非整倍體結(jié)腸癌對(duì)順鉑的耐藥性研究

張漢卿, 劉 穎, 房 曉

(1. 揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001; 2. 揚(yáng)州大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院, 江蘇 揚(yáng)州, 225001)

Boveri T[1]最早在人類腫瘤組織中發(fā)現(xiàn)了非整倍體現(xiàn)象，如今非整倍體已被確認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的一大基本特征，超過70%的人類腫瘤中都存在非整倍體[2-3]。紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白如MAD2、BUB1B等表達(dá)異常、中心粒異常擴(kuò)增和微管著絲粒動(dòng)力學(xué)改變等都可以導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生非整倍體[4-6]。臨床研究結(jié)果[7-8]表明，非整倍體腫瘤患者對(duì)化療藥物普遍具有耐藥性。順鉑是目前臨床上應(yīng)用最廣泛的一種化療藥物，在結(jié)腸癌治療中的療效肯定[9]。本研究在實(shí)驗(yàn)室已具備可通過Tet-on系統(tǒng)誘導(dǎo)MAD2短發(fā)夾RNA(shRNA)表達(dá)以產(chǎn)生非整倍體的HCT116. △MAD2細(xì)胞系的基礎(chǔ)上[10]，通過觀察順鉑處理整倍體組與非整倍體組結(jié)腸癌細(xì)胞后生長(zhǎng)和凋亡情況，探討非整倍體結(jié)腸癌細(xì)胞是否對(duì)順鉑具有耐藥性，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系、試劑

順鉑購自美國(guó)Sigma-Aldrich公司; 人結(jié)腸癌細(xì)胞系 HCT116由北京蛋白質(zhì)組研究中心惠贈(zèng); DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基和血清(Gibco, 美國(guó)); 青霉素/鏈霉素雙抗溶液(Gibco, 美國(guó)); CCK-8 細(xì)胞增殖活性檢測(cè)試劑盒(Vazyme, 中國(guó)); GAPDH抗體(Proteintech, 美國(guó)); Caspase-3抗體(Cell signaling, 美國(guó)); 鼠二抗和兔二抗(ABclonal, 中國(guó)); RNA提取試劑盒(Vazyme, 中國(guó)); 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo, 美國(guó)); SYBR Green熒光定量PCR試劑盒(Vazyme, 中國(guó))。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞模型驗(yàn)證: 結(jié)腸癌細(xì)胞HCT116. △MAD2培養(yǎng)于含有10%的血清和1%雙抗的DMEM完全培養(yǎng)基中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。等數(shù)量細(xì)胞分至2個(gè)皿，其中細(xì)胞經(jīng)多西環(huán)素(Dox)誘導(dǎo)為敲低MAD2表達(dá)的為Dox(+)組(非整倍體)，未經(jīng)Dox處理的為Dox(-)組(整倍體)。Dox處理時(shí)間為12 h, 處理當(dāng)天為第0天，第1天撤藥。第6天進(jìn)行染色體滴定實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)出每個(gè)細(xì)胞中染色體數(shù)目。采用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)2組細(xì)胞第3、6天的MAD2表達(dá)情況。

1.2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性: 將2組細(xì)胞以8.0×105cells/孔的密度鋪入96孔板，隨后以0、0.5、1.0、1.5、2.0、5.0、10.0、20.0 μmol/L的順鉑梯度濃度處理48 h。隨后各組細(xì)胞中均加入10.0 μL CCK-8溶液，繼續(xù)培養(yǎng)1 h后，使用酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)測(cè)量吸光度。同步進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)，順鉑處理濃度為0、5.0 μmol/L。

1.2.3 Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平: 收集0、5.0 μmol/L順鉑處理48 h的Dox(+)組與Dox(-)組細(xì)胞(共4組細(xì)胞)，并于第8天使用8.0 mol/L尿素裂解液置于冰上裂解細(xì)胞后進(jìn)行超聲，以Bradford法定量蛋白濃度。隨后以每孔上樣量60.0 μg、濃縮膠6.0%、分離膠12.0%的條件進(jìn)行電泳。使用濕轉(zhuǎn)方法在硝酸纖維膜上進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為80 V、2 h。轉(zhuǎn)膜后以5%脫脂牛奶室溫封閉2 h，隨后4℃下一抗敷育過夜 (一抗?jié)舛? α-TUBULIN為1∶2 000，Caspase-3為1∶300)。于室溫下孵育二抗2 h(二抗稀釋濃度為1∶1 000), 使用Vazyme顯影液進(jìn)行顯影。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量即時(shí)聚合酶鏈鎖反應(yīng)(qRT-PCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡基因表達(dá): 順鉑處理48 h后，使用Vazyme RNA試劑盒進(jìn)行提取，隨后使用Thermo試劑盒兩步法進(jìn)行cDNA反轉(zhuǎn)，最后按照Vazyme說明書進(jìn)行熒光定量。使用美國(guó)ABI公司的Step One Plus實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)檢測(cè)凋亡相關(guān)基因BAX、PUMA、NOXA的mRNA表達(dá)情況。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞模型驗(yàn)證

實(shí)驗(yàn)室已具備HCT116. △MAD2細(xì)胞系，在該細(xì)胞系中加入Dox誘導(dǎo)，可表達(dá)MAD2 shRNA以干擾紡錘體檢驗(yàn)點(diǎn)功能產(chǎn)生非整倍體，而Dox撤藥后MAD2恢復(fù)表達(dá)，而非整倍體則一直存在[10]。使用Dox處理細(xì)胞(第0天)12 h后撤藥，通過Western Blot實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證第3天時(shí)MAD2蛋白明顯敲低，第6天時(shí)MAD2蛋白恢復(fù)表達(dá)，見圖1。因此，第6天進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)觀察，可以排除MAD2表達(dá)對(duì)實(shí)驗(yàn)觀察的干擾。染色體滴定實(shí)驗(yàn)表明，Dox(+)組多為非整倍體細(xì)胞，而Dox(-)組多為整倍體細(xì)胞，見圖2。

2.2 非整倍體細(xì)胞對(duì)順鉑具有耐藥性

臨床研究[11]發(fā)現(xiàn)腫瘤非整倍體比例高的患者預(yù)后較差。在細(xì)胞中誘導(dǎo)非整倍體產(chǎn)生后，以不同濃度順鉑處理細(xì)胞，通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn), Dox(+)組細(xì)胞較Dox(-)組細(xì)胞對(duì)順鉑具有耐藥性。見圖3、4。

2.3 非整倍體細(xì)胞經(jīng)順鉑處理后凋亡蛋白表達(dá)情況

Western Blot實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn), Dox(+)組細(xì)胞的耐藥性與其經(jīng)順鉑處理后凋亡蛋白表達(dá)較低有關(guān)，見圖5。通過qRT-PCR實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證順鉑處理后Dox(+)組細(xì)胞較Dox(-)組細(xì)胞凋亡基因PUMA、NOXA、BAX表達(dá)顯著減少(P<0.05或P<0.01), 見圖6。

圖1 第3、6天時(shí)Dox(+)組與Dox(-)組MAD2表達(dá)情況

圖2 Dox(-)組與Dox(+)組染色體數(shù)目比較

與Dox(-)比較, ?P<0.05, ??P<0.01。圖3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)順鉑處理后整倍體組與非整倍體組細(xì)胞生長(zhǎng)活性比較

3 討 論

研究非整倍體對(duì)化療藥物的耐藥性需要排除遺傳背景的干擾。研究[12-14]表明，當(dāng)紡錘體組裝檢驗(yàn)點(diǎn)蛋白如MAD2、BUB1和CENPE等異常表達(dá)時(shí)，會(huì)導(dǎo)致姐妹染色單體異常分離形成非整倍體。本課題組通過Tet-on系統(tǒng)短暫敲低MAD2表達(dá)以構(gòu)建一個(gè)以非整倍體為主要異常的結(jié)腸癌模型，進(jìn)而使得非整倍體的耐藥性研究可以在很大程度上排除遺傳背景的干擾。在該結(jié)腸癌模型HCT116. △MAD2細(xì)胞系中，短時(shí)多西環(huán)素處理可以誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生非整倍體，而未經(jīng)過多西環(huán)素處理的細(xì)胞則為整倍體對(duì)照。本課題組前期研究[10]表明, Dox(+)組細(xì)胞中非整倍體比例較Dox(-)非整倍體細(xì)胞比例高9倍以上。

與Dox(-)比較, ?P<0.05, ??P<0.01。圖4 細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)順鉑處理后整倍體組與非整倍體組細(xì)胞數(shù)目比較

圖5 順鉑處理后Dox(+)組與Dox(-)組細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)情況

本課題組已對(duì)細(xì)胞周期特異性藥物羥基脲進(jìn)行試驗(yàn)研究，得出結(jié)論非整倍體結(jié)腸癌對(duì)羥基脲產(chǎn)生耐藥性。本研究發(fā)現(xiàn)，順鉑作為非特異性細(xì)胞周期藥物治療結(jié)腸癌細(xì)胞時(shí)，非整倍體結(jié)腸癌對(duì)其也具有耐藥性。通過CCK-8實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)可發(fā)現(xiàn), Dox(-)組細(xì)胞和Dox(+)組細(xì)胞經(jīng)過順鉑不同濃度梯度處理后, Dox(-)組細(xì)胞活性明顯下降。Western Blot實(shí)驗(yàn)中順鉑處理濃度為0、5.0 μmol/L, 順鉑濃度為5.0 μmol/L時(shí)Dox(+)組細(xì)胞凋亡蛋白Caspase-3表達(dá)較Dox(-)組細(xì)胞減少。qRT-PCR實(shí)驗(yàn)表明，經(jīng)順鉑處理后Dox(+)組細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)較Dox(-)組細(xì)胞降低，所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都表明在同濃度順鉑處理時(shí)Dox(+)組凋亡指標(biāo)較Dox(-)組表達(dá)較少。

A: NOXA表達(dá)情況; B: BAX表達(dá)情況; C: PUMA表達(dá)情況。與同組0 μmol/L比較, ?P<0.05, ??P<0.01。圖6 順鉑處理后非整倍體Dox(+)細(xì)胞凋亡基因的表達(dá)情況

非整倍體腫瘤具有預(yù)后差、易遷移和高復(fù)發(fā)等特性[15-18]。非整倍體結(jié)腸癌對(duì)臨床各種常用化療藥物的耐藥性機(jī)制及其對(duì)預(yù)后的影響仍需進(jìn)一步研究。本研究表明非整倍體結(jié)腸癌對(duì)臨床常用化療藥物順鉑具有耐藥性，經(jīng)順鉑處理后非整倍體結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡程度較整倍體結(jié)腸癌細(xì)胞顯著降低。

綜上所述，非整倍體結(jié)腸癌對(duì)順鉑具有抗藥性，提示腫瘤細(xì)胞核型對(duì)結(jié)腸癌患者臨床化療方案選擇具有重要的參考意義。