查雨鋒,張 順,蘇 航,劉 亭,傅曉鐘,董永喜,王愛民,王永林
(1.貴陽醫(yī)學(xué)院民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心、2.貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,貴州貴陽 550004)
血腦屏障(blood-brain barrier,BBB)是存在于血液與腦組織間的一道生理屏障,對(duì)于維持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)定起著重要作用。它的存在使處于循環(huán)中的內(nèi)源性和外源性物質(zhì)無法輕易透過其進(jìn)入大腦組織,從而保護(hù)大腦不被血液內(nèi)的微生物和毒素傷害[1],但同時(shí)也導(dǎo)致絕大多數(shù)藥物無法進(jìn)入大腦組織,使得中樞神經(jīng)系統(tǒng)藥物的開發(fā)受到巨大阻礙。尋找新的腦靶向給藥系統(tǒng)以及與之相對(duì)應(yīng)的篩選工具將是今后藥學(xué)研究的重點(diǎn),由于整體實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜性和影響因素的多重性,使得對(duì)新藥透過BBB的篩變得困難,而體外BBB模型避免了體內(nèi)研究的多種復(fù)雜干擾因素,被廣泛應(yīng)用于新藥開發(fā)中預(yù)測(cè)其BBB通透能力的重要工具[2]。腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(brain-microvessl endothelial cells,BMECs)是建立體外BBB模型的重要材料,而如何獲得高純度的BMECs一直是建立體外BBB的關(guān)鍵和難點(diǎn)。目前,國內(nèi)外關(guān)于BMECs的分離方法有篩網(wǎng)法、酶消化法及組織塊法[3-4],但這些方法都不能夠有效獲得高純度及高活力的BMECs。本研究參照國內(nèi)外報(bào)道的篩網(wǎng)法[5]和酶消化法[6],摸索出了獲得高純度和高活力BMECs的分離及培養(yǎng)方法。
1.1 動(dòng)物 10 d的 SD大鼠5只,♀♂均可,由貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房提供,動(dòng)物合格證號(hào):SCXK(黔)2012-0001。
1.2 試劑 DMEM高糖培養(yǎng)基(批號(hào)8114031)、胎牛血清(FBS,批號(hào)1227694)、胰蛋白酶(批號(hào)J130049)均購自Gibco公司;青霉素-鏈霉素(批號(hào)15140-122)購自Hyclone公司;堿性成纖維細(xì)胞生長因子(bFGF,批號(hào)1210432)購自Pepro Tech公司;牛血清白蛋白(BSA,批號(hào)1213G051)、Ⅱ型膠原酶(批號(hào) C6885)、D-NaseⅠ酶(批號(hào) D8071)、鼠尾膠原蛋白(批號(hào) C8062)、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT,批號(hào)705B054)、TritionX-100(批號(hào) T8200)、肝素鈉(批號(hào)H8060)、胰島素(批號(hào)1205A025)、轉(zhuǎn)鐵蛋白(批號(hào)823A0410)、L-谷氨酰胺(批號(hào) 312A043)、Percoll(批號(hào)305A046)、蘇木精(批號(hào)20130624)均購自 Solarbio公司;亞硒酸鈉(批號(hào)10102-18-8)購自Amresco公司;膠原酶/分散酶(批號(hào)14093221)購自Roche公司;4%多聚甲醛(批號(hào)07K29C68)購自博士德生物公司;兔抗人Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體(批號(hào)bs-2974R)購自Bioss公司;D-Hanks緩沖液(自配);SP免疫組化試劑盒(批號(hào)SP-9001)、DAB顯色試劑盒(批號(hào)ZLI-9018)購自中杉金橋公司。
1.3 儀器 6孔細(xì)胞培養(yǎng)板、細(xì)胞培養(yǎng)瓶(corning,USA);數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌器(上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療儀器廠);超凈工作臺(tái)(北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司);CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Thermo scientific公司);Allegra 64R冷凍高速離心機(jī)(美國Beckman);倒置顯微鏡(日本尼康公司)。
2.1 大鼠BMECs的原代培養(yǎng) 取5只新生10 d的SD大鼠,無菌條件下取腦,分離并收集灰質(zhì)于冷DMEM培養(yǎng)液中。將收集到的大腦灰質(zhì)用D-Hanks液清洗3次后,剪成1 mm3左右大小,加入5 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的Ⅱ型膠原酶(內(nèi)含0.005%D-NaseⅠ)懸浮混勻后用5 ml吸管吹打30次,37℃振蕩消化40 min后,加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的膠原酶/分散酶共同消化40 min,4℃,800×g離心5 min。棄上清液,添加適量DMEM培養(yǎng)液混勻后通過100目的篩網(wǎng),收集濾液,800×g離心5 min。將沉淀加入適量質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%的BSA混懸后,4℃,1 000×g離心20 min,取底部沉淀。將沉淀用DMEM培養(yǎng)液洗1次,4℃,800×g離心5 min,棄上清液,平鋪于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44%的連續(xù)percoll離心液表面,4℃,1 000×g離心10 min,離心后取靠近底部紅色沉淀的黃白色部分,DMEM培養(yǎng)液清洗1次后離心,即得到純度較高的微血管段(注:以上操作均在冰上進(jìn)行)。用7 ml含20%FBS的高糖 DMEM(另含 bFGF 2μg·L-1;肝素鈉100 mg·L-1;牛胰島素 50 mg·L-1;cAMP 312.4μmol·L-1;轉(zhuǎn)鐵蛋白 5 mg·L-1;亞硒酸鈉 2μg·L-1;L-谷氨酰胺 2.5 mmol·L-1;青霉素1×105U·L-1;鏈霉素100 mg·L-1)懸浮后接種于涂有鼠尾膠的培養(yǎng)瓶中,最后加入4 mg·L-1的嘌呤霉素,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2 h后換液,培養(yǎng)48 h后換不含嘌呤霉素的培養(yǎng)液培養(yǎng),隨后隔1 d換1次培養(yǎng)液。
2.2 大鼠BMECs的傳代 大鼠BMECs長至單層時(shí),用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.125%的胰酶(含0.01%EDTA)消化,并于倒置顯微鏡下觀察,當(dāng)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞變圓,間隙增大時(shí),加入2~3 ml含有血清的培養(yǎng)液終止消化,輕輕吹打至細(xì)胞脫落,800×g離心5 min,棄上清液,按1∶2的傳代方式接種于鼠尾膠包被的培養(yǎng)瓶中,用含20%FBS的高糖DMEM培養(yǎng),每天換1次液。
2.3 大鼠BMECs的鑒定
2.3.1 形態(tài)學(xué) 將培養(yǎng)有BMECs的培養(yǎng)瓶置于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞貼壁、生長狀況及形態(tài),并進(jìn)行拍照。
2.3.2 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化鑒定 將擴(kuò)增培養(yǎng)的BMECs以每孔100萬個(gè)細(xì)胞的密度接種于涂有鼠尾膠的6孔板中,當(dāng)細(xì)胞鋪滿板底時(shí)吸出培養(yǎng)液,給予4%的多聚甲醛固定1 h,PBS沖洗3次(每次3 min),按照SP免疫組化試劑盒說明書依次操作,兔抗大鼠Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體按1∶200稀釋。DAB顯色,蘇木精復(fù)染,于倒置顯微鏡下觀察,以胞質(zhì)呈現(xiàn)棕色信號(hào)為陽性細(xì)胞,陰性對(duì)照用PBS代替兔抗Ⅷ因子相關(guān)抗原單克隆抗體。
2.4 BMECs生長曲線的繪制 分別繪制BMECs在普通培養(yǎng)基(即含有 20%FBS,bFGF 2μg·L-1,肝素鈉 100 mg·L-1,L-谷氨酰胺2.5 mmol·L-1,青霉素 1×105U·L-1,鏈霉素100 mg·L-1的高糖 DMEM)和生長培養(yǎng)基(即含有20%FBS,bFGF 2μg·L-1,肝素鈉 100 mg·L-1,牛胰島素50 mg·L-1,cAMP 312.4μmol·L-1,轉(zhuǎn)鐵蛋白 5 mg·L-1,亞硒酸鈉 2μg·L-1,L-谷氨酰胺 2.5 mmol·L-1,青霉素 1×105U·L-1,鏈霉素100 mg·L-1的高糖 DMEM)的生長曲線。取2~3代的BMECs,每孔20萬個(gè)細(xì)胞接種于96孔板中,采用MTT法測(cè)定1周內(nèi)每天的細(xì)胞活力。每天測(cè)定10個(gè)復(fù)孔,取平均值。最后以時(shí)間(d)為橫坐標(biāo),吸光度值(A)為縱坐標(biāo)描繪一條曲線,即為BMECs的生長曲線。
3.1 倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài) 將提取得到的腦微血管段置于倒置顯微鏡下觀察,微血管段表面光滑,長短不一,呈單枝或多枝狀,也有呈串珠狀,有部分被分散成小碎段和單個(gè)細(xì)胞。2 h后微血管段貼壁,并有內(nèi)皮細(xì)胞爬出生長。48 h后細(xì)胞融合為單層,細(xì)胞呈梭形和多角形。72 h后細(xì)胞呈典型的鋪路卵石樣結(jié)構(gòu),并呈“漩渦狀”分布,其形態(tài)與文獻(xiàn)報(bào)道相似[7]。
Fig 1 Morphology of BMEC(×100)A:Brain microvascular section obtained by primitive extract;B:BMECs culture for 2 h;C:BMECs culture for 48 h;D:BMECs culture for 72 h
3.2 Ⅷ因子相關(guān)抗原免疫組化鑒定 經(jīng)DBA顯色后,細(xì)胞胞質(zhì)呈棕色,說明所培養(yǎng)的細(xì)胞為腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞。
Fig 2 Factor-VIII relative antigen immunohistochemistry identification(×200)A:Negative control;B:Positive control
3.3 BMECs生長曲線的繪制 在生長培養(yǎng)基中,BMECs從d 2開始進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期,生長高峰在3~4 d,d 5后生長趨于穩(wěn)定。與在生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)相比,BMECs在普通培養(yǎng)基中的生長速度較慢,生長周期延長,細(xì)胞活力偏低,如Fig 3所示。
Fig 3 Growth curve for BMECsa:Cultured in ordinary medium;b:Cultured in growth medium
3.4 嘌呤霉素對(duì)BMECs純化的考察 在培養(yǎng)介質(zhì)中加入4 mg·L-1的嘌呤霉素培養(yǎng)48 h,可有效抑制雜細(xì)胞的生長。而未加入嘌呤霉素培養(yǎng)48 h后,可見大量有突觸的雜細(xì)胞生長,如Fig 4所示。
Fig 4 Investigation on purification of BMECs by using puromycin(×200)A:Culture without puromycin,a large number of parenchyma cell growth can be observed;B:Culture with puromycin for 48 h,no obvious parenchyma cell growth can be observed.
目前,國內(nèi)外有關(guān)BMECs的分離大多采用篩網(wǎng)法和兩次酶分步消化法,但這兩種方法都有缺陷。采用篩網(wǎng)法細(xì)胞得率較低,往往需要大量實(shí)驗(yàn)動(dòng)物;另外,勻漿過程對(duì)細(xì)胞損傷較大,所得細(xì)胞活力較低,接種后難以存活,而且還摻雜有較多雜細(xì)胞。而采用兩次酶分步消化法所分離的細(xì)胞雖存活率和細(xì)胞得率都有所提高,但其耗時(shí)較長,并且所得到的微血管段中雜有大量動(dòng)脈和靜脈血管,最后培養(yǎng)得到的內(nèi)皮細(xì)胞并非完全為BMECs;另外,由于消化時(shí)間過長,微血管段大多被分解成小碎段,這對(duì)于BMECs的活力是有很大影響的。此外,還有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,采用勻漿法與兩次分步酶消化法相結(jié)合[8],這不僅可以縮短消化時(shí)間,還可以獲得較完整的微血管段,但本研究通過反復(fù)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),勻漿對(duì)BMECs的損傷是巨大的,雖用縮短消化時(shí)間來彌補(bǔ)勻漿帶來的損傷,但最終結(jié)果也不是很理想。針對(duì)以往分離方法的不足,本研究摸索出既可以分離得到高純度BMECs,又能有效縮短分離時(shí)間和最大程度提高細(xì)胞活力的分離培養(yǎng)方法,本方法分離得到的BMECs培養(yǎng)周期較短,為3~4 d,明顯低于相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[9-10],大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期。該方法的總結(jié)主要如下:①鑒于分散酶主要作用于細(xì)胞基底膜,作用溫和,對(duì)細(xì)胞膜傷較小的特點(diǎn),本研究采用Ⅱ型膠原酶,分散酶/膠原酶連續(xù)消化法,即先加入Ⅱ型膠原酶消化40 min,再繼續(xù)加入分散酶/膠原酶,兩種酶共同作用消化40 min,與兩次酶分步消化相比,消化結(jié)果相同,但縮短了近一半的消化時(shí)間[11-13],從而較好的保留了細(xì)胞活力。②采用100目篩網(wǎng)對(duì)消化好的組織進(jìn)行過濾,可將未分散開的組織團(tuán)塊及大血管如靜脈和動(dòng)脈有效去除,使分離出的微血管段更為純凈。③所有操作均在冰上進(jìn)行,以最大限度的保留細(xì)胞活力。④基于BMECs高度表而其他細(xì)胞較少表達(dá)P-糖蛋白,因此在培養(yǎng)介質(zhì)中加入P-糖蛋白底物嘌呤霉素培養(yǎng)48 h,可有效殺滅雜細(xì)胞,從而進(jìn)一步提高細(xì)胞純度[14]。⑤加入微量的細(xì)胞培養(yǎng)添加物,如胰島素、cAMP、亞硒酸鈉和轉(zhuǎn)鐵蛋白,可促進(jìn)細(xì)胞生長,縮短生長周期,這可能與其促進(jìn)細(xì)胞的物質(zhì)代謝有關(guān)。⑥與采用明膠包被的培養(yǎng)瓶相比,鼠尾膠原蛋白包被的培養(yǎng)瓶更利于BMECs的生長。⑦共考察了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為33%、44%和55%3個(gè)濃度percoll離心液的分離效果,發(fā)現(xiàn)隨著percoll離心液濃度的升高,微血管段層距底部的紅細(xì)胞和周細(xì)胞層就越遠(yuǎn),但細(xì)胞得率也會(huì)逐漸降低,最后本研究采用了質(zhì)量分?jǐn)?shù)為44%的percoll作為離心介質(zhì),這樣既可以保證細(xì)胞得率,又能將其與雜細(xì)胞較好分離。⑧文獻(xiàn)報(bào)道,BMECs接種1 h后開始貼壁,4 h貼壁率達(dá)60%以上[15],而膠質(zhì)細(xì)胞的貼壁高峰在6 h以后。而本研究發(fā)現(xiàn),采用本方法獲得和培養(yǎng)的BMECs在接種2 h后貼壁率就可達(dá)到90%以上,因此選擇在接種后2 h換全液,可以有效去除雜細(xì)胞。⑨根據(jù)BMECs較容易消化脫落的特性,采用分次收集消化液的方式對(duì)其進(jìn)一步純化,反復(fù)實(shí)驗(yàn)證明,較先脫落的70%部分含雜細(xì)胞較少。本方法能夠獲得高產(chǎn)率的BMECs,重現(xiàn)性較好,操作相對(duì)簡單,并且所得到的細(xì)胞純度和活力都相對(duì)較高,為體外BBB的建立以及對(duì)大腦疾病致病機(jī)制的研究提供了技術(shù)支持和理論指導(dǎo)。
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