異檸檬酸脫氫酶1基因突變焦磷酸測(cè)序檢測(cè)方法的建立

王丹慧 蔡彥寧 張燕莉 高 杰 楊彩俠

(首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)生物學(xué)研究室教育部神經(jīng)變性病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室北京市老年病醫(yī)療研究中心，北京 100053)

膠質(zhì)瘤是最常見(jiàn)的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤，其中惡性膠質(zhì)瘤的發(fā)病率為(5～8)/100萬(wàn)，5年病死率在全身腫瘤中僅次于胰腺癌和肺癌，位列第3位。膠質(zhì)瘤給社會(huì)和家庭造成了巨大負(fù)擔(dān)，因而一直是腫瘤研究的熱點(diǎn)［1］。

異檸檬酸脫氫酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)是膠質(zhì)瘤研究領(lǐng)域的重要分子標(biāo)志物。IDH1是否存在突變和膠質(zhì)瘤患者的預(yù)后、膠質(zhì)瘤的鑒別診斷以及指導(dǎo)放射治療化學(xué)治療密切相關(guān)。IDH1突變最早為Parsons等［2］所發(fā)現(xiàn)，該研究顯示約12%的多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者存在IDH1第132位精氨酸的突變。在絕大多數(shù)攜帶突變的患者中，IDH1第132位精氨酸突變?yōu)榻M氨酸(R132H，CGT→CAT)［3-5］，少數(shù)患者突變?yōu)榘腚装彼?R132C，CGT→TGT)，或絲氨酸(R132S，CGT→AGT)、甘氨酸(R132G，CGT→GGT)、亮氨酸(R132L，CGT→CTT)、纈氨酸(R132V，CGT→GTT)、脯氨酸(R132P，CGT→CCT)［3，6］。Par-sons等［2］的研究還提示，相同病理級(jí)別情況下，IDH1突變患者較野生型患者的預(yù)后好。隨后的研究［7-8］進(jìn)一步揭示IDH1基因突變是膠質(zhì)瘤獨(dú)立的、強(qiáng)大的較野生型IDH1預(yù)后好的標(biāo)志物。有學(xué)者［9-11］也對(duì)IDH1突變?cè)诓煌?lèi)型膠質(zhì)瘤中的分布情況展開(kāi)研究，結(jié)果表明，IDH1突變主要出現(xiàn)于低級(jí)別膠質(zhì)瘤和繼發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中，原發(fā)性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、兒童多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤、毛細(xì)胞型星形細(xì)胞瘤中IDH1突變率極低。提示對(duì)于組織病理學(xué)診斷不明確的樣本，可以通過(guò) IDH1基因突變檢測(cè)進(jìn)行輔助鑒別診斷［12］。Wick等［13］報(bào)道，新診斷的間變膠質(zhì)瘤患者可以基于IDH1突變與否選擇放射治療或化學(xué)治療。Houillier等［14］的研究進(jìn)一步顯示，IDH1突變聯(lián)合1p-19q缺失的低級(jí)別膠質(zhì)瘤患者，化學(xué)治療效果更優(yōu)。提示IDH1突變對(duì)膠質(zhì)瘤患者的放射治療或化療化學(xué)治療方案及生存時(shí)間評(píng)估具有指導(dǎo)及提示意義。

由于IDH1突變檢測(cè)的重要性，多種檢測(cè)方法相繼建立。其中，直接測(cè)序法是應(yīng)用最為廣泛的經(jīng)典檢測(cè)手段。近年來(lái)，焦磷酸測(cè)序法由于能夠檢測(cè)低比例突變的存在，也日益受到重視。然而，焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)IDH1突變的靈敏度尚無(wú)報(bào)道，這也導(dǎo)致鑒別突變存在與否時(shí)依賴(lài)主觀判斷。此外，通過(guò)焦磷酸測(cè)序或直接測(cè)序分析IDH1突變結(jié)果是否存在差異也有待明確。為此，本研究首先構(gòu)建野生型和突變型IDH1質(zhì)粒;繼而使用已知比例的混合野生型、突變型IDH1質(zhì)粒作為模板，分析焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)突變IDH1的靈敏度，明確了判別突變存在與否的客觀標(biāo)準(zhǔn)。最后分別使用焦磷酸測(cè)序法和直接測(cè)序法分析了96例膠質(zhì)瘤患者的IDH1基因的突變情況，結(jié)果表明焦磷酸測(cè)序法能夠更加靈敏地檢測(cè)突變。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來(lái)源

選取首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院神經(jīng)外科自2008年3月至2011年6月手術(shù)切除并經(jīng)病理證實(shí)的人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本96例，經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)宣武醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并獲得患者的知情同意，樣本經(jīng)石蠟包埋，留后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用。

1.2 主要試劑與儀器

Chelex(美國(guó) BioRad公司)，蛋白酶 K(上海Sangon公司)，Ex Tag Hot Start Version(日本Takara公司)，PyroMark Gold Q96 Reagents(德國(guó)Qiagen公司)，Streptavidin SepharoseTMBeads(美國(guó)GE公司)。Nanodrop 2000分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo公司)，PTC-100基因擴(kuò)增儀(美國(guó)MJ research公司)，PyroMark Q96 ID焦磷酸測(cè)序儀(德國(guó)Qiagen公司)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建及直接測(cè)序

由上海生工公司依照IDH1野生型及7種突變型(R132H，R132C，R132S，R132G，R132L，R132V，R132P)序列化學(xué)合成8種片段(表1)，插入PUC57質(zhì)粒載體，獲得相應(yīng)質(zhì)粒，送諾賽公司直接測(cè)序。

表1 野生型和突變型IDH1基因型序列Tab.1 The sequences of wide-type and mutant-type IDH1 genotypes

1.4 焦磷酸測(cè)序檢測(cè)質(zhì)?；蛐?/h3>

將8種質(zhì)粒進(jìn)行焦磷酸測(cè)序以驗(yàn)證插入片段序列的準(zhǔn)確性及兩種方法檢測(cè)的一致性。PCR擴(kuò)增正向引物序列為5’-GCTTGTGAGTGGATGGGTAAA-3’，反向引物序列為5’-TTGCCAACATGACTTACTTGATC-3’(生物素標(biāo)記)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度75 bp。PCR反應(yīng)總體積50 μL，其中正向引物(10 μmol)及反向引物(10 μmol)各 1 μL，25 mmol dNTP 4 μL，10 × Ex Tag Buffer 5 μL，TaKaRa Ex TaqTMHS 0.25 μL，36.75 μL 超純水，模板質(zhì)粒2 μL(2 000拷貝)。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，36個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

焦磷酸測(cè)序引物為:5’-GGGTAAAACCTATCATCATA-3’;分析序列:位點(diǎn)1為 GGTNGTCATGCTTAT，位點(diǎn)2為GGTCNTCATGCTTAT;堿基分配順序:CGTGCAGTCAT。測(cè)序體系80 μL，96孔板中加入PCR產(chǎn)物15 μL，Streptavidin SepharoseTMBeads 3 μL，PyroMark Binding Buffer 40 μL，超純水22 μL，室溫震蕩混勻。上負(fù)壓工作站，依次以70%乙醇、0.2 mol/L NaOH以及1 x Wash Buffer沖洗，以除去非生物素化的DNA片段。在測(cè)序板中釋放生物素化的DNA片段，測(cè)序板每孔預(yù)先加入測(cè)序引物S(0.4 μmol/L)40 μL。隨后80 ℃加熱測(cè)序板2 min，室溫冷卻5 min，即可上機(jī)進(jìn)行測(cè)序。

1.5 膠質(zhì)瘤樣本基因組DNA提取

取10 μm 蠟塊切片(1.5 cm ×2 cm)5 張，加1 mL二甲苯，65℃恒溫震蕩10 min，10 700 r/min，離心5 min，去上清，重復(fù)二甲苯處理3次。加無(wú)水乙醇 1 mL，混勻，10 700 r/min，離心 5 min，去上清，以 95%、75% 乙醇各離心沉淀1次。空氣干燥，加入200 μL的5%Chelex懸浮沉淀，加入5 μL蛋白酶K(20 mg/mL)，55℃震蕩3 h至溶液澄清。98℃ 10 min滅活蛋白酶K。簡(jiǎn)短離心后取上清放入新離心管，加入20.5 μL NaAC(3 mol/L，pH 5.2)，450 μL 無(wú)水乙醇，混勻，－20℃冷凍1 h。10 700 r/min，離心5 min，去上清，加70%乙醇1 mL，10 700 r/min，離心 5 min，去上清。干燥，DNA溶解于100 μL TE緩沖液。

1.6 直接測(cè)序法檢測(cè)膠質(zhì)瘤樣本IDH1突變

PCR擴(kuò)增正向引物序列為5’-CGGTCTTCAGAGAAGCCATT-3’，反向引物序列為5’-GCAAAATCACATTATTGCCAAC-3’，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度129 bp。PCR反應(yīng)總體積25 μL，其中正向引物(5 μmol)及反向引物(5 μmol)各 1.25 μL，25 mmol dNTP 2 μL，10 × Ex Tag Buffer 5 μL，TaKaRa Ex TaqTMHS 0.125 μL，15.875 μL 超純水，模版 DNA 2 μL(50 ng)。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性40 s;94℃變性20 s，59℃退火20 s，72℃延伸20 s，36個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。取PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后送生工公司，使用擴(kuò)增引物正反向測(cè)序。

1.7 焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)膠質(zhì)瘤樣本IDH1突變

PCR擴(kuò)增正向引物序列為5’-GCTTGTGAGTGGATGGGTAAA-3’，反向引物序列為5’-TTGCCAACATGACTTACTTGATC-3’(生物素標(biāo)記)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度75 bp。PCR反應(yīng)總體積50 μL，其中正向引物(10 μmol)及反向引物(10 μmol)各 1μL，25 mmol dNTP 4 μL，10× Ex Tag Buffer 5 μL，TaKaRa Ex TaqTMHS 0.25 μL，36.75 μL 超純水，模板 DNA 2 μL(50 ng)。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性2 min;94℃變性20 s，58℃退火20 s，72℃延伸20 s，36個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳確認(rèn)后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序。

焦磷酸測(cè)序引物為:5’-GGGTAAAACCTATCATCATA-3’;分析序列:位點(diǎn)1為 GGTNGTCATGCTTAT，位點(diǎn)2為 GGTCNTCATGCTTAT;堿基分配順序:CGTGCAGTCAT。測(cè)序體系80 μL，96孔板中加入PCR產(chǎn)物 15 μL，Streptavidin SepharoseTMBeads 3 μL，Pyro-Mark Binding Buffer 40 μL，超純水 22 μL，室溫震蕩混勻。上負(fù)壓工作站，依次以 70%乙醇、0.2 mol/L NaOH以及1×Wash Buffer沖洗，以除去非生物素化的DNA片段。在測(cè)序板中釋放生物素化的DNA片段，測(cè)序板每孔預(yù)先加入測(cè)序引物S(0.4 μmol/L)40 μL。隨后80℃加熱測(cè)序板2 min，室溫冷卻5 min，即可上機(jī)進(jìn)行測(cè)序。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用百分?jǐn)?shù)表示，兩種測(cè)序方法突變檢出陽(yáng)性率的比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 野生型和突變型IDH1質(zhì)粒的構(gòu)建

8種質(zhì)粒經(jīng)諾賽測(cè)序公司直接測(cè)序，驗(yàn)證插入片段序列正確。

2.2 焦磷酸測(cè)序法的建立

使用構(gòu)建的IDH1質(zhì)粒為模板，擴(kuò)增得到75 bp的產(chǎn)物，凝膠電泳顯示擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度正確(圖1)。使用焦磷酸測(cè)序引物對(duì)質(zhì)粒擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序反應(yīng)，結(jié)果與直接測(cè)序結(jié)果一致(圖2)。

圖1 野生型和突變型IDH1基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Fig.1 Electrophoresis of wide-type and mutant IDH1

2.3 焦磷酸測(cè)序法靈敏度的分析

將攜帶R132H突變的質(zhì)粒與野生型質(zhì)粒按照1∶9，1∶19，1∶49，1∶99 混合，其中突變 DNA 分別占總DNA含量的10%，5%，2%，1%。以上述混合DNA為模板，擴(kuò)增后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。結(jié)果表明焦磷酸測(cè)序法3次均成功檢測(cè)出占總DNA含量2%的突變。對(duì)于占總DNA含量1%的突變，焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)的成功率為66.7%(2/3)(圖3)。使用攜帶其他類(lèi)型突變的質(zhì)粒與野生型質(zhì)?；旌希瑱z測(cè)焦磷酸測(cè)序法的靈敏度，結(jié)果同樣顯示突變檢測(cè)靈敏度為2%。

圖2 野生型和突變型IDH1基因焦磷酸測(cè)序圖Fig.2 Pyrosequencing analysis of wide-type and mutant IDH1

圖3 焦磷酸測(cè)序檢測(cè)IDH1突變靈敏度分析Fig.3 Sensitivity analysis of pyrosequencing in IDH1 mutation examination

2.4 膠質(zhì)瘤樣本直接測(cè)序和焦磷酸測(cè)序的比較

分別使用直接測(cè)序法和焦磷酸測(cè)序法檢測(cè)96例膠質(zhì)瘤樣本的突變情況。如表2所示，直接測(cè)序法僅能檢出兩種形式的突變，突變樣本占樣本總量的32.3%。焦磷酸測(cè)序法能夠檢出六種形式的突變，突變樣本占樣本總量的74.0%。兩種方法突變檢出率相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

表2 焦磷酸測(cè)序法和直接測(cè)序法檢測(cè)IDH1基因突變的比較Tab.2 Comparison between pyrosequencing and direct sequencing in IDH1 mutations examination

3 討論

目前已經(jīng)建立多種IDH1突變檢測(cè)方法，包括免疫組織化學(xué)法、高分辨率熔解曲線法、直接測(cè)序法、焦磷酸測(cè)序法等［15-16］。免疫組化法檢測(cè)依賴(lài)特異抗體，由于野生型和突變型IDH1僅存在一個(gè)氨基酸的差異，蛋白結(jié)構(gòu)非常相似，從而導(dǎo)致抗體特異性識(shí)別的困難。有報(bào)道［3］顯示，IDH1-R132H單克隆抗體與R132L蛋白有交叉反應(yīng)。高分辨率熔解曲線依靠分析DNA片段解鏈溫度的差異辨識(shí)突變是否存在。由于一些突變與野生型間解鏈溫度差別不大，難以被檢出。此外，當(dāng)突變基因占比較小時(shí)，其對(duì)整體峰型的影響容易被忽視，也會(huì)導(dǎo)致誤判［17-18］。直接測(cè)序法是應(yīng)用最為廣泛的IDH1突變檢測(cè)方法。然而該方法靈敏度低，突變DNA占總DNA的20%以上方可被檢出。這就帶來(lái)了誤診的可能［17-20］。焦磷酸測(cè)序法操作簡(jiǎn)便，檢測(cè)快速，在2～3 h內(nèi)即可完成，特別適合臨床診斷。而且與直接測(cè)序相同，本方法能夠通過(guò)一次反應(yīng)精確判定突變的類(lèi)型，為免疫組織化學(xué)和高分辨率熔解曲線等方法無(wú)法比擬。與直接測(cè)序相比，焦磷酸測(cè)序能夠更加靈敏地檢測(cè)出低比例突變的存在，從而能夠彌補(bǔ)腫瘤細(xì)胞樣本采集過(guò)程中難以避免的腫瘤細(xì)胞占比低的不足，對(duì)于腫瘤突變相關(guān)檢測(cè)意義重大。

焦磷酸測(cè)序方法正越來(lái)越多地用于IDH1突變的檢測(cè)，但其檢測(cè)靈敏度仍無(wú)報(bào)道。以往的研究中一般人為設(shè)定5%作為判定是否存在突變的標(biāo)準(zhǔn)。本研究表明，焦磷酸測(cè)序檢測(cè)IDH1突變的靈敏度可以達(dá)到2%，甚至更高。為今后判定IDH1突變提供了客觀的參照。本課題組的結(jié)果還表明焦磷酸測(cè)序法對(duì)于患者突變與否的判定與直接測(cè)序法間存在明顯差異。依據(jù)焦磷酸測(cè)序結(jié)果對(duì)患者進(jìn)行判定，并跟蹤隨訪將有助于進(jìn)一步闡明IDH1作為生物標(biāo)記物對(duì)于膠質(zhì)瘤的意義。同時(shí)，焦磷酸測(cè)序法還能夠定量分析突變基因所占比例。可以推測(cè)，突變比例的高低很可能對(duì)于預(yù)后判斷、用藥指導(dǎo)等方面也具有重要的意義，值得進(jìn)一步研究。

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