白及多糖的提取與分析

臺琪瑞,殷秀惠

（云南省玉溪市人民醫(yī)院,云南 玉溪 653100）

白及 Bletilla striata （Thunb.）Reichb.f.是一種草本植物,已有上千年的藥用歷史,其富含的白及膠具有清熱利濕、收斂、止血、消腫生肌之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,白及膠具有抗感染、抗腫瘤血管生成和加速凝血的作用,而且用其制成的潤滑劑、保濕劑、增稠劑等已在食品工業(yè)、石油工業(yè)、化妝品行業(yè)廣泛應(yīng)用[1]。白及膠的主要成分為多糖,但目前對白及多糖的藥物結(jié)構(gòu)分析研究還較少。為了探討白及多糖的分離純化、結(jié)構(gòu),研究其分子量的理化性質(zhì),本文運用光譜分析法和化學(xué)方法對其進行分析研究,現(xiàn)報道如下。

1 儀器與試藥

2400 CHN型元素分析儀（美國 PE公司）；UV-2550型紫外可見分光光度儀（日本島津公司）；FTIR-650型紅外光譜分析儀（蘇州華美辰儀器設(shè)備有限公司）。DEAE2纖維素（DE252,Whatman公司,批號為 SMGT09）；SphadexG2100和 T2系列標(biāo)準(zhǔn)多糖（Pharmacia公司,批號為 CDF78GD）；考馬斯亮藍 G2250（Sigma公司,批號為WD67D2N）；蒽酮（分析純,上海琳帝化工有限公司,批號為20120801）；咔唑（分析純,壽光魯科化工有限公司,批號為20110709）；氯化鈉（分析純,西隴化工股份有限公司,批號為201203401）。白及選云南白藥集團股份有限公司中藥飲片分公司飲片（批號為YP20120802）,經(jīng)鑒定為蘭科白及屬植物白及的干燥塊莖,符合2010年版《中國藥典（一部）》的相關(guān)規(guī)定[2]。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取

將白及塊莖干制品粉碎、烘干,加20倍體積的蒸餾水,在60℃條件下回流提取4 h,重復(fù)提取,離心10 min,取上清液,在70℃條件下進行減壓濃縮,用3倍體積95%的乙醇進行沉淀,收集沉淀后冷凍、干燥,用Sevag法除去蛋白部分,得到白及多糖粗制品BR1。

2.2 分離純化

將BR1加入最小體積的水進行溶解,Sevag法除去蛋白部分,采用考馬斯亮藍G-2250法[3]進行無蛋白質(zhì)檢測,流水透析3 d后在真空條件下冷凍干燥,得到BR2。將400mg的BR2在20mL的蒸餾水中溶解,離心5 min,取上清部分,然后在4.0 cm×25.0 cm的陰離子交換纖維素DE-252柱上進行層析,用蒸餾水和氯化鈉溶液進行洗脫,流速為24mL/h,通過蒽酮-硫酸法檢測,得到洗脫組分,收集后冷凍干燥,得到BR3。將 50 mg的BR3在2 mL的蒸餾水中溶解,離心5 min,取上清部分,然后用1.8 cm×80.0 cm的 Sephadex G-100柱用氯化鈉溶液洗脫,流速為 16 mL/h,通過蒽酮-硫酸法檢測,收集多糖洗脫峰,進行透析干燥冷凍后,得到BR4。

2.3 純度鑒定

紫外光譜分析,將BR4配置成溶液,在190～400 nm波長范圍進行紫外掃描。元素分析,采用PE2400 CHN型元素分析儀,對BR4中的N,H,C元素含量進行分析。采用Sephadex G-100凝膠柱層析法,柱規(guī)格為2.8 cm×60 cm,以蒽酮-硫酸法檢測。BR4的紫外吸收光譜見圖1,未見260 nm和280 nm波長處的蛋白質(zhì)和核酸吸收峰。元素分析結(jié)果顯示,未見N元素,H元素含量為7.0%,C元素含量為41.4%。凝膠柱層析和 GPC分析得到單一對稱峰,說明BR4為單一組分。

圖1BR4的紫外吸收譜

2.4 相對分子質(zhì)量測定

通過 GCP法測定BR4的相對分子質(zhì)量,采用 7.8 mm×300.0mm的Shodex Ohpak SB-802HO不銹鋼色譜柱,將T2系列標(biāo)準(zhǔn)多糖用pH=6.8的磷酸鹽緩沖液流動相配置成質(zhì)量濃度為3 g/L的溶液,記錄示差色譜圖,通過分析軟件制成logMw和保留時間的標(biāo)準(zhǔn)曲線。稱取樣品BR4,對照標(biāo)準(zhǔn)曲線圖計算相對分子質(zhì)量。結(jié)果BR4相對分子質(zhì)量為99658。

2.5 理化性質(zhì)分析

采用硫酸咔唑法測定己糖醛酸,采用明膠比濁法測定硫酸基[4]。結(jié)果顯示,BR4為白色系纖維狀物質(zhì),易溶于水,不溶于有機溶劑；不含己糖醛酸和硫酸基,為中性。

2.6 單糖組分分析

取10 mg BR4加入硫酸溶液5 mL中,100℃條件下水解,用碳酸鋇中和,濾液濃縮后在20 cm×20 cm的微晶纖維素板點樣,進行單向?qū)游龊碗p向?qū)游?用苯胺-鄰苯二甲酸在100℃條件下噴霧顯色,用薄層掃描儀掃描,計算掃描峰面積。結(jié)果單向薄層層析顯示,BR4含有葡萄糖和甘露糖2種單糖,相對含量為3∶4.8。

2.7 紅外光譜分析

取BR42 mg,用KBr混合壓片,進行行紅外掃描。結(jié)果BR4紅外吸收光譜見圖2,其結(jié)構(gòu)中存在吡喃型糖基和甘露糖基,其苷鍵構(gòu)型主要為β型。

圖2BR4紅外吸收光譜

3 討論

白及多糖目前在眾多領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用,且在醫(yī)學(xué)研究和臨床應(yīng)用中有著良好的發(fā)展前景[5]。本研究中通過對白及多糖進行提取,在Sephadex G-100柱上用氯化鈉溶液洗脫分離純化,進行紫外光譜分析,對BR4進行純度鑒定、相對分子質(zhì)量測定,并對其理化性質(zhì)、單糖組分和紅外光譜進行了分析,結(jié)果顯示,白及多糖BR4是一種白色系纖維狀物質(zhì),溶于水,為中性,含有H元素和C元素,為單一組分,含有葡萄糖和甘露糖2種單糖,存在吡喃型糖基和甘露糖基。目前已知白及多糖的藥理作用主要有以下幾個方面。

止血:白及多糖是一種雜多糖。白及能增強血小板第Ⅲ因子的活性,縮短凝血酶生成時間,抑制纖維蛋白酶的活性,也能使細胞凝聚,形成人工血栓而止血[6-7]。

黏膜保護:白及多糖有胃黏膜保護作用,能明顯減輕由鹽酸引起的大鼠胃黏膜損傷,可能與刺激胃黏膜合成和釋放內(nèi)源性前列腺素有關(guān)[8]。白及多糖對動物試驗性胃潰瘍有明顯的抑制作用,可促進潰瘍動物的潰瘍愈合,其抗胃潰瘍的機制可能是通過抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng),促進胃黏膜修復(fù)[9-11]。白及多糖具有促進潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠黏膜修復(fù)、抑制肌體炎癥和恢復(fù)免疫平衡的作用,作用機制可能與抑制腫瘤壞死因子 ɑ（TNF-ɑ）和NF-κB、上調(diào)白細胞介素（IL-10）水平有關(guān)[12]。白及多糖還可通過促進炎癥細胞浸潤、增加成纖維細胞（OHP）含量的合成和釋放、羥脯氨酸（FB）的增殖,促進糖尿病潰瘍的創(chuàng)面愈合[13]。

抗菌:白及具有殺菌、消炎作用,毒副作用相對較小。白及乙醇浸液用平板稀釋法,1∶100時對金黃色葡萄球菌、1∶20時對枯草桿菌及人型結(jié)核桿菌有抑制作用[14]。其產(chǎn)生較強抗菌作用的是白及中的甘露聚糖。

抗腫瘤:白及多糖是一種廣譜抗腫瘤成分,其提取物被用作血管栓塞劑,對原發(fā)性肝癌具有顯著的抑制作用。白及是一種末梢型栓塞劑,能栓塞200～400μm以下的血管,最遠可達20～50μm的血管,能大面積地阻斷腫瘤的血供,制止腫瘤的再血管化,栓塞時間長久、可靠。白及具有阻斷肝癌供血動脈及其側(cè)枝循環(huán)的功效,能有效抑制肝癌的生長和復(fù)發(fā)[15]。

其他:白及屬植物中的白及與川烏配伍,為中醫(yī)配伍禁忌“十八反”之一?；瘜W(xué)研究顯示,白及與生川烏配伍后,藥液中雙酯型生物堿的含量增加,毒性增加,這種差異是由于煎煮液的pH不同導(dǎo)致的,藥液中雙酯型生物堿含量隨藥液pH的升高而降低[16]。白及中含有的成分可能引起藥液pH降低,而使雙酯型生物堿的含量增加,使得白及和川烏配伍后毒性增加。

白及屬植物雖種類較少,但化學(xué)成分復(fù)雜、藥理活性多樣。隨著對其化學(xué)成分研究的不斷深入,藥理活性研究也可從總提起物轉(zhuǎn)向各類或各種化學(xué)成分的研究,從而發(fā)現(xiàn)了一些新的活性及活性成分。因此,有必要對該屬植物進一步進行化學(xué)成分、藥理活性及藥理作用機制的研究,以期能更合理、更有效地開發(fā)和利用白及屬藥用植物資源。

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