精子發(fā)生的內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)

李江源

（解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京 100853）

精子發(fā)生是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，精原干細胞（As）具有自我復(fù)制能力，As細胞分化產(chǎn)生Apr和Aal精原細胞，Aal細胞進一步分化為A1-4和B型精原細胞，后者減數(shù)分裂形成精母細胞，精母細胞經(jīng)過細線期、偶線期和粗線期形成單倍體精子細胞，再經(jīng)過變態(tài)形成精子。精子從生精小管上皮釋放入管腔，進入附睪繼續(xù)發(fā)育，成為可以使卵子受精的成熟精子［1］。正常的精子發(fā)生有賴于下丘腦-垂體-性腺（HPG）軸系功能的完整，下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素（GnRH）和促性腺激素抑制激素（GnIH）；垂體分泌的卵泡刺激素（FSH）和黃體生成激素（LH）以及睪丸分泌的睪酮（T）和雌二醇（E2）相輔相成，構(gòu)成負反饋調(diào)節(jié)軸系，維持著精密的生理平衡，是精子發(fā)生的必備條件。此外，激素受體和受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，局部的旁分泌和自分泌激素以及細胞因子、生長因子和化學(xué)刺激因子等也是不可或缺的［2］。近年來利用轉(zhuǎn)基因動物模型對上述內(nèi)分泌激素調(diào)節(jié)精子發(fā)生進行了大量的研究，使我們對精子發(fā)生過程內(nèi)分泌激素的調(diào)節(jié)有了更加深入的認識。本文簡要回顧這方面的進展。

一、促性腺激素釋放激素（GnRH）

人類的GnRH 神經(jīng)元約有1 000個，細胞呈圓形、卵圓形或梭形，定位于下丘腦前區(qū)和視前區(qū)，沿嗅球后部到弓狀核散在分布，其軸突經(jīng)過下丘腦-漏斗束到達正中隆突。GnRH 神經(jīng)元合成和分泌GnRH（也稱GnRH1）10肽，通過正中隆突-垂體門脈系統(tǒng)進入垂體前葉，作用于促性腺細胞。另一組GnRH 神經(jīng)元的軸突經(jīng)終板血管器止于血腦屏障［3］。人類的GnRH 受體為1型受體（GnRHR1），是視紫質(zhì)樣G-蛋白受體超家族成員，分布于垂體、胎盤、性腺、乳腺、前列腺和免疫細胞。GnRHR1有7個穿膜環(huán)，第7個穿膜環(huán)的細胞內(nèi)部分C-端缺失，C-端與受體內(nèi)在化和失敏感性有關(guān)，C-端缺失有助于防止受體迅速內(nèi)在化［4］。

在調(diào)節(jié)生殖的內(nèi)分泌激素系統(tǒng)中，GnRH 神經(jīng)元處于最頂端，GnRH 神經(jīng)元脈沖式分泌GnRH 是青春期發(fā)育啟動的標志，而精子發(fā)生則是青春期發(fā)育三個重大事件（第二性征發(fā)育、精子發(fā)生和迅速長高）之一。脈沖分泌方式是GnRH 神經(jīng)元的固有特性，與細胞間的信號交流無關(guān)。GnRH 神經(jīng)元之間形成神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，在功能上協(xié)調(diào)一致，稱為“脈沖發(fā)生器”。GnRH 脈沖在男性相對固定，90～120min一個脈沖，胚胎期因為GnRH 神經(jīng)元遷徙、發(fā)育或功能異常，可引起無青春期發(fā)育和不育，臨床上稱為特發(fā)性低促性腺激素性性腺功能減退（IHH）或Kallmann綜合征；女性的GnRH 脈沖頻率有周期性變化，30～120min一個脈沖，頻率變化是月經(jīng)周期的基礎(chǔ)，其機制未明；頻率過低可引起下丘腦性閉經(jīng)和不育；而長期高頻率可導(dǎo)致不育和多囊卵巢綜合征（PCOS）。通過外周血管5～10min頻繁采血，進行LH 脈沖分析，是研究人類下丘腦GnRH 脈沖分泌的重要方法［5］。LH 的脈沖頻率與GnRH 脈沖頻率的同步率大于90%，F(xiàn)SH 脈沖的同步率較低，原因可能是目前FSH 的測定方法靈敏度不高［6］。

GnRH 調(diào)節(jié)垂體前葉促性腺細胞的分泌功能，脈沖式間斷刺激起興奮作用，連續(xù)刺激起抑制作用；較快的頻率有助于糖蛋白α-亞單位（GαSU）和黃體生成素β亞單位（LHβ）的合成，而較慢的頻率促進卵泡刺激素β亞單位（FSHβ）的合成。其機制仍未完全闡明，目前認為，受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的途徑不同是重要的原因之一。GnRH 與GnRHR1結(jié)合后的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)涉及絲裂原激活蛋白激酶（MAPK），細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK），jun-N-端激酶（JNK）和P38。在體外培養(yǎng)條件下，以不同頻率的GnRH 刺激純化垂體促性腺細胞，發(fā)現(xiàn)低頻率激活MAPK-ERK 途徑更快和更持久，促進了FSHβ的轉(zhuǎn)錄；而高頻率則MAPK 磷酸酶途徑的反應(yīng)更強，有利于LHβ的合成［7］。

體外培養(yǎng)的大鼠Leydig細胞經(jīng)GnRH 激動劑阿拉瑞林（alarelin）處理后，3β-類固醇脫氫酶的表達增強，T 的合成和分泌增加。早期研究已證明Sertoli細胞能分泌GnRH，GnRH 在睪丸內(nèi)可能是以旁分泌方式調(diào)節(jié)Leydig細胞分泌T 的功能［8］。

二、促性腺激素抑制激素（GnIH）

每一種細胞功能的調(diào)節(jié)都是既有促進因子，也有抑制因子，以維持平衡。自1971年在豬的下丘腦發(fā)現(xiàn)GnRH 以來，許多科學(xué)家一直在尋找與GnRH對應(yīng)的抑制激素而沒有結(jié)果，直至2000年Tsuksui等［9］在鵪鶉垂體培養(yǎng)的研究中發(fā)現(xiàn)了GnIH。后來在脊柱動物和哺乳動物得到了證實。人類的GnIH有兩種分子，分別稱為RF 相關(guān)肽-1（RFRP-1）和-3（RFRP-3），它們的受體分別稱為NPFF1（GPR 147）和NPFF2（GPR 74）。GnIH 定位于下丘腦背內(nèi)側(cè)核和室周核。功能研究提示，GPR 147的親和力高，是GnIH 的主導(dǎo)受體。GnIH 的生理作用一是抑制GnRH神經(jīng)元合成和釋放GnRH，二是直接抑制垂體促性腺細胞合成和分泌LH 和FSH，人類垂體存在GPR 147受體［10］。

Smith等［11］通過對動情期和動情間期母羊垂體門脈采血測定GnIH，發(fā)現(xiàn)GnIH 呈脈沖式分泌，動情間期的脈沖頻率和幅度比動情期高。下丘腦-垂體離斷母羊，LH 對GnRH 的反應(yīng)程度在加入GnIH 后減低，表明GnIH 是通過垂體門脈系統(tǒng)進入垂體前葉，并調(diào)節(jié)其功能的。Zhou等［12］研究GnIH 和GPR 147在地鼠睪丸的表達，發(fā)現(xiàn)GnIH 在精母細胞、圓形精子細胞和早期長形精子細胞表達；GPR 147在精子發(fā)生的各期生精細胞、管周肌樣細胞、粗線期和成熟分裂精母細胞以及圓形和后期長形精子細胞表達。提示GnIH 在地鼠睪丸有旁分泌和自分泌作用，調(diào)節(jié)生精細胞的分化。

三、黃體生成激素（LH）

LH 和FSH 屬于糖蛋白激素，分子結(jié)構(gòu)為二聚體（α-和β-亞單位）。它們有相同的GαSU，LHβ和FSHβ表達各自的生物學(xué)特性，β-亞單位也是各自合成LH 和FSH 的限速步驟。LH 和FSH 是直接調(diào)節(jié)睪丸精子發(fā)生的激素，可以說是精子發(fā)生啟動的開關(guān)，其作用十分重要。

LH 的主要作用是促進Leydig細胞合成和分泌T，一方面維持正常的血漿T 水平，另一方面維持比外周循環(huán)約高100倍的睪丸內(nèi)T 濃度，睪丸內(nèi)T 以旁分泌方式作用于Sertoli細胞和管周肌樣細胞，是正常精子發(fā)生所必需的；以自分泌方式作用于Leydig細胞本身，維持細胞的數(shù)量和功能。LHβ基因失活性突變的男性胎兒宮內(nèi)發(fā)育正常，因為胎盤分泌的絨促性素補償了缺失的LH，但是，無青春期發(fā)育和精子發(fā)生［13］。敲除LHβ基因的雄性小鼠隱睪，T 水平低，無精子發(fā)生。LH 受體基因敲除（LuRKO）小鼠睪丸小，T水平降低、LH 水平升高，生精細胞分化停滯于圓形精子細胞早期階段。與正常小鼠比較，LuRKO小鼠睪丸全基因組轉(zhuǎn)錄，存在青春期前T 不敏感期和青春期后的T 敏感期，在T 敏感期補充T 治療可以糾正LuRKO 的生理缺陷［14］。在女性，LH 刺激卵泡膜細胞合成雄激素，刺激顆粒細胞合成孕酮，F(xiàn)SH 則刺激顆粒細胞芳香化酶表達，將雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素。敲除LHβ或LHR 基因的雌性小鼠，性激素水平降低，卵泡發(fā)育停滯［15］。

四、卵泡刺激素（FSH）

FSH 主要作用于Sertoli細胞，刺激其增殖（決定數(shù)量）和分化（功能成熟）。成年恒河猴切除一側(cè)睪丸后，對側(cè)睪丸體積增大，4代分化精原細胞、粗線期精母細胞和圓形精子細胞數(shù)量增加，血漿FSH 水平和睪丸內(nèi)T 水平增高。切除垂體或注射GnRH拮抗劑的恒河猴，單獨補充FSH 或T 都可以刺激精原細胞的分化。恒河猴的內(nèi)源性FSH 和LH 被GnRH 拮抗劑阻斷后，立即分別以脈沖方式輸入重組人FSH（rhFSH）或重組人LH（rhLH），以血漿FSH 和LH 達到拮抗劑阻斷前水平為正?；K點。與對照組比較，輸入rhFSH 組睪丸容積、生精小管容積和每個Sertoli細胞內(nèi)的生精細胞數(shù)量顯著增加，增加的生精細胞主要是4代B型精原細胞、粗線期精母細胞和圓形精子細胞，而Aps和Apl無明顯變化；輸入rhLH 組沒有這種變化［16］。

GnRH 基因修飾導(dǎo)致不能產(chǎn)生正常GnRH 10肽分子的促性腺激素缺乏小鼠（hpg）和敲除Sertoli細胞雄激素受體（AR）的hpg小鼠（hpg.SCARKO）的生精細胞仍有部分發(fā)育；而全部AR 敲除hpg 小鼠（hpg.ARKO）與hpg小鼠比較，睪丸縮小、Sertoli細胞和生精細胞數(shù)量減少。注射hrFSH 7d后，hpg小鼠精原細胞和精母細胞數(shù)量增加，有圓形精子細胞形成；hpg.SCARKO和hpg.ARKO 小鼠只有精原細胞和精母細胞數(shù)量增加，沒有圓形精子細胞出現(xiàn)。hpg和hpg.SCARKO 小鼠的Leydig 細胞數(shù)量增加，而hpg.ARKO小鼠則否。說明FSH 可以誘導(dǎo)精子發(fā)生，但不能完成減數(shù)分裂；FSH 通過AR 對維持Leydig細胞數(shù)量起重要作用［17］。與正常小鼠比較，F(xiàn)SH 受 體 敲 除（FSHRKO）、SCARKO、FSHRKOSCARKO、ARKO 和FSHRKO-ARKO 各型轉(zhuǎn)基因小鼠在出生后，睪丸容積逐漸縮小，萎縮的嚴重程度依 次 為FSHRKO-ARKO ＞ARKO ＞FSHRKOSCARKO＞SCARKO＞FSHRKO，到了成年期，情況最好的FSHRKO 小鼠，睪丸容積比正常小鼠縮小了約40%；Leydig 細胞數(shù)量減少以FSHRKOARKO 和ARKO 小 鼠 最 嚴 重，F(xiàn)SHRKO 和FSHRKO-SCARKO 小鼠輕度減少，SCARKO 小鼠無明顯變化。生精細胞在FSHRKO-ARKO 小鼠幾乎完全 消 失，F(xiàn)SHRKO-SCARKO 和ARKO 小 鼠 嚴 重 減少，F(xiàn)SHRKO 和SCARKO 小鼠輕度至中度減少。上述結(jié)果表明，正常精子發(fā)生需要FSH 和T 的協(xié)同作用，缺乏任何一方，都會使睪丸的各型細胞受損，如果兩者都缺乏，則不能啟動精子發(fā)生［18］。

FSH 對女性生殖是不可或缺的，對男性亦起重要作用，但并非必須。FSHβ基因突變的男性患者仍有青春期發(fā)育，只是無精子發(fā)生［19］。FSHβ 或FSHR 基因敲除雄性小鼠睪丸小、血清T 水平顯著降低、Leydig細胞數(shù)量減少、少精子；而雌性小鼠無卵泡發(fā)育、不育［20］。

五、睪酮（T）

T 對于精子發(fā)生具有非常重要的作用，T 反饋抑制LH 的釋放，卻能刺激FSH 的分泌，這是促性腺激素缺乏患者補充T 可以誘導(dǎo)精子發(fā)生的原因。Leydig細胞在睪丸內(nèi)創(chuàng)造了一個非常高濃度的T環(huán)境（340～2 000nmol／L），而血清水平只有8.7～35nmol／L，前者是后者的25～125倍，如果睪丸內(nèi)的T 濃度＜70nmol／L，精子發(fā)生過程不會啟動。AR 存在于Sertoli細胞、Leydig細胞和管周肌樣細胞，生精細胞是否存在AR 尚無定論，從功能上看，生精細胞并不需要AR。T 對精子發(fā)生所起的作用體現(xiàn)在：（1）促進血睪屏障緊密連接（tight junction，TJ）的構(gòu)成和功能；（2）促進附睪的發(fā)育和功能；（3）促進生精細胞在Sertoli細胞的附著和分化；（4）促進精子釋放［21］。

1.緊密連接（TJ）的構(gòu)成：TJ從青春期精子發(fā)生開始，兩個Sertoli基底部之間形成TJ，將生精小管分隔為基底室和近腔室，前者只有精原細胞，后者含有精母細胞和各期精細胞。TJ不僅保護生精細胞免受免疫系統(tǒng)的攻擊，亦為生精細胞構(gòu)建了一個特異性激素、細胞因子和營養(yǎng)環(huán)境。睪丸灌注高滲液體是評價血睪屏障的一種方法，10d齡正常小鼠和SCARKO 小鼠灌注后生精小管所有細胞皺縮，提示尚無有效血睪屏障形成；15d齡正常小鼠灌注后皺縮的細胞顯著減少，提示血睪屏障已開始構(gòu)建，而SCARKO 鼠尚無這種變化。定量分析顯示，50d齡成年期正常小鼠99.7%已建立了完整的血睪屏障，而SCARKO 小鼠只有84.7%。電鏡觀察，正常小鼠10d齡時，生精細胞與Sertoli細胞之間以及Sertoli細胞與Sertoli細胞之間放射性鑭可以自由通過，15d齡時，大多數(shù)生精小管已形成TJ結(jié)構(gòu)，放射性鑭被擋在管腔側(cè)；而SCARKO 小鼠出現(xiàn)這種情況少見；電鏡觀察證明了高滲液體灌注實驗的結(jié)果。說明當(dāng)缺乏T 的作用時，Sertoli細胞不能有效地構(gòu)建起血睪屏障［22］。

2.附睪：70年代的研究已經(jīng)證明，附睪的發(fā)育和功能完整有賴于T 的作用。胚胎期缺乏T，附睪不能發(fā)育；成年期去勢，附睪重量下降、萎縮凋亡，管腔內(nèi)精子消失。附睪AR 基因敲除小鼠（Prox-EARKO鼠），青春期后出現(xiàn)附睪頭梗塞、無精子。顯微鏡下，附睪上皮高度縮短、主細胞胞漿減少、管腔內(nèi)徑增大、管間間隙擴大、睪丸液斷流。一些標本可見精子壅塞。多數(shù)生精小管生精細胞消失，梗塞部位遠端出現(xiàn)上皮內(nèi)囊腫，管腔蓄積透明樣物質(zhì)。輸出管、睪丸網(wǎng)和生精小管擴張，睪丸受壓萎縮［23］。

3.生精細胞分化：異體移植研究發(fā)現(xiàn)，生精細胞具有種族特異性的內(nèi)在程序，規(guī)范生精細胞增值和分化的時間和步驟。要成功地完成整個分化程序，即從精原細胞到精子，從Sertoli細胞基底部到管腔，最后釋放精子，有賴于局部環(huán)境提供的信號和營養(yǎng)。Sertoli細胞與生精細胞之間的交流通過間隙連接（gap junction）、外胞漿特異化（ectoplasmic specialization）和管球復(fù)合體（tubulobulbar complexes）進行；Leydig細胞分泌T，以旁分泌方式影響Sertoli細胞的分化和功能。生精小管管周肌樣細胞構(gòu)建了生精小管的基板，維持睪丸內(nèi)各種細胞之間的交流，調(diào)節(jié)生精小管的收縮運動和精子釋放，管周肌樣細胞AR 基因敲除（PTM-ARKO）小鼠的生精細胞全部消失，比SCARKO 小鼠的情況還要嚴重［24］。T 至少控制著生精細胞分化的四個階段：精原細胞分化、減數(shù)分裂、精子細胞的分化和精子釋放。用T 處理hpg.SCARKO 小鼠，可見睪丸容積增大、精囊重量增加、生精小管直徑增大、出現(xiàn)管腔、部分生精小管出現(xiàn)精子發(fā)生、發(fā)育階段可達圓形精子細胞。hpg.SCARKO 小鼠的血清FSH 水平顯著低于正常，補充T 可使血清FSH 水平升高，許多情況下，T 可以獨立啟動精子發(fā)生，原因即在于T 在一定程度上可以誘導(dǎo)垂體分泌FSH［25］。

臨床上，無論是睪丸原發(fā)性疾?。ㄈ鏚linefelter綜合征），下丘腦-垂體疾病（如Kallmann綜合征，垂體前葉功能減退）或T 作用阻礙（雄激素不敏感綜合征）的患者都沒有生育能力。一部分少精子癥或無精子癥患者存在AR 基因突變，LH 和T 水平相對升高，而第二性征發(fā)育正常。AR 基因第一外顯子CAG 重復(fù)序列的正常長度為9～36，超過正常范圍可引起Kennedy綜合征、X-連鎖遺傳、四肢近端肌肉進行性麻痹和萎縮、男子乳房發(fā)育和漸進性不育。即使CAG 重復(fù)序列長度在正常范圍內(nèi)，長度相對較短者雄激素效應(yīng)強，相對較長者雄激素效應(yīng)弱，并可出現(xiàn)精子發(fā)生障礙［26］。

4.精子釋放：成熟的精子細胞與Sertoli細胞本體分離，釋放進入生精小管管腔的過程稱為精子釋放。大鼠的精子釋放始于精子發(fā)生的Ⅶ期，結(jié)束于Ⅷ期。釋放進入管腔的精子很快到達附睪，其殘余胞漿通過胞飲作用重新被Sertoli細胞吸收。這一過程在形態(tài)和結(jié)構(gòu)上發(fā)生的關(guān)鍵變化是精子細胞胞漿和胞核的重塑，形成前精子細胞（spermatozoan），為脫離Sertoli細胞作好準備。同時，Sertoli細胞形成與前精子細胞聯(lián)結(jié)的特異性外胞漿，它的向外延伸將前精子細胞逐步推向管腔［27］。外源性T注射通過抑制LH 的分泌而使睪丸內(nèi)T 水平下降，從而抑制精子發(fā)生，這是T 作為男子避孕藥的理論依據(jù)。男子接受T 避孕方案時，精子釋放失敗，精子細胞滯留并被Sertoli細胞吞噬［28］。

精子釋放是一個復(fù)雜的過程，參與調(diào)節(jié)的激素有FSH、T、E2和催產(chǎn)素。成年大鼠阻斷內(nèi)源性FSH 和LH 后，約有50%的精子釋放失??；用氟他胺阻斷AR，約90%的精子不能釋放［29］。外源性雌激素（100μg·kg-1·d-1，共10d）抑制了FSH 和睪丸內(nèi)的T 水平，使睪丸內(nèi)的雌激素水平升高5 倍，大鼠生精小管中Ⅶ期和Ⅷ期生精細胞的調(diào)亡增加，精子釋放失?。?0］。在精子釋放過程的起始階段，Leydig細胞合成和分泌催產(chǎn)素，刺激生精小管收縮，其作用在精子釋放期達到高峰。轉(zhuǎn)基因小鼠過度表達催產(chǎn)素可使精子釋放提前；而缺乏催產(chǎn)素的小鼠精子釋放延遲［31］。

六、雌二醇（E2）

人體內(nèi)的雌激素包括E2、雌酮和雌三醇，以E2的作用最強，是體內(nèi)的主導(dǎo)雌激素。男性血液中的E2的濃度很低，但在精液和睪丸網(wǎng)中的濃度高于女性血液濃度。睪丸內(nèi)的E2是芳香化酶（CYP19）催化T 產(chǎn) 生，CYP19 存 在 于Leydig 細 胞、Sertoli細胞、精原細胞、精母細胞、長形精子細胞和精子的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中。目前的證據(jù)表明，主要是Leydig細胞產(chǎn)生E2，體外實驗Sertoli細胞亦能合成E2。CYP19基因突變男子有青春期發(fā)育，第二性征正常，睪丸小或隱睪，生精細胞缺如，無精子或精子密度顯著降低、死精子；T 水平正?；蚪档?，E2水平＜1.5pg／ml（5.49pmol／L，正常范圍36.6～146.4pmol／L），LH 和FSH 水 平 升 高，LH 脈 沖 頻 率 增 高，E2補 充治療后，LH 水平回復(fù)正常，F(xiàn)SH 仍高于正常［33］。

雌激素有兩種受體，即ESR1（ERα）和ESR2（ERβ），屬于轉(zhuǎn)錄因子家族核受體，E2與受體結(jié)合后，誘導(dǎo)核轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。此外，E2亦介導(dǎo)以秒或分計算的快速反應(yīng)，這種快速反應(yīng)有三種方式：（1）配體與位于胞漿膜附近的ESR1和ESR2結(jié)合，ESR 位于胞漿膜的機制未明；（2）ESR1 的剪接變異型，即ESR1-46 和-36；（3）G 蛋 白 偶 聯(lián) 雌 激 素 受 體（GPER）或GPER30。這些快速反應(yīng)的下游信號途徑包括MAPK、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）、內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、cAMP和細胞內(nèi)鈣動員［34］。

在體外培養(yǎng)條件下，E2通過ESR1調(diào)節(jié)Sertoli細胞的增值。一方面激活GPER，上調(diào)BCL2／BCL2L2，保護細胞抵抗調(diào)亡；另一方面通過G-1-GPER／EGFP途徑下調(diào)BAX 表達，降低調(diào)亡風(fēng)險。說明E2通過不同分子信號途徑的介導(dǎo)，維持精子發(fā)生過程中細胞增殖和調(diào)亡之間的平衡［35］。E2亦能迅速促進體外培養(yǎng)的精原細胞（GC-1 細胞系）的增殖［36］。

ESR1基因敲除雄鼠出生后睪丸正常，青春期后睪丸開始變性，成年期睪丸萎縮，精子發(fā)生障礙和精子密度顯著降低，并不育；ESR2基因第3外顯子缺失突變雄鼠由于受體后信號轉(zhuǎn)導(dǎo)阻斷，亦表現(xiàn)不育［34-36］。

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