RP-HPLC法測(cè)定食用動(dòng)物油脂中苯甲酸與山梨酸的含量

符傳武，覃子龍

（廣西柳州食品藥品檢驗(yàn)所，廣西 柳州 545006）

目前，苯甲酸和山梨酸在我國(guó)廣泛用作各種食品的防腐劑，有資料表明，其能引起人的再生障礙性貧血，粒狀白細(xì)胞缺乏[1]。因此，國(guó)家嚴(yán)格限制其使用量。對(duì)食用動(dòng)物油脂中的苯甲酸、山梨酸含量進(jìn)行測(cè)定，從而對(duì)其進(jìn)行有效監(jiān)控，不僅關(guān)系到消費(fèi)者的食用安全，還涉及到相關(guān)企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益和市場(chǎng)空間，促進(jìn)相關(guān)產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展。對(duì)食品中山梨酸、苯甲酸含量測(cè)定的方法主要有氣相法[2-6]、液相法[2，7-20]、薄層色譜法[2]和毛細(xì)管區(qū)帶電泳法[21]，但由于食用動(dòng)物油脂的基體較為特殊，現(xiàn)有的檢測(cè)方法不能有效控制該樣品中苯甲酸、山梨酸的含量。本實(shí)驗(yàn)參照了GB/T5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測(cè)定》及GB/T23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》，摸索了食用動(dòng)物油脂的樣品前處理方法。對(duì)同時(shí)測(cè)定食用動(dòng)物油脂中苯甲酸、山梨酸的含量提出了可靠的方法。此項(xiàng)目在食用動(dòng)物油脂中的檢測(cè)目前未見(jiàn)報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苯甲酸對(duì)照品（批號(hào)：100419-200301）：購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品檢定所；山梨酸對(duì)照品（批號(hào)：BW3507-08002）：購(gòu)于中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究所。豬油（檢驗(yàn)編號(hào)：SP20130215、SP20130177、SP20130338、SP20130474、SP20130465、SP20130396、SP20130419、SP20130494、SP20130521、SP20130543）；牛油（檢驗(yàn)編號(hào)：SP20130119、SP20130425、SP20130374、SP20130382、SP20130285、SP20130508、SP20130545）分別為柳州、來(lái)賓市食品藥品監(jiān)督管理局委托檢驗(yàn)樣品；甲醇為一級(jí)色譜純（純度99.9%）：天津四友生物醫(yī)學(xué)技術(shù)有限公司；水為Ⅰ級(jí)純化水；其余試劑均為分析純。

磷酸鹽緩沖溶液（pH7.2）：稱(chēng)取16.72g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和2.72g磷酸二氫鉀（KH2PO4），用水溶解后定容至1000mL，即得。

1.2 儀器與設(shè)備

Waters1525高效液相色譜儀、紫外檢測(cè)器：美國(guó)Waters公司；AE200型電子分析天平：Mettler Toledo公司；元素820a型摩爾實(shí)驗(yàn)室超純水器：上海摩勒生物技術(shù)有限公司；VDRTEX-5旋渦混合器：海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司；LDZ4-1.2型低速自動(dòng)平衡微型離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜條件：Wondasil-C18色譜柱（4.6mm×250mm，5μm）；以甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液（5∶95）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm；流速為1.0mL/min；柱溫為35℃；進(jìn)樣量為10μL。

1.3.2 溶液的制備

對(duì)照品溶液：分別精密稱(chēng)取苯甲酸、山梨酸對(duì)照溶液適量，加磷酸鹽緩沖溶液配制成每1mL含苯甲酸、山梨酸為1 000μg的混合溶液作為對(duì)照品儲(chǔ)備液，再精密量取0.1mL，置于10mL客量瓶中，加磷酸鹽緩沖溶液稀釋至刻度作為對(duì)照品溶液。

供試品溶液：精密稱(chēng)取樣品約2g于50mL具塞離心管中，加入10mL磷酸鹽緩沖液，用旋渦混合器充分混合，然后4 000r/min離心5min，小心吸出水層轉(zhuǎn)移到25mL容量瓶中，再加入10mL磷酸鹽緩沖液于具塞離心管中，重復(fù)上述步驟，合并兩次水層液，用磷酸鹽緩沖液定容至刻度，混勻，用0.45μm濾膜濾過(guò)作為供試品溶液。

陰性樣品溶液：稱(chēng)取動(dòng)物油脂（豬油），按照供試品溶液的制備方法，制成苯甲酸、山梨酸的陰性樣品溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)及專(zhuān)屬性考察

在上述色譜條件下分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各10μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。理論塔板數(shù)均在3 000以上，分離度大于1.5。苯甲酸保留時(shí)間約為10min，山梨酸保留時(shí)間約為14min（見(jiàn)圖1），樣品與陰性樣品之間無(wú)干擾。

2.2 線性關(guān)系

分別精密量取“1.3.2”項(xiàng)下的苯甲酸和山梨酸的混合對(duì)照品儲(chǔ)備液適量，用磷酸鹽緩沖液稀釋?zhuān)苽涑珊郊姿岷蜕嚼嫠峋鶠?、20μg/mL、40μg/mL、80μg/mL、160μg/mL、320μg/mL的對(duì)照品溶液。分別精密量取10μL，注入液相色譜儀，記錄圖譜，以苯甲酸和山梨酸的峰面積（A），分別對(duì)其濃度（C，μg/mL）進(jìn)行線性回歸。結(jié)果回歸方程和相關(guān)系數(shù)分別為：

表明兩者的色譜峰面積與質(zhì)量濃度在0～320μg/mL范圍內(nèi)均有良好的線性。

圖1 陰性對(duì)照（A）、樣品（B）、苯甲酸和山梨酸混合對(duì)照品（C）色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of negative control (A),sample (B)and sorbic acid reference substances (C)

2.3 精密度實(shí)驗(yàn)

分別精密量取“1.3.2”項(xiàng)下的苯甲酸和山梨酸的對(duì)照品溶液10μL注入液相色譜儀，按上述的色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定其峰面積9次，苯甲酸和山梨酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）分別為0.53%和0.26%。

2.4 回收實(shí)驗(yàn)

精密稱(chēng)取已知樣品6份，每份約2g，分別加入苯甲酸和山梨酸對(duì)照品適量，照“1.3.2”項(xiàng)下供試品溶液配制的方法配制低、中、高3種質(zhì)量濃度的溶液，并按上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率及RSD，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

按“2.4”項(xiàng)下的的方法制備5份中質(zhì)量濃度的加標(biāo)供試品溶液，在上述色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得苯甲酸和山梨酸含量的平均值分別為0.98mg/g和0.98mg/g；RSD分別為0.88%和0.71%。

表1 回收率測(cè)定結(jié)果（n=3）Table 1 Determination results of recovery rate

2.6 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

取“2.5”項(xiàng)下其中的一份加標(biāo)供試品溶液在室溫條件下放置，在0、3、6、12、24h測(cè)定，記錄主峰面積，結(jié)果表明，峰面積無(wú)明顯變化，苯甲酸和山梨酸的RSD分別為0.58%、0.43%。

2.7 最低方法檢測(cè)限

在選定的色譜條件下，取“2.4”項(xiàng)下的低質(zhì)量濃度的供試品溶液，當(dāng)信噪比為2時(shí)計(jì)算其最低方法檢測(cè)限，結(jié)果表明，苯甲酸的最低方法檢測(cè)限為0.05mg/kg；山梨酸的最低方法檢測(cè)限為0.05mg/kg。

2.8 樣品測(cè)定

精密稱(chēng)取17批次的樣品，按“1.3.2”項(xiàng)下的方法制備樣品溶液；另取“1.3.2”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液。按上述各自色譜條件，分別注入液相色譜儀10μL，記錄色譜圖。按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算出苯甲酸和山梨酸的含量。其中10批次的豬油（檢驗(yàn)編號(hào)：SP20130215、SP20130177、SP20130338、

SP20130474、SP20130465、SP20130396、SP20130419、SP20130494、SP20130521、SP20130543）樣品均未檢出苯甲酸和山梨酸；7批次的牛油（檢驗(yàn)編號(hào)：SP20130119、

SP20130425、SP20130374、SP20130382、SP20130285、SP20130508、SP20130545）樣品中，檢驗(yàn)編號(hào)為SP20130374的樣品檢出苯甲酸，其含量為9.7mg/kg；檢驗(yàn)編號(hào)為SP20130425檢出山梨酸，其含量為304.2mg/kg；其他批次的牛油樣品中均未檢出苯甲酸和山梨酸。

3 討論

3.1 目前測(cè)定苯甲酸和山梨酸國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)有GB/T5009.29—2003《食品中山梨酸、苯甲酸的測(cè)定》及GB/T23495—2009《食品中苯甲酸、山梨酸和糖精鈉的測(cè)定》。食用動(dòng)物油脂的基體較為特殊，GB/T5009.29—2003檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)中樣品前處理的方法不能滿足測(cè)定要求；若完全按GB/T23495—2009測(cè)定食用動(dòng)物油中的苯甲酸和山梨酸，則會(huì)出現(xiàn)假陰性。故建立本標(biāo)準(zhǔn)來(lái)控制食用動(dòng)物油脂中苯甲酸和山梨酸的含量，以便更好的對(duì)食用動(dòng)物油脂中防腐劑的監(jiān)測(cè)。

3.2 對(duì)使用GB/T23495—2009方法測(cè)定食用動(dòng)物油中的苯甲酸和山梨酸出現(xiàn)假陰性的原因進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其出現(xiàn)假陰性是由于對(duì)照品及樣品的制備的過(guò)程中所用溶劑不一致造成，建議使用GB/T23495—2009的方法測(cè)定含油脂較高的樣品時(shí)，其對(duì)照品溶液的配制使用和樣品一樣的溶劑。

3.3 建議測(cè)定食用動(dòng)物油脂中的苯甲酸和山梨酸含量時(shí)，使用固體對(duì)照品。若使用其對(duì)照水溶液，則對(duì)照水溶液中的溶劑量會(huì)改變對(duì)照品配制中所用磷酸鹽緩沖液的pH值，造成對(duì)照品峰與樣品峰不一致，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，若其對(duì)照水溶液的含量與磷酸鹽緩沖液的比值控制在1%以內(nèi)時(shí)，則對(duì)測(cè)定無(wú)影響。

3.4 從樣品測(cè)定的數(shù)據(jù)推測(cè)，由于火鍋店需要大量的牛油和羊油，可能會(huì)造成不法企業(yè)違法向牛油和羊油中添加防腐劑，以便防止油脂的腐化。建議監(jiān)管部門(mén)加大對(duì)火鍋店中食用動(dòng)物油脂特別是牛油及羊油的監(jiān)管力度，同時(shí)建議國(guó)家盡快出臺(tái)食用動(dòng)物油脂防腐劑的使用標(biāo)準(zhǔn)，促進(jìn)食用動(dòng)物油脂加工產(chǎn)業(yè)健康穩(wěn)定發(fā)展。

3.5 由于本次實(shí)驗(yàn)使用的流動(dòng)相水相占有的比例很大，建議選用親水性強(qiáng)的色譜柱進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，否則會(huì)影響苯甲酸和山梨酸之間的分離度且容易損壞色譜柱。在長(zhǎng)時(shí)間進(jìn)樣過(guò)程中，有可能會(huì)出現(xiàn)苯甲酸和山梨酸之間的分離度會(huì)越來(lái)越小，甚至無(wú)法分離的情況出現(xiàn)，這是由于大量的水相使色譜柱的親水性能變?nèi)跻鸬?，只要用有機(jī)相（甲醇）把水相完全置換出來(lái)就又能獲得較好的分離效果。

4 結(jié)論

采用反相高效液相色譜法，以Wondasil C18（4.6mm×250mm，5μm）為色譜柱，甲醇-0.02mol/L乙酸銨溶液（5∶95）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為230nm，柱溫為30℃，流速為1.0mL/min，進(jìn)樣量10μL，測(cè)定食用動(dòng)物油脂中苯甲酸與山梨酸的含量，回收率和精密度令人滿意，方法準(zhǔn)確度、靈敏度好、方法檢測(cè)限較低，完全滿足食用動(dòng)物油脂中苯甲酸與山梨酸的檢測(cè)需要，同時(shí)也為含油脂類(lèi)較高的食品中苯甲酸與山梨酸的檢測(cè)提供了參考。

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