C-PC抑制ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的機(jī)制研究

褚現(xiàn)明，王 妮，孫雪霞，李 冰，安 毅，徐慶科

氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox-LDL）是誘導(dǎo)動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的重要因素［3］，內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)是動(dòng)脈粥樣硬化防治的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［1－3］。研究提示天然海洋藥物——螺旋藻藻藍(lán)蛋白（C-Phycocyanin，C-PC）具有獨(dú)特的抗動(dòng)脈粥樣硬化療效［4－5］，因此本研究旨在構(gòu)建血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，探討C-PC在血管內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷中所起的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 藻藍(lán)蛋白由本課題組提取純化（純度為A620nm／A280nm＝4.71）［6］；♂Wista小鼠（100 g，4周齡）。LDL購(gòu)自美國(guó)Chemicon公司。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、SOD檢測(cè)試劑盒、N0檢測(cè)試劑盒、MDA檢測(cè)試劑盒、ET放射免疫藥盒（Sigma）。311型 CO2孵箱（Forma）；高速低溫冷凍離心機(jī)3K30型（美國(guó)PE）；紫外分光光度計(jì)（日本島津）。VIDAS計(jì)算機(jī)圖像分析系統(tǒng)，OLYMPUS倒置相差顯微鏡。

1.2 原代小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng) 取小鼠胸主動(dòng)脈，植塊法在含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)。倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)和生長(zhǎng)特征，免疫細(xì)胞化學(xué)方法進(jìn)行血管內(nèi)皮細(xì)胞Ⅷ因子相關(guān)抗原（von Willebrand factor，vWF）鑒定。試驗(yàn)用2－4代細(xì)胞，細(xì)胞均處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3 實(shí)驗(yàn)分組和藥物干預(yù) 甲基四唑藍(lán)（MTT）比色法檢測(cè)細(xì)胞活性、篩選藥物劑量，選取低于10%的內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制（IC10）的C-PC濃度進(jìn)行藥物干預(yù)。分組：正常對(duì)照組、ox-LDL組、ox-LDL＋C-PC組。對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的內(nèi)皮細(xì)胞（2×107·L－1），接種于96孔板中，每孔 200μl。各組于37℃ 5%CO2孵箱內(nèi)培養(yǎng)12 h。然后ox-LDL組、C-PC組用含有ox-LDL的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.4 ox-LDL誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和凋亡LDL氧化修飾和鑒定［7］，獲取ox-LDL用于誘導(dǎo)培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，25%的細(xì)胞生長(zhǎng)受抑制所需要的ox-LDL濃度，約為20 mg·L－1。

1.5 單核細(xì)胞（HL60）黏附計(jì)數(shù)法測(cè)定內(nèi)皮細(xì)胞黏附性 96孔板，內(nèi)皮細(xì)胞接種并培養(yǎng)至融合，不同濃度的C-PC預(yù)孵12 h，然后加入終濃度為0.1 g·L－1的ox-LDL繼續(xù)培養(yǎng)24 h，傾去培養(yǎng)液。每孔加入109·L－1的 HL60細(xì)胞，37℃，2 h后洗去未黏附細(xì)胞，觀察并計(jì)算各組HL60黏附內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)。

1.6 ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷的指標(biāo)測(cè)定 分別采用黃嘌呤氧化酶法、亞硝酸還原酶法、硫代巴比妥酸法、放射免疫法，測(cè)定細(xì)胞培養(yǎng)液中超氧化物歧化酶（SOD）活性、一氧化氮（NO）、丙二醛（MDA）含量、內(nèi)皮素（ET）含量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS 17.0進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析，數(shù)據(jù)以ˉx±s表示。

2 結(jié)果

2.1 ox-LDL誘導(dǎo)動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡 低于細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率≤10%（IC10）的 C-PC藥物濃度：C-PC＜80μmol·L－1。選取藥物干預(yù)濃度 20、40、60、80μmol·L－1。

正常內(nèi)皮細(xì)胞為扁平多角形，細(xì)胞間連接致密，呈連續(xù)排列的單層，核圓形或橢圓形、清晰，核仁1～2個(gè)。ox-LDL損傷后，細(xì)胞收縮變圓，細(xì)胞間隙明顯增寬，部分細(xì)胞脫落。ox-LDL＋C-PC干預(yù)組形態(tài)異常和脫落細(xì)胞減少，最佳C-PC干預(yù)濃度為80μmol·L－1。

2.2 C-PC對(duì)培養(yǎng)的內(nèi)皮細(xì)胞黏附性的影響（Tab 1） ox-LDL＋C-PC組黏附的HL60細(xì)胞數(shù)均較 ox-LDL組減少，80 μmol·L－1C-PC組的黏附數(shù)僅為ox-LDL組的59.4%（P＜0.01）。

Tab 1 Effect of C-PC on endothelial cell adhension（n＝6）

2.3 各組SOD活性、NO、MDA及ET含量的變化（Tab 2）ox-LDL組與正常對(duì)照組比較，細(xì)胞培養(yǎng)液中SOD活性、NO含量明顯降低、MDA、ET含量明顯升高。ox-LDL＋C-PC組80μmol·L－1與ox-LDL組相比，SOD活性、NO含量分別增加193%和203%，MDA、ET含量分別下降49%和74%。線性相關(guān)分析顯示SOD活性、NO含量與C-PC呈劑量正相關(guān)（r＝0.97，0.96，P＜0.01）；MDA、ET含量與 C-PC呈劑量負(fù)相關(guān)（r＝－0.908，－0.916，P＜0.05）。

3 討論

螺旋藻富含藻藍(lán)蛋白（C-PC），含量達(dá)60～70%。分離純化的C-PC具有水溶性、安全、無(wú)毒的特點(diǎn)［6］，研究表明，CPC具有調(diào)節(jié)血脂、抑制血管損傷后的平滑肌細(xì)胞的過(guò)度增殖、抗腫瘤增殖的作用［5，8］。

ox-LDL是內(nèi)皮細(xì)胞損傷的關(guān)鍵因素之一，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞及單核細(xì)胞分泌黏附分子，使單核細(xì)胞易于黏附。內(nèi)皮細(xì)胞所具有的抗氧化機(jī)制如SOD可清除活性氧，SOD活性降低，氧自由基生成增加，氧化細(xì)胞膜雙層磷脂結(jié)構(gòu)中的重要脂類(lèi)，生成多種脂質(zhì)過(guò)氧化物，使得培養(yǎng)液中MDA含量增高，MDA為脂質(zhì)過(guò)氧化反應(yīng)的中間產(chǎn)物，常被作為觀察活性氧生成和膜損害的指標(biāo)［9］。NO和ET的動(dòng)態(tài)平衡，最終決定了血管的舒縮和平滑肌細(xì)胞的有絲分裂狀態(tài)。缺氧可使內(nèi)皮細(xì)胞合成NO，而ET mRNA表達(dá)的增加；SOD可減輕ET對(duì)鼠骨骼肌缺血／再灌注損傷的加?。?］。

本研究結(jié)果提示，C-PC抑制ox-LDL誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，可能的機(jī)制：（1）提高SOD活性，減少活性氧生成，MDA生成減少；（2）使NO產(chǎn)生增多、減少ET生成，有助于改善血管舒張功能；（3）抑制脂質(zhì)過(guò)氧化損傷，抑制單核細(xì)胞的黏附。但深入的機(jī)制研究有待明確，如可能與減低NO的氧化失活、激活eNOS、提高NO生物利用度、影響ETmRNA水平及轉(zhuǎn)錄有關(guān)，這還有待于進(jìn)一步的深入研究。

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Tab 2 Effect of C-PC on SOD、NO、MDA、ET in endothelial cell culture solution（n＝6）