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    拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2及其制劑對葡萄霜霉病的防效測定

    2014-04-23 01:29:16扈進(jìn)冬吳遠(yuǎn)征李紀(jì)順魏艷麗陳泉楊合同
    山東科學(xué) 2014年3期
    關(guān)鍵詞:霜霉病稀釋液發(fā)酵液

    扈進(jìn)冬,吳遠(yuǎn)征,李紀(jì)順,魏艷麗,陳泉,楊合同,2

    (1.山東省科學(xué)院生物技術(shù)研究中心,山東省應(yīng)用微生物重點實驗室,山東 濟(jì)南 250014;2.山東理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,山東 淄博 255049)

    葡萄霜霉病是由葡萄霜霉病菌(Plasmopara viticola)引起的一種在世界范圍內(nèi)影響葡萄種植的重要病害,嚴(yán)重危害葡萄的葉片和嫩梢,影響葡萄生長和產(chǎn)量。目前防治霜霉病所用藥劑大都是人工合成化學(xué)農(nóng)藥,如安泰生可濕性粉劑、甲霜靈錳鋅、霜疫必克、瑞毒霉、霜霉威和烯酰嗎啉等等。生物防治可以利用有益微生物和其代謝產(chǎn)物對植物病害進(jìn)行有效的防治,近些年來,在國家的大力支持和鼓勵下,已有多種生防菌劑在國內(nèi)得到廣泛應(yīng)用。[1-3]

    拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2是山東省科學(xué)院生物研究所新近從發(fā)生黃瓜霜霉病的蔬菜大棚中篩選的一株生防菌,對多種病原真菌均具有良好的拮抗作用,是一株廣譜拮抗菌,經(jīng)鑒定為多粘類芽孢桿菌(Paenibacillus polymyxa),對其抗菌物質(zhì)進(jìn)行分離純化,分析為多肽類抗菌物質(zhì)。此外,該菌株還胞外分泌β-1,3-葡聚糖酶、β-1,4-葡聚糖酶和蛋白酶等胞壁降解酶,通過葉盤漂浮法的室內(nèi)測定發(fā)現(xiàn)其對葡萄霜霉病菌有較好的防治效果。本文通過田間試驗初步研究了拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2在大田環(huán)境下對葡萄霜霉病的防治效果,為進(jìn)一步開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)。

    1 材料和方法

    1.1 試驗材料

    拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2、LTR-2為本實驗室保存木霉生防菌株,對多種真菌病害均有良好的防治效果;受試葡萄品種為“玫瑰香”。拮抗性多粘類芽孢桿菌PB-2保存采用改良的NA培養(yǎng)基:牛肉膏4.0 g/L,蛋白胨11.0 g/L,氯化鈉0.5 g/L,瓊脂15 g/L,pH值為7.0。拮抗性多粘類芽孢桿菌發(fā)酵液:豆餅粉5%,玉米粉2%,碳酸鈣0.1%,硫酸鎂0.05%,硫酸銨0.2%,pH值為7.0。LTR-2發(fā)酵選用PDA培養(yǎng)基。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 PB-2及其無菌濾液對葡萄霜霉病菌抑制作用

    因葡萄霜霉病菌只能活體培養(yǎng),故采用葉盤漂浮法[4-5]測定PB-2對葡萄霜霉病菌的室內(nèi)抑制活性。試驗設(shè)6個處理:PB-2改良的NA發(fā)酵液(30℃,120 r/min培養(yǎng)36 h,菌體含量2.3×109cfu/mL)無菌水稀釋成菌體含量106、107、108cfu/mL,過0.22 μm濾膜的PB-2發(fā)酵液,72%甲霜靈錳鋅可濕性粉劑(江蘇寶靈化工股份有限公司)600倍稀釋液,無菌水對照。從山東省科學(xué)院東區(qū)葡萄試驗田采集發(fā)病葉片和新梢第4~6輪未發(fā)病葉片(感病品種“玫瑰香”)。用無菌水洗下發(fā)病葉片的病菌孢子囊,配成霜霉病孢子懸浮液(孢子囊濃度控制為106cfu/mL),4℃下存放備用。準(zhǔn)備培養(yǎng)皿若干,內(nèi)置不同處理溶液潤濕的濾紙,用打孔器在未發(fā)病葉片的葉脈間打孔制成直徑1 cm的葉盤,分別置于這些含有不同藥液處理的5 cm培養(yǎng)皿中,每處理重復(fù)3次,每皿加3片葉盤,葉背面朝上分別擺放于藥液潤濕的吸水紙上,將配制好的孢子囊懸浮液10 μL接種于葉盤中央。置于人工氣候室中,22℃下培養(yǎng),7 d后觀察結(jié)果。根據(jù)病斑面積占葉盤面積的百分比劃分病級,0級:無病斑;1級:1% ~20%;2級:21% ~50%;3級:>50%。計算病情指數(shù)和抑制率。

    1.2.2 PB-2 的田間藥效試驗

    首先制備PB-2可濕性粉劑,先將PB-2改良的NA發(fā)酵液(菌體含量2.3×109cfu/mL)與填料麥飯石(200目)按比例吸附混合至活菌體數(shù)109cfu/g,添入黃原膠(0.5%)、十二烷基磺酸鈉(0.25%)和羧甲基纖維素(5%)混合均勻,自然晾干制得拮抗性多粘類芽胞桿菌PB-2可濕性粉劑。LTR-2(木霉)可濕性粉劑(中試產(chǎn)品,含2×108cfu/g木霉活孢子)

    試驗地點選在山東省科學(xué)院東區(qū)葡萄試驗田內(nèi)進(jìn)行,品種為“玫瑰香”(感病品種),常規(guī)栽培措施管理。試驗按農(nóng)業(yè)部藥檢所田間試驗準(zhǔn)則設(shè)計[6-7]。共7個處理:PB-2可濕性粉劑用清水稀釋50、100、200倍,LTR-2(木霉)可濕性粉劑用清水稀釋50、100、200倍,清水對照。采用噴霧法施藥,在16:00后進(jìn)行,避開高溫時間。每處理3株,重復(fù)3次,隨機(jī)區(qū)組設(shè)計。重點噴施葉背,均勻噴施,以少量滴水為度。分別于施藥后1周、2周2次隨機(jī)選取每處理上、中、下部位100片葉調(diào)查病葉率、病情指數(shù)和相對防治效果。病情分級標(biāo)準(zhǔn)和病情指數(shù)計算方法按照國家公益性行業(yè)(農(nóng)業(yè))科研專項“果樹霜霉病防控技術(shù)研究與示范”進(jìn)行,葡萄霜霉病在葉片上的分級標(biāo)準(zhǔn):0級:無病斑;1級:病斑面積占整個葉面積的5%以下;3級:病斑面積占整個葉面積的6% ~25%;5級:病斑面積占整個葉面積的26% ~50%;7級:病斑面積占整個葉面積的51% ~75%;9級:病斑面積占整個葉面積的75%以上。病情指數(shù)=[∑(各級病葉數(shù)×相對級數(shù)值)/(調(diào)查總?cè)~數(shù)×9)]×100。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 PB-2發(fā)酵液對葡萄霜霉病菌的室內(nèi)抑制活性

    從表1中可看出,菌含量為108cfu/mL的PB-2發(fā)酵稀釋液對葡萄霜霉病菌抑制率達(dá)到了77.22%,與對照藥劑72%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))甲霜靈錳鋅可濕性粉劑600倍稀釋液的抑制率(81.61%)相當(dāng),顯著優(yōu)于其他處理;PB-2無菌濾液的抑制率(60.23%)與PB-2發(fā)酵液菌體含量107cfu/mL的抑制率(63.34%)無顯著差異;菌含量為106cfu/mL的PB-2發(fā)酵稀釋液的抑制率(53.16%)最低,顯著低于其他處理。

    表1 PB-2發(fā)酵液對葡萄霜霉病菌的室內(nèi)抑制活性Table 1 Indoor inhibition activity of PB-2 fermentation broth against Plasmopara uiticola

    2.2 PB-2可濕性粉劑對葡萄霜霉病的田間藥效

    由表2可知,PB-2可濕性粉劑的50、100倍稀釋液對葡萄霜霉病具有較好的防治效果,施藥后1周相對防效分別為46.91%和36.99%,2周后分別為46.44%和42.10%。LTR-2可濕性粉劑50倍稀釋液在1周后防效為33.81%,對葡萄霜霉病也有一定的防效,但持續(xù)性差,2周后防效不明顯,試驗未發(fā)現(xiàn)PB-2可濕性粉劑稀釋液對植株和果實有不良影響。

    表2 PB-2可濕性粉劑對葡萄霜霉病的田間藥效Table 2 Field control efficacy of PB-2 wettable powder against grape downy mildew

    3 討論

    多粘類芽胞桿菌作為生防菌已有大量的研究報道,已發(fā)現(xiàn)其對終極腐霉菌(Pythium ultimum)、德巴利腐霉(Pythium debaryanum)、立枯絲核菌(Rhizoctonia solani)、尖孢鐮刀菌(Fusarium oxysporum)、灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)以及番茄葉霉病菌(Cladosporium fulvum)等多種病原真菌具有明顯的抑制作用。但用于葡萄霜霉病的研究還較少,田間實際應(yīng)用并有較好穩(wěn)定防效的則更是鮮有報道[8]。本試驗室篩選到的拮抗菌PB-2無論在室內(nèi)還是在田間,對葡萄霜霉病均具有較好的防效,有希望開發(fā)成為一種可有效防治葡萄霜霉病的生防制劑。目前我們已初步開發(fā)成了制劑,進(jìn)一步的田間防效試驗也正在進(jìn)行當(dāng)中,結(jié)果將在后續(xù)的文章中予以報道。

    葡萄霜霉病是田間比較難防治的一種病害,PB-2可以較好防治葡萄霜霉病主要原因可能是:PB-2產(chǎn)生多肽類抗菌物質(zhì)且性質(zhì)比較穩(wěn)定,胞外分泌多種胞壁降解酶,如具有較高的β-1,3-葡聚糖酶等纖維素酶類活性[9],而葡萄霜霉病菌作為一種低等真菌其細(xì)胞壁以纖維素為主,PB-2胞外分泌的纖維素降解酶類可以破壞其細(xì)胞壁,從而抑制其生長。實驗室生測和田間試驗結(jié)果表明,多粘類芽孢桿菌PB-2具有潛在的開發(fā)應(yīng)用前景。

    [1]梅桂蘭.葡萄霜霉病的癥狀及防治措施[J].現(xiàn)代園藝,2012(10):153.

    [2]呂佩坷,龐震.中國果樹病蟲原色圖譜[M].北京:華夏出版社,1993.

    [3]史娟,楊之為.葡萄霜霉病的研究現(xiàn)狀[J].寧夏農(nóng)學(xué)院學(xué)報,2004,25(2):92-94.

    [4]SCHWINN F J,SOZZI D.Recommended methods for the detection and measurement of resistance of pathogens to fungicides:Method for fungicide resistance in lateblight of potato[J].FAO Plant Protection Bulletin,1982,30:69 - 71.

    [5]陳嬌,代光輝,顧振芳,等.58種植物提取液對葡萄霜霉病菌的抑菌活性篩選研究[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā),2002,14(5):9-13.

    [6]GB/T 17980.122-2004,農(nóng)藥田間藥效試驗準(zhǔn)則(二)第122部分:殺菌劑防治葡萄霜霉?。跾].

    [7]李艷瓊.5種殺菌劑對葡萄霜霉病的控制效果[J].甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2011,46(6):62-65.

    [8]楊少波,劉訓(xùn)理.多粘類芽孢桿菌及其產(chǎn)生的生物活性物質(zhì)研究進(jìn)展[J].微生物學(xué)通報,2008,35(10):1621-1625.

    [9]CHENG Y M,HSIEH F C,MENG M.Functional analysis of conserved aromatic amino acids in the discoidin domain of Paenibacillus β-1,3-glucanase[J].Microbial Cell Factories,2009,8:62.

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