酶的選擇性抑制劑伊馬替尼（STI571）和表皮生長因子受體（EGFR）酪氨酸激酶抑制劑吉非替尼，這些逆轉(zhuǎn)劑基本上都是老藥新用，均有針對性很強的治療功能。但是，當將其作為逆轉(zhuǎn)劑應用時，其原有的治療功能必然帶來嚴重的毒副作用。因而，在臨床研究中實際用藥劑量很低，患者血藥濃度遠遠低于體外研究所用的最佳活性的濃度。③BCRP特異性抑制劑，目前關(guān)于此類抑制劑的相關(guān)文獻報道甚少，如霉菌毒素C（fumitremorgin C，F(xiàn)TC）及衍生物、6-prenylchrysin和楊芽黃素。FTC是最早發(fā)現(xiàn)，也是迄今為止最為高效的BCRP特異性抑制劑，但其神經(jīng)毒性限制了臨床使用。因此，繼續(xù)尋找針對BCRP介導的耐藥腫瘤安全有效的、高度特異性的逆轉(zhuǎn)劑是十分必要的。開展BCRP蛋白抑制劑的研究將使我國在抗耐藥腫瘤研究方面占據(jù)有利位置。

BCRP雖然發(fā)現(xiàn)和研究較晚，但也被證實與蛋白激酶抑制劑耐藥相關(guān)。Ozvegy-Laczka等［13］認為BCRP與多種PKI耐藥相關(guān)，其研究表明HL60／PLB細胞轉(zhuǎn)入野生型BCRP后表現(xiàn)出對吉非替尼的耐藥性。而Elkind等［14］的實驗則表明該藥可被BCRP外排，因而降低了其對EGFR的抑制效果。Burger等［15］報道，BCRP不僅與腫瘤細胞對伊馬替尼的耐藥相關(guān)，還通過影響胃腸道吸收而影響此藥的療效。此外，Hegedus等［16］的研究則表明 BCRP與尼洛替尼和達沙替尼的耐藥具有相關(guān)性。

伊馬替尼作為首個投入臨床使用的激酶類抑制劑，其與 BCRP的相互作用關(guān)系研究較為全面。Houghton等［17］報道該藥可通過抑制外排作用，逆轉(zhuǎn)BCRP介導的 TOPT和 SN-38的耐藥。Liu等［18］的研究表明伊馬替尼能夠抑制BCRP對光敏劑的外排，而且在體內(nèi)與體外均可增加光動力療法的療效。Nakanishi等［19］的研究表明伊馬替尼可降低K562／BCRP-MX10中BCRP的表達量進而緩解其對該種藥物的耐藥，但這一現(xiàn)象并未在其他BCRP高表達的細胞中出現(xiàn)，還需要進一步的確認。Tiwari等［20］首先報道尼洛替尼在無毒濃度下（2.5～5.0μmol·L-1）可明顯地逆轉(zhuǎn)P-gp和BCRP的外排活性，卻對其蛋白的表達無影響。Shukla等［21］和 Dai等［22］分別報道了舒尼替尼可通過抑制外排功能進而逆轉(zhuǎn)BCRP介導的MDR。Shi等［23］報道厄洛替尼可以抑制BCRP的外排作用從而起到逆轉(zhuǎn)作用。Dai等［24］報道拉帕替尼通過抑制P-gp和BCRP的外排作用進而在體內(nèi)和體外顯示逆轉(zhuǎn)MDR的活性。Yang等［25］的實驗則表明在臨床用藥濃度下，吉非替尼在體外除了可抑制P-gp以外，還可逆轉(zhuǎn)BCRP介導的MDR。Zheng等［26］的研究則發(fā)現(xiàn)凡德他尼還可以抑制BCRP和MRP1的底物外排活性，并且在體外起到逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，但是這些逆轉(zhuǎn)作用卻與其對AKT和ERK的抑制活性無關(guān)。以上結(jié)果均顯示，臨床上所使用的激酶類抑制劑可用于MDR的逆轉(zhuǎn)研究。

在本研究中，5μmol·L-1（IC10以內(nèi)）的瓦他拉尼雖然在功能水平上不能有效抑制BCRP的外排活性，但是在蛋白水平上卻能夠明顯降低BCRP的表達，并且在細胞水平上可以逆轉(zhuǎn) BCRP介導的MDR。然而，其對P-gp和MRP1則未表現(xiàn)出此類活性。本文首次報道了瓦他拉尼是一種特異而有效的BCRP介導的MDR逆轉(zhuǎn)劑。已有報道表明，瓦他拉尼臨床使用中的血藥濃度可達到（14.58±9.5）μmol·L-1［27］，超過本研究所用的濃度（5μmol·L-1）。此外，近期研究也證實了瓦他拉尼是CYP3A4酶的底物卻不影響其活性［28］。因而，本研究表明了這一逆轉(zhuǎn)策略應用的可行性。同時，目前多數(shù)BCRP抑制劑的開發(fā)還主要停留在功能抑制層面上。雖然其中部分化合物也具有降解BCRP蛋白的作用，但其作用往往是發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后的水平上。BCRP作為一種新近發(fā)現(xiàn)的且具有重要功能的ABC-轉(zhuǎn)運蛋白，對其轉(zhuǎn)錄或基因水平上的調(diào)節(jié)研究還相對較少。近期的多項研究表明，BCRP的表達在基因水平上會受到基因甲基化和啟動序列的調(diào)節(jié)，而瓦他拉尼對BCRP的表達調(diào)控是否屬于其中，或另有其他機制存在仍需進一步探討。但是這一機制的發(fā)現(xiàn)，至少為研究BCRP轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控提供了一些有益的工具和線索，同時也能為BCRP抑制劑的開發(fā)提供一些新的思路。

參考文獻：

［1］ Vasiliou V，Vasiliou K，Nebert D W.Human ATP-binding cassette（ABC）transporter family［J］.Hum Genomics，2009，3（3）：281-90.

［2］ Dean M，Rzhetsky A，Allikmets R.The human ATP-binding cassette（ABC）transporter superfamily［J］.Genome Res，2001，11（7）：1156-66.

［3］ Stavrovskaya A A，Stromskaya T P.Transport proteins of the ABC family and multidrug resistance of tumor cells［J］.Biochemistry（Mosc），2008，73（5）：592-604.

［4］ Xu J，Peng H，Zhang JT.Human multidrug transporter ABCG2，a target for sensitizing drug resistance in cancer chemotherapy［J］.Curr Med Chem，2007，14（6）：689-701.

［5］ 秦小清，梁宇光，高洪志，等.五味子甲素對 K562／ADR，HL60／ADR，MCF-7／ADR多藥耐藥逆轉(zhuǎn)機制的研究［J］.中國藥理學通報，2011，27（3）：329-34.

［5］ Qin X Q，Lian Y G，Gao H Z，et al.Reversing mechanism of schizandrin A on multi-drug resistance of K562／ADR，HL60／ADR，MCF-7／ADR cell lines［J］.Chin Pharmacol Bull，2011，27（3）：329-34.

［6］ Manley P W，F(xiàn)uret P，Bold G，et al.Anthranilic acid amides：a novel class of antiangiogenic VEGF receptor kinase inhibitors［J］.J Med Chem，2002，45（26）：5687-93.

［7］ Liu Y，Poon R T，Li Q，et al.Both antiangiogenesis-and angiogenesis-independent effects are responsible for hepatocellular carcinoma growth arrest by tyrosine kinase inhibitor PTK787／ZK222584［J］.Cancer Res，2005，65（9）：3691-9.

［8］ Lee L，Sharma S，Morgan B，et al.Biomarkers for assessment of pharmacologic activity for a vascular endothelial growth factor（VEGF）receptor inhibitor，PTK787／ZK 222584（PTK／ZK）：translation of biological activity in a mouse melanoma metastasis model to phase Istudies in patients with advanced colorectal cancer with liver metastases［J］.Cancer Chemother Pharmacol，2006，57（6）：761-71.

［9］ Yang C Z，Luan F J，Xiong D S，et al.Multidrug resistance in leukemic cell line K562／A02 induced by doxorubicin［J］.Zhongguo Yao Li Xue Bao，1995，16（4）：333-7.

［10］Peng H，Dong Z，Qi J，et al.A novel two mode-acting inhibitor of ABCG2-mediated multidrug transport and resistance in cancer chemotherapy［J］.PLoSOne，2009，4（5）：e5676.

［11］Peng H，Qi J，Dong Z，Zhang JT.Dynamic vs static ABCG2 inhibitors to sensitize drug resistant cancer cells［J］.PLoS One，2010，5（12）：e15276.

［12］Ozvegy-Laczka C，Varady G，Koblos G，et al.Function-dependent conformational changes of the ABCG2 multidrug transporter modify its interaction with a monoclonal antibody on the cell sur-face［J］.J Biol Chem，2005，280（6）：4219-27.

［13］Ozvegy-Laczka C，Hegedus T，Varady G，et al.High-affinity interaction of tyrosine kinase inhibitors with the ABCG2 multidrug transporter［J］.Mol Pharmacol，2004，65（6）：1485-95.

［14］Elkind N B，Szentpetery Z，Apati A，et al.Multidrug transporter ABCG2 prevents tumor cell death induced by the epidermal growth factor receptor inhibitor Iressa（ZD1839，Gefitinib）［J］.Cancer Res，2005，65（5）：1770-7.

［15］Burger H，van Tol H，Boersma A W，et al.Imatinib mesylate（STI571）is a substrate for the breast cancer resistance protein（BCRP）／ABCG2 drug pump［J］.Blood，2004，104（9）：2940-2.

［16］Hegedus C，Ozvegy-Laczka C，Apati A，et al.Interaction of nilotinib，dasatinib and bosutinib with ABCB1 and ABCG2：implications for altered anti-cancer effects and pharmacological properties［J］.Br J Pharmacol，2009，158（4）：1153-64.

［17］Houghton P J，Germain GS，Harwood F C，et al.Imatinib mesylate is a potent inhibitor of the ABCG2（BCRP）transporter and reverses resistance to topotecan and SN-38 in vitro［J］.Cancer Res，2004，64（7）：2333-7.

［18］Liu W，Baer M R，Bowman M J，et al.The tyrosine kinase inhibitor imatinib mesylate enhances the efficacy of photodynamic therapy by inhibiting ABCG2［J］.Clin Cancer Res，2007，13（8）：2463-70.

［19］Nakanishi T，Shiozawa K，Hassel B A，Ross DD.Complex interaction of BCRP／ABCG2 and imatinib in BCR-ABL-expressing cells：BCRP-mediated resistance to imatinib is attenuated by imatinib-induced reduction of BCRP expression［J］.Blood，2006，108（2）：678-84.

［20］Tiwari A K，Sodani K，Wang SR，et al.Nilotinib（AMN107，Tasigna）reverses multidrug resistance by inhibiting the activity of the ABCB1／Pgp and ABCG2／BCRP／MXR transporters［J］.Biochem Pharmacol，2009，78（2）：153-61.

［21］Shukla S，Robey R W，Bates S E，Ambudkar S V.Sunitinib（Sutent，SU11248），a small-molecule receptor tyrosine kinase inhibitor，blocks function of the ATP-binding cassette（ABC）transporters P-glycoprotein（ABCB1）and ABCG2［J］.Drug Met Dispos，2009，37（2）：359-65.

［22］Dai C L，Liang Y J，Wang Y S，et al.Sensitization of ABCG2-overexpressing cells to conventional chemotherapeutic agent by sunitinib was associated with inhibiting the function of ABCG2［J］.Cancer Lett，2009，279（1）：74-83.

［23］Shi Z，Peng X X，Kim I W，et al.Erlotinib（Tarceva，OSI-774）antagonizes ATP-binding cassette subfamily B member 1 and ATP-binding cassette subfamily G member 2-mediated drug resistance［J］.Cancer Res，2007，67（22）：11012-20.

［24］ Dai C L，Tiwari A K，Wu C P，et al.Lapatinib（Tykerb，GW572016）reverses multidrug resistance in cancer cells by inhibiting the activity of ATP-binding cassette subfamily B member 1 and G member 2［J］.Cancer Res，2008，68（19）：7905-14.

［25］Yang C H，Huang CJ，Yang CS，et al.Gefitinib reverses chemotherapy resistance in gefitinib-insensitive multidrug resistant cancer cells expressing ATP-binding cassette family protein［J］.Cancer Res，2005，65（15）：6943-9.

［26］Zheng L S，Wang F，Li Y H，et al.Vandetanib（Zactima，ZD6474）antagonizes ABCC1-and ABCG2-mediated multidrug resistance by inhibition of their transport function［J］.PLoS One，2009，4（4）：e5172.

［27］Jost L M，Gschwind H P，Jalava T，et al.Metabolism and disposition of vatalanib（PTK787／ZK-222584）in cancer patients［J］.Drug Met Dispos，2006，34（11）：1817-28.

［28］Reardon D A，Egorin M J，Desjardins A，et al.Phase I pharmacokinetic study of the vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor vatalanib（PTK787）plus imatinib and hydroxyurea for malignant glioma［J］.Cancer，2009，115（10）：2188-98.