角膜組織塊培養(yǎng)法建立ICR小鼠蠶蝕性角膜潰瘍體外模型

閆 瑩，朱孔梅，楊 鑒，姚景春

（1.臨沂市人民醫(yī)院眼科，山東臨沂 276000；2.中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，魯南制藥集團股份有限公司新藥藥理中心，山東臨沂 273400）

蠶蝕性角膜潰瘍在臨床上比較常見，但病因尚沒有完全研究清楚，多數(shù)學(xué)者認為該病可能是體液免疫為主、細胞免疫為輔的自身免疫性疾病。免疫抑制劑或者聯(lián)合球結(jié)膜切除術(shù)具有一定的效果［1－2］，具有免疫抑制或免疫干預(yù)活性的中藥有效成分可能會是治療蠶蝕性角膜潰瘍的潛在有效藥物，但動物篩選模型的匱乏成為此類藥物研發(fā)的制約環(huán)節(jié)。角膜缺乏血液循環(huán)，白細胞能夠浸潤到角膜組織的難度較大，因此，相關(guān)免疫性損傷的動物模型制作困難。故本試驗嘗試使用在體外將小鼠角膜細胞和自身白細胞共培養(yǎng)的方法，通過觀察小鼠角膜細胞體外生長情況，建立蠶蝕性角膜潰瘍的體外動物模型，可為研發(fā)治療該疾病的藥物打下基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物及分組 SPF級ICR小鼠，♀♂各半，體質(zhì)量（20±2）g，魯南制藥集團股份有限公司實驗動物中心提供，合格證號：0015255。隨機分成3組，設(shè)正常對照組、皮下免疫組、環(huán)磷酰胺給藥組，每組10只。飼養(yǎng)于屏障環(huán)境。1.2 主要試劑及儀器 曲拉通（國藥集團化學(xué)試劑有限公司，S20120321），生理鹽水（辰欣藥業(yè)股份有限公司，1201228202），完全弗氏佐劑（中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，201201），環(huán)磷酰胺（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司，12041825），戊巴比妥鈉（北京化學(xué)試劑公司，P3761），RPMI 1640細胞培養(yǎng)液（Gibco，1204685），CKX31顯微鏡（OLYMPUS），BB15培養(yǎng)箱（THERMO），F(xiàn)HS-2型可調(diào)高速勻漿器（江蘇榮華）。

2 方法

2.1 動物造模方法 取兔眼角膜，剪碎后，加入5～10倍體積的5%曲拉通溶液，高速勻漿至無塊狀顆粒，將勻漿液3 000 r·min－1離心10 min，取上清液。將5 ml上清液與5 ml完全弗氏佐劑劇烈震蕩混合制成混合液。皮下免疫組和環(huán)磷酰胺給藥組每只小鼠背部皮下注射混合液0.5 ml，隔日注射1次，連續(xù)注射10次，正常對照組不注射混合液。在皮下免疫的同時，正常對照組與皮下免疫組背部皮下注射生理鹽水0.5 ml／只，環(huán)磷酰胺給藥組背部皮下注射環(huán)磷酰胺300 mg·kg－1，給藥部位與注射混合液部位不重疊。

2.2 角膜組織塊體外培養(yǎng) 末次給藥3 d后，小鼠采血后處死，摘取眼球，在解剖顯微鏡下小心剝離眼角膜，將小鼠的角膜剪碎，注意無菌操作和剪取的角膜大小一致。將角膜與自身血液中分離的白細胞在24孔培養(yǎng)板中共同培養(yǎng)，每只小鼠的角膜設(shè)4個復(fù)孔，24 h換液1次，仔細觀察小鼠眼角膜組織塊狀態(tài)與角膜細胞的長出情況。

3 結(jié)果

每孔角膜細胞的長出率使用SPSS軟件進行χ2檢驗。正常對照組小鼠眼角膜細胞72 h和120 h長出率分別為25.0%和37.5%，皮下免疫組均為0.0%，明顯低于正常對照組（P＜0.01），環(huán)磷酰胺給藥組長出率分別為12.5%和17.5%，明顯高于皮下免疫組（P＜0.05）。具體結(jié)果見Tab 1。

Tab 1 Growth of cornea cell in serum free cornea explants culture

4 討論

蠶蝕性角膜潰瘍是一種自身免疫性疾病，在病因或者遺傳方面還沒有完全研究清楚［3］，患者體內(nèi)存在抗角膜基質(zhì)中自身免疫性抗原的抗體［4］?；颊呓悄兲幒拖噜彽慕Y(jié)膜有大量的巨噬細胞和T淋巴細胞浸潤，同時潰瘍角膜和相鄰結(jié)膜上皮異常高表達VCAM-1［5］。給小鼠皮下注射含有新西蘭兔角膜膠原蛋白的佐劑，可通過分子模擬，打破小鼠對自身角膜膠原蛋白的免疫耐受，引起自身反應(yīng)性T、B淋巴細胞的擴增，進一步引起角膜的免疫損傷。我們通過多次試驗，仍然觀察不到皮下免疫ICR小鼠的自身免疫性角膜損傷，因而無法成功制備蠶蝕性角膜潰瘍模型，這可能與角膜細胞很難與血液循環(huán)中的淋巴細胞接觸有關(guān)。

為了將自身反應(yīng)性淋巴細胞與角膜細胞有效地接觸，本實驗將小鼠白細胞與自身角膜細胞共培養(yǎng)，觀察角膜的生長情況。發(fā)現(xiàn)正常對照組小鼠眼角膜上皮細胞120 h后長出率可達37.5%，而皮下免疫組長出率為0.0%，說明針對自身角膜的自身反應(yīng)性淋巴細胞在與角膜共培養(yǎng)的過程中，對角膜細胞產(chǎn)生了免疫性損傷，成功模擬到蠶蝕性角膜潰瘍的免疫損傷。環(huán)磷酰胺給藥組角膜細胞長出率為17.5%，明顯高于皮下免疫組，這與臨床上免疫抑制劑治療蠶蝕性角膜潰瘍有一定效果相吻合［1－2，6－7］。

中藥是免疫干預(yù)活性有效成分的天然寶庫，有很多的成分等待我們?nèi)ネ诰虬l(fā)現(xiàn)，本文所建立的體外模型，將會促進中藥有效成分的篩選與開發(fā)。

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