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      內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激介導(dǎo)高脂及棕櫚酸致骨骼肌胰島素抵抗及非諾貝特的干預(yù)機制初探

      2014-05-17 02:28:03鮑瑩瑩魯云霞陳冠軍程靜靜
      中國藥理學(xué)通報 2014年11期
      關(guān)鍵詞:非諾貝特高脂

      鮑瑩瑩,魯云霞,陳冠軍,程靜靜,章 秋

      (1.安徽醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院內(nèi)分泌科,安徽合肥 230022;2.安徽醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)教研室,安徽 合肥 230032;3.安徽醫(yī)科大學(xué)化學(xué)教研室,安徽合肥 230032)

      隨著人們生活方式和飲食習(xí)慣的改變,代謝綜合征已成為新型流行性疾病,胰島素抵抗(insulin resistance,IR)是其重要的病理學(xué)特征之一[1]。骨骼肌是體內(nèi)最大、分布最廣的代謝活性組織,約占機體重量的40%,承擔(dān)了機體絕大部分脂肪酸的攝取和氧化利用,以及胰島素刺激下70%~90%的葡萄糖吸收,是發(fā)生IR的主要外周組織[2],但其參與IR的具體機制目前尚不很清楚。

      近年來,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)作為IR和肥胖發(fā)生的重要環(huán)節(jié),已引起了廣泛的關(guān)注[3]。非諾貝特(fenofibrate,F(xiàn)F)是臨床常用的調(diào)脂藥,可降脂、抗炎、抗氧化應(yīng)激和改善IR,但尚無其參與 ERS介導(dǎo)骨骼肌 IR的報道[4]。本研究擬通過動物實驗研究非諾貝特對高脂血癥大鼠骨骼肌組織ERS及IR的影響;非諾貝特酸(fenofibric acid,F(xiàn)A)是非諾貝特在體內(nèi)的代謝產(chǎn)物,通過細胞驗研究FA對棕櫚酸(palmitic acid,PA)誘導(dǎo)小鼠骨骼肌細胞C2C12中產(chǎn)生ERS及IR的影響,旨在揭示非諾貝特改善IR的機制是否與減少ERS有關(guān)。

      1 材料與方法

      1.1 實驗動物與細胞株 SD大鼠45只,8周齡,清潔級,♀,體質(zhì)量180~200 g,由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。小鼠C2C12骨骼肌細胞株,由中國科學(xué)院北京生物物理學(xué)研究所劉平生研究員惠贈。

      1.2 主要藥物與試劑 非諾貝特購自江蘇神龍藥業(yè)有限公司;非諾貝特酸、胰島素、棕櫚酸、衣霉素、無游離脂肪酸的牛血清白蛋白購自美國Sigma公司;DMEM培養(yǎng)基購自美國Invitrogen公司;四季青胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司;RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Fermentas Life Sciences;RNAiso Reagent、Real-time PCR試劑盒購自大連寶生物工程有限公司;所有引物均采用Primer 5.0軟件設(shè)計,由上海生工生物工程公司合成(Tab 1和Tab 2)。RIPA裂解液購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司。鼠抗GAPDH單克隆抗體、鼠抗CHOP單克隆抗體、兔抗Akt和p-Akt多克隆抗體均購自美國CST公司;兔抗GRP78多克隆抗體購自美國Abcam公司;羊抗小鼠二抗、羊抗兔二抗、FITC標記羊抗小鼠二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;增強化學(xué)發(fā)光底物檢測試劑盒(ECL發(fā)光劑)購自碧云天生物技術(shù)研究所;DAPI購自Biosharp生物科技有限公司。

      1.3 動物和分組 將SD大鼠隨機分為標準飲食組(SCD,n=12)和高脂飲食組(HFD,n=33)。SCD組給予標準飼料,由安徽醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心提供;HFD組給予國際標準化高脂飲食(D12451,脂肪含量為45%)。20周后,取體重明顯增加的大鼠24只隨機分為HFD組(n=12)和高脂飲食+非諾貝特組(HFD+FF,n=12),HFD組繼續(xù)給予高脂飲食8周,HFD+FF組在給予高脂飲食的同時給予非諾貝特灌胃治療,參考文獻[5]采用單一劑量(30 mg·kg-1·d-1)干預(yù)8周。

      1.4 胰島素抵抗檢測 28周時,大鼠禁食12 h,灌胃給予葡萄糖(2 g·kg-1體重,生理鹽水配制),分別于0、30、60、90、120 min鼠尾采血測定血糖水平,行葡萄糖耐量實驗(GTT);4 d后大鼠禁食4 h,腹腔注射胰島素(1 U·kg-1體重),分別于 0、30、60、90、120 min鼠尾采血測定血糖水平,行胰島素耐量實驗(ITT)。采血量約為5μl,采血過程中大鼠生命體征平穩(wěn)。

      1.5 血清脂代謝指標測定 所有大鼠禁食12 h后稱重,水合氯醛麻醉,腹主動脈取血,3 000 r·min-1離心5 min,分離血清,分析血清葡萄糖(FBG)、甘油三酯(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

      1.6 骨骼肌基因表達的檢測 提取各組大鼠比目魚肌總RNA,逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,Real-time RT-PCR分析PPARα及GRP78、CHOP基因的表達,在美國ABI公司StepOnePlus儀上進行擴增,用比較Ct法(△△Ct)分析結(jié)果。

      1.7 骨骼肌細胞培養(yǎng) 高糖DMEM培養(yǎng)基中添加10%胎牛血清、105IU·L-1青霉素、105IU·L-1鏈霉素為完全培養(yǎng)基,骨骼肌細胞株C2C12用完全培養(yǎng)基在37℃、5%CO2、95%濕度的條件下培養(yǎng)。當(dāng)細胞生長密度達80%時,換成含0.5%無游離脂肪酸的牛血清白蛋白(BSA)的DMEM,將細胞分為正常對照組(NC組)、模型組(0.4 mmol·L-1棕櫚酸組,PA)、陽性對照藥組(1 mg·L-1衣霉素組,TM)、治療組(0.4 mmol·L-1棕櫚酸 +0.2 mmol·L-1非諾貝特酸組,PA+FA),均孵育24 h,PA和FA的作用劑量和時間參考文獻[6-7],并根據(jù) RT-PCR結(jié)果確定,其中FA提前8 h預(yù)孵育。收集細胞用于RTPCR、細胞免疫熒光和Western blot檢測。100 nmol·L-1胰島素刺激細胞30 min后收集蛋白樣品,Western blot檢測Akt蛋白及p-Akt水平。

      Tab 1 Primer sequences used for Realtime RT-PCR analysis of gene expression in rat skeletal muscles

      Tab 2 Primer sequences used for RT-PCR analysis of gene expression in mouse skeletal cells

      1.8 細胞基因表達的檢測 提取各組細胞總RNA,RT逆轉(zhuǎn)錄試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成 cDNA,檢測GRP78、CHOP的基因表達,以大鼠GAPDH基因作為內(nèi)參,在英國TECHNE PCR儀上進行擴增,2%瓊脂糖凝膠電泳,檢測基因表達水平。

      1.9 細胞免疫熒光 4%多聚甲醛4℃固定細胞后,0.5%Triton-100破膜,5%BSA封閉后加鼠抗CHOP單克隆抗體,4℃孵育過夜,F(xiàn)ITC標記山羊抗小鼠孵育1 h,DAPI孵育10 min,抗熒光淬滅封片劑封片,激光共聚焦顯微鏡下觀察。

      1.10 Western blot 取0.1 g比目魚肌或1×106的C2C12細胞,RIPA裂解液制備勻漿,12 000 r·min-1、4℃離心15 min,取上清抽提總蛋白。12%SDS-PAGE分離膠和5%SDS-PAGE濃縮膠凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉后,分別孵育 GAPDH、GRP78、Akt、p-Akt一抗,4℃過夜,HRP標記的二抗孵育1.5 h,X線片曝光、顯影及定影。

      1.11 統(tǒng)計學(xué)方法 SPSS 16.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析,所有實驗數(shù)據(jù)以ˉx±s表示,多組間均數(shù)比較采用方差分析(ANOVA),兩兩比較采用最小顯著差異法(LSD法)。

      2 結(jié)果

      2.1 非諾貝特對高脂血癥大鼠體重、糖脂代謝指標的影響 與SCD組相比,28周的國際標準化高脂飲食(D12451)導(dǎo)致 HFD組大鼠體重、血 FBG、TG、TC水平明顯增加、HDL-C水平明顯下降(P<0.05)。與HFD組相比,8周非諾貝特干預(yù)后,HFD+FF組大鼠體重、血FBG、TG水平明顯降低、HDL-C水平明顯上升(P<0.05);血清TC水平雖然降低,但差異無顯著性(P>0.05)。各組大鼠之間血清LDL-C水平差異均無顯著性(P>0.05)(Tab 3)。

      Tab 3 Effects of fenofibrate on glucose and lipid metabolic parameters in hyperlipidemic rats±s,n=12)

      Tab 3 Effects of fenofibrate on glucose and lipid metabolic parameters in hyperlipidemic rats±s,n=12)

      *P<0.05 vs SCD group;#P<0.05 vs HFD group

      Parameter SCD HFD HFD+FF Body weight/g 294±14 416±19* 352±16#FBG/mmol·L-1 6.03±0.23 8.69±0.30*7.68±0.22#TG/mmol·L-1 0.36±0.07 1.16±0.11*0.69±0.08#TC/mmol·L-1 2.28±0.44 3.92±0.48*3.59±0.45 LDL-C/mmol·L-1 0.41±0.09 0.49±0.08 0.48±0.08 HDL-C/mmol·L-1 1.42±0.13 1.18±0.11*1.39±0.14#

      2.2 非諾貝特對高脂血癥大鼠胰島素抵抗的影響GTT和ITT實驗都顯示HFD組空腹血糖比SCD組、HFD+FF組均高。GTT實驗顯示,HFD組給予葡萄糖30 min后血糖達高峰,且比SCD組、HFD+FF組峰值均高,此后緩慢下降;與HFD組相比,HFD+FF組空腹血糖降低,給予葡萄糖后30 min時峰值降低,血糖波動較小。ITT實驗顯示,注射胰島素后,SCD組血糖迅速下降,30 min時達最低值后血糖緩慢上升;HFD組血糖緩慢下降,且始終維持在較高水平,90 min時達最低值后血糖緩慢上升;HFD+FF組各點血糖值介于HFD和SCD組之間,注射胰島素后血糖下降至60 min時達最低值,隨后緩慢上升(Fig 1)。

      2.3 非諾貝特對高脂血癥大鼠骨骼肌ERS基因表達的影響 與SCD組相比,HFD組PPARα表達無明顯改變(P>0.05),但 HFD+FF組PPARα表達水平明顯增加(P<0.05),表明FF明顯激活骨骼肌中PPARα的表達。與SCD組相比,HFD組GRP78、CHOP的基因表達水平均明顯增加(P<0.05),表明標準化高脂飲食明顯激活了骨骼肌組織中的ERS;與HFD組比較,HFD+FF組GRP78和CHOP基因表達水平均明顯降低(P<0.05),顯示骨骼肌組織中激活的 ERS被明顯改善(Fig 2)。Western blot檢測了各組大鼠骨骼肌GRP78蛋白表達水平的變化,其結(jié)果與mRNA水平的表達改變相一致(Fig 3)。

      2.4 非諾貝特酸對棕櫚酸誘導(dǎo)的C2C12中ERS基因表達的影響 與NC組相比,PA或TM誘導(dǎo)的骨骼肌細胞GRP78和CHOP的mRNA表達水平均明顯增加(P<0.05),表明ERS被激活。PA+FA組GRP78和 CHOP mRNA明顯降低(P<0.05),ERS得到明顯改善(Fig 4)。Western blot、免疫熒光分別檢測各組細胞GRP78和CHOP蛋白表達水平,與其mRNA水平表達變化的結(jié)果相一致(Fig 5、6)。PA或TM誘導(dǎo)的C2C12細胞Akt Ser473磷酸化水平明顯降低,PA+FA組Akt Ser473磷酸化水平增加(Fig 5)。

      3 討論

      ER是細胞內(nèi)膜型/分泌型蛋白質(zhì)合成的細胞器,對細胞的營養(yǎng)和能量狀況高度敏感,在新合成蛋白的折疊和成熟過程中起重要作用。錯誤折疊的蛋白質(zhì)聚集和脂質(zhì)合成紊亂時,引發(fā)未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response,UPR)和 ERS[8-9]。在骨骼肌細胞中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被稱為肌漿網(wǎng)(sarcoplasmic reticulum,SR),調(diào)控細胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)和蛋白質(zhì)的合成。

      已有研究報道高脂飲食可能通過激活骨骼肌的ERS而介導(dǎo)IR[10],而C2C12中ERS也可能介導(dǎo)PA誘導(dǎo)的IR[6]。非諾貝特是PPARα的特異性激動劑,具有抗氧化應(yīng)激、抑制炎癥反應(yīng)、抗凋亡等作用,可降低2型糖尿病血管并發(fā)癥的風(fēng)險[11],但尚無其對骨骼肌ERS影響的報道。本研究的創(chuàng)新之處是通過研究非諾貝特(酸)對高脂血癥大鼠骨骼肌組織和細胞中IR和ERS的影響,討論了非諾貝特改善骨骼肌IR的新機制。

      Fig 1 Effects of fenofibrate on insulin resistance in hyperlipidemic rats*P<0.05 vs SCD group;#P<0.05 vs HFD group

      Fig 2 Effects of fenofibrate on mRNA expression of PPARα,GRP78 and CHOP in skeletal muscle of hyperlipidemic ratsReal-time RT-PCR analysis of PPARα,GRP78,CHOP mRNA expression and the relative mRNA level was normalized to a standard housekeeping gene GAPDH.*P<0.05 compared with SCD group;#P<0.05 compared with HFD group

      Fig 3 Effects of fenofibrate on GRP78 protein expression in skeletal muscle of hyperlipidemic ratsWestern blot analysis of GRP78 protein and the relative protein level was normalized to GAPDH.*P<0.05 vs SCD group;#P<0.05 vs HFD group.

      Fig 4 Effects of fenofibric acid on GRP78 and CHOP mRNA expression in C2C12 induced by palmitic acidNC:normal control;PA:palmitic acid;PA+FA:palmitic acid+fenofibric acid;TM:tunicamycin.*P<0.05 compared with NCgroup;#P<0.05 compared with PA group

      Fig 5 Effects of fenofibric acid on GRP78 protein expression and Akt phosphorylation in C2C12 induced by palmitic acid*P<0.05 vs NCgroup;#P<0.05 vs PA group

      ♀大鼠由于雌激素的保護作用,發(fā)展為高脂血癥的時間一般比♂大鼠長[12]。本實驗通過國際標準化高脂飲食喂養(yǎng)♀SD大鼠28周,HFD組大鼠體重、血FBG、TG、TC水平均明顯增加,HDL-C水平明降低,GTT和ITT實驗提示HFD組出現(xiàn)明顯的IR,說明已成功建立了♀高脂血癥伴IR大鼠模型。參考文獻[5],非諾貝特(30 mg·kg-1·d-1)灌胃治療8周后,體重、血FBG、TG水平明顯下降,HDL-C水平升高,IR明顯改善,說明非諾貝特具有明顯的降脂和改善IR的作用。高脂組骨骼肌組織GRP78、CHOP的基因表達水平均明顯增加,治療組這兩個指標的表達水平均明顯下降,說明標準化高脂飲食已誘導(dǎo)骨骼肌組織產(chǎn)生ERS,非諾貝特具有明顯的改善ERS作用。

      棕櫚酸(PA)是高脂飲食中含量最多的飽和脂肪酸[13],為了進一步明確高脂飲食誘導(dǎo)骨骼肌細胞產(chǎn)生ERS以及非諾貝特的體內(nèi)代謝形式非諾貝特酸(FA)的保護作用,在細胞實驗中,用FA預(yù)孵育骨骼肌細胞C2C12后再加入PA誘導(dǎo),同時選用衣霉素作為誘導(dǎo)產(chǎn)生ERS的陽性對照藥。結(jié)果顯示,PA可誘導(dǎo)C2C12中CHOP和GRP78的mRNA和蛋白表達,同時Akt Ser473的磷酸化被明顯抑制,提示PA確實誘導(dǎo)骨骼肌C2C12細胞產(chǎn)生了ERS和IR,而FA的預(yù)孵育可明顯改善PA誘導(dǎo)的ERS和IR。

      有研究提示,非諾貝特可通過增加骨骼肌組織中解偶聯(lián)蛋白3(UCP3)基因的表達來增加胰島素的敏感性[14],而本研究從體內(nèi)和體外實驗兩方面來研究非諾貝特對高脂血癥大鼠骨骼肌組織、非諾貝特酸對棕櫚酸誘導(dǎo)骨骼肌細胞 ERS和IR的影響,初步證實了其降脂和改善IR的機制可能與其明顯減少ERS水平有關(guān),為開發(fā)非諾貝特作為治療代謝綜合征的藥物奠定新的理論基礎(chǔ)。

      Fig 6 Effects of fenofibric acid on CHOP protein expression in C2C12 induced by palmitic acid

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