高脂飲食及ABCB1基因多態(tài)性對(duì)硝苯地平在健康受試者體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響

李江峰，閆 良，王曉飛，李曉天，張勝軍，張莉蓉

硝苯地平是二氫吡啶類鈣通道阻滯劑，主要用于預(yù)防和治療冠心病和心絞痛，特別是冠狀動(dòng)脈痙攣所致的變異型心絞痛。其臨床療效確切且價(jià)格低廉，應(yīng)用十分廣泛。但硝苯地平的體內(nèi)處置具有較大的個(gè)體差異，且藥效時(shí)間短，血壓波動(dòng)大，尚有負(fù)性肌力和負(fù)性傳導(dǎo)作用，增加冠心病患者的死亡率，使得其臨床使用存在一定風(fēng)險(xiǎn)，尤其是對(duì)老年人［1］。

硝苯地平屬于 P-糖蛋白底物［2］。P-糖蛋白由ABCB1基因編碼產(chǎn)生，既能與藥物結(jié)合，又能與ATP結(jié)合，ATP供能，使細(xì)胞內(nèi)藥物泵出細(xì)胞外，從而降低了細(xì)胞內(nèi)的藥物濃度使細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性。其主要存在于腫瘤細(xì)胞中，腸上皮細(xì)胞、腎臟近端小管的刷狀緣膜細(xì)胞等也有發(fā)現(xiàn)。

ABCB1在中國(guó)漢族人群中的變異頻率較高，其中C3435T位點(diǎn)據(jù)報(bào)道為35.38%［3］，且在不同種族中差異較大。近年來(lái)研究顯示［4］，ABCB1基因多態(tài)性通過(guò)其基因表達(dá)產(chǎn)物P-糖蛋白與多種藥物在體內(nèi)處置與代謝密切相關(guān)。但目前未見(jiàn)ABCB1基因多態(tài)性對(duì)硝苯地平人體藥動(dòng)學(xué)影響的報(bào)道。另外關(guān)于飲食對(duì)硝苯地平藥動(dòng)學(xué)的影響雖有研究，但不詳細(xì)。因此，本研究觀察中國(guó)健康受試人群ABCB1 C3435T基因多態(tài)性和高脂飲食對(duì)硝苯地平藥動(dòng)學(xué)的影響，為臨床用藥提供參考性意見(jiàn)。

1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

90名中國(guó)漢族健康受試者隨機(jī)均分為空腹組和高脂餐組?？崭菇M：45名健康受試者，男32例，女13例，平均年齡（23.13±1.89）歲，平均體質(zhì)量（65.17±7.96）kg，平均身高（170.03±7.25）cm；高脂餐組：男23例，女22例，平均年齡（23.22±2.49）歲，平均體質(zhì)量（59.19±8.47）kg，平均身高（165.92±8.53）cm。經(jīng)血尿常規(guī)、肝腎功能及心電圖檢查，各項(xiàng)檢查指標(biāo)均正常。所有受試者均無(wú)藥物過(guò)敏史，在參與試驗(yàn)前兩周及試驗(yàn)期間未服用其他任何藥物，試驗(yàn)期間禁煙、酒及含咖啡等飲料。本研究得到鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，各受試者均自愿參加試驗(yàn)并于試驗(yàn)前由本人簽署知情同意書。

2 方法

2.1 材料 HPLC-MS／MS（美國(guó) Waters公司），硝苯地平緩釋片〔Novast Laboratories（China）Ltd〕，硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)品、硝苯地平-d6內(nèi)標(biāo)（TLC醫(yī)藥化工），2×Taq PCR Master Mix（上海來(lái)?xiàng)魃锟萍加邢薰荆?，DNA Marker、蛋白酶 K、瓊脂糖、Afa（RsaⅠ）、SapⅠ限制性內(nèi)切酶、buffer（大連寶生物工程有限公司），甲醇、乙腈、乙酸乙酯（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司），飽和酚、三氯甲烷、無(wú)水乙醇（北京鼎國(guó)生物科技有限公司）。

2.2 給藥方式及血樣采集 空腹組受試者在服藥前禁食10 h，高脂餐組受試者于服藥前30 min進(jìn)食高脂餐，并在25 min內(nèi)進(jìn)餐完畢。所有受試者均于早晨8點(diǎn)口服硝苯地平片90 mg，用240 ml溫開水送服。4 h后進(jìn)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)餐。分別于服藥前、服藥后0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、5、6、7、8、10、12、14、16、20、24、36和48 h采5 ml外周靜脈血，血樣肝素抗凝，3 000 r·min－1分離血漿，置于 －80℃保存，待檢測(cè)。

2.3 樣品預(yù)處理 取50μl血漿（分別含有質(zhì)控樣品、檢測(cè)樣品、雙空白及空白樣品），分別加入50μl 50%甲醇、20μl內(nèi)標(biāo)液（硝苯地平-d620μg·L－1）、300μl乙腈，1 000 r·min－1渦旋 10 min，13 000 r·min－1離心10 min，分別取50μl上清移至另一干凈的1.2 ml的96孔板中，各加入250μl超純水，1 000 r·min－1渦旋 10 min。取 10μl進(jìn)行LC-MS／MS分析。

2.4 分析條件 色譜柱為Phenomenex Hydro-RP 80A（2.0 mm×150 mm，4μm）柱，流動(dòng)相（含0.05%乙酸和2 mmol·L－1醋酸銨）為乙腈 ∶水 ＝60∶40，流速為0.4 ml·min－1，柱溫為常溫 25℃。離子源為 ESI源，源電壓1.5 KV；加熱模塊溫度200℃；干燥氣流速0.5 L·min－1負(fù)離子模式檢測(cè)；掃描方式為選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)（SRM），用于定量的離子分別為硝苯地平 m／z∶345.1／122.1；內(nèi)標(biāo)（硝苯地平-d6）m／z∶351.1／122.1。

2.5 方法專屬性 空白血漿，空白血漿加內(nèi)標(biāo)，空白血漿加硝苯地平低、中濃度質(zhì)控樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法處理后進(jìn)樣，分析得到色譜圖。硝苯地平及內(nèi)標(biāo)保留時(shí)間分別為2.1 min和3.4 min，雜質(zhì)對(duì)硝苯地平標(biāo)準(zhǔn)品及內(nèi)標(biāo)的測(cè)定無(wú)干擾。

2.6 線性范圍和最小檢出濃度 配置成相當(dāng)于硝苯地平血漿濃度為 0.5、1、2.5、10、25、100、200、250 μg·L－1的標(biāo)準(zhǔn)系列，按照“2.3”項(xiàng)下方法處理并測(cè)定。以待測(cè)物硝苯地平的峰面積與內(nèi)標(biāo)硝苯地平－d6峰面積的比值作為縱坐標(biāo)，以硝苯地平濃度為橫坐標(biāo)，用加權(quán)（1／X2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸運(yùn)算，得出直線回歸方程為Y＝0.101X＋0.00155，回歸系數(shù) r2＝0.9991，線性范圍（0.5～250）μg·L－1，最低檢測(cè)限為0.5μg·L－1。

2.7 精密度和回收率試驗(yàn) 按照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備硝苯地平低、中、高3個(gè)濃度的樣品，濃度分別為1.5、38和190μg·L－1，連續(xù)測(cè)定 3 d，求得方法的準(zhǔn)確度、日內(nèi)、日間誤差均小于15%，回收率為96.5%～99.4%，符合生物樣本的測(cè)定要求。

2.8 穩(wěn)定性的考察 配制上述硝苯地平的低、中、高3個(gè)濃度，分別室溫放置6 h、避光狀態(tài)室溫放置24 h、－80℃冰箱中反復(fù)凍融3次。結(jié)果為室溫放置6 h的RSD分別為5.2%、3.1%和2.1%，避光狀態(tài)室溫放置24 h的 RSD分別為：6.9%、5.8%和3.5%，－80℃冰箱中反復(fù)凍融3次的RSD分別為6.0%、3.2%和3.1%。

2.9 ABCB1基因組DNA提取與分析 取600μl EDTA抗凝全血，采用酚－氯仿法提取基因組DNA，溶解后的DNA經(jīng)PCR（上游引物：5′-TGCTGGTCCTGAAGTTGATCTGTGAAC-3′，下游引物：5′-ACATTAGGCAGTGACTCGATGAAGGCA-3′）后，采用限制性酶切法進(jìn)行基因分型。所用內(nèi)切酶為：內(nèi)切酶Sau3A1。其酶切體系（10μl）：PCR產(chǎn)物 5μl，Sau3A1 0.5μl，10×hbuffer 1μl，滅菌超凈水 3.5 μl，37℃，時(shí)間為4 h，PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度248 bp。若電泳顯示248 bp單一條帶，為T／T；若有188和60 bp兩條帶，為 C／T；若有248、188、60 pb三條帶，為 C／C。

2.10 統(tǒng)計(jì)方法 Cmax（峰濃度）和Tpeak（達(dá)峰時(shí)間）可從藥時(shí)曲線直接讀出，AUC（曲線下面積）的計(jì)算采用梯形法用3p97軟件計(jì)算。采用SPSS 13.0軟件處理數(shù)據(jù)。ABCB1 3種基因型之間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的比較采用單因素方差分析，空腹組和高脂餐組之間藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)。

3 結(jié)果

3.1 高脂飲食對(duì)硝苯地平藥動(dòng)學(xué)參數(shù)的影響 高脂餐組健康受試者體內(nèi)硝苯地平的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)Tpeak、Cmax、AUC0－48比空腹組分別升高了 31.9%、77.4%、30.0%，差異具有顯著性（P＜0.05）；、AUC0－∞略有升高，但差異無(wú)顯著性。其藥時(shí)曲線和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別見(jiàn)Fig 1和Tab 1。

Tab 1 Pharmacokinetic parameters of nifedipine in healthy subjects in fasting group and high-fat group，respectively（ˉx±s）

Fig 1 Mean plasma concentration-time curves of nifedipine after administration of a single 90mg oral dose in fasting group and high-fat group，respectively

3.2 ABCB1基因多態(tài)性對(duì)硝苯地平在健康受試者體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)的影響 空腹組中，C／C、C／T、T／T 3種基因型分別為13例、24例和8例，不同基因型組之間的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)經(jīng)單因素方差分析，結(jié)果顯示T／T基因型受試者比C／C基因型受試者AUC0－∞增加了46.34%，分別為3252.08和2222.24（單位：μg·h·L－1），但兩組間差異無(wú)顯著性（P＝0.066）；Tpeak、Cmax、AUC0－48差異也無(wú)顯著性（P＞0.05）。其藥時(shí)曲線和藥動(dòng)學(xué)參數(shù)分別見(jiàn)Fig 2、Tab 2。

Fig 2 Mean plasma concentration-time curves of nifedipine in healthy subjects carrying different genotypes after administration of a single 90mg oral dose

Tab 2 Pharmacokinetic parameters of nifedipine in healthy subjects carrying different genotypes（ˉx±s）

4 討論

ABCB1基因的產(chǎn)物是P-糖蛋白，其功能是將細(xì)胞內(nèi)外源性物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞外［5］，二氫吡啶類鈣通道阻滯劑硝苯地平是P-糖蛋白的底物。在本試驗(yàn)中，ABCB1 C3435T的變異頻率為33.3%，與報(bào)道數(shù)據(jù)（35.38%）一致［3］。ABCB1三種基因型中人體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù)差異無(wú)顯著性（P＞0.05），由此我們可以推測(cè)ABCB1 C3435T的基因多態(tài)性對(duì)硝苯地平的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)無(wú)明顯影響。目前研究認(rèn)為，ABCB1 C3435T為沉默突變，即C被T所替代后，氨基酸的組成沒(méi)有發(fā)生改變［6］，但ABCB1 C3435T基因多態(tài)性會(huì)影響其產(chǎn)物P-gp的表達(dá)水平，且C／C表達(dá)水平最高，T／T表達(dá)水平最低［7］。另有研究證明［8］，ABCB1 C3435T基因多態(tài)性對(duì)同屬二氫吡啶鈣通道阻滯劑的氨氯地平的藥動(dòng)學(xué)也無(wú)明顯影響。這可能是由于P-gp不是二氫吡啶類鈣通道阻滯劑跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的主要影響因素，因此P-gp水平的改變對(duì)硝苯地平的跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)影響較小。此外，本次實(shí)驗(yàn)中AUC0－∞因個(gè)體差異明顯，雖然 T／T組較 C／C組增加了46.3%，但經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理P值接近0.05（P＝0.066），這可能與樣本量較少有關(guān)。硝苯地平的體內(nèi)代謝過(guò)程較復(fù)雜［9］，其中受CYP3A影響較大，本課題組也曾研究證明CYP3A5*3能影響硝苯地平的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)參數(shù) AUC0－48、AUC0－∞［10］。因此，要準(zhǔn)確做到個(gè)體化用藥尚需進(jìn)一步研究，如多次給藥對(duì)硝苯地平藥動(dòng)學(xué)的影響。

在空腹組和高脂餐組中，健康受試者體內(nèi)硝苯地平藥動(dòng)學(xué)參數(shù) Tpeak、Cmax、AUC0－48具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。藥時(shí)曲線（Fig 1）顯示15 h內(nèi)高脂餐組硝苯地平的血藥濃度明顯高于空腹組，之后接近，曲線下面積差別較大。這些數(shù)據(jù)提示高脂飲食對(duì)硝苯地平的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)有明顯影響。有實(shí)驗(yàn)表明硝苯地平的溶出速率和在小腸內(nèi)的遷移時(shí)間是影響硝苯地平吸收的關(guān)鍵因素［11］。高脂餐組中較多的高脂食物會(huì)增加膽汁、胃液和胰液的分泌，而這會(huì)導(dǎo)致屬于脂溶性藥物的硝苯地平暴露和生物利用度的增加［12］；同時(shí)食物可抑制胃排空，尤其是那些較難消化的食物，使藥物進(jìn)入小腸的時(shí)間延緩［13］。因此造成服用硝苯地平后，血藥濃度升高較快，吸收時(shí)間延長(zhǎng)，吸收量增加。結(jié)果提示高脂飲食對(duì)硝苯地平的體內(nèi)過(guò)程影響較大，臨床用藥中應(yīng)注意避免飲食影響。

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