卵泡期聯(lián)合黃體期促排卵在卵巢儲備功能減退患者實施輔助生殖技術(shù)中的應(yīng)用

李玉梅，巴林林，劉冬娥，趙梓彤

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心，長沙市 410008）

近年來，由于經(jīng)濟(jì)和社會因素的影響，有生育要求的女性的平均年齡逐漸增加。生育年齡的增加同時伴隨著卵巢儲備功能的減退，表現(xiàn)為卵巢體積縮小、竇卵泡計數(shù)減少等［1］。卵巢儲備功能減退患者在實施試管嬰兒過程中常表現(xiàn)為對藥物的反應(yīng)性低，獲卵數(shù)低，胚胎質(zhì)量較差，妊娠結(jié)局差，周期取消率高。因此，臨床醫(yī)師常應(yīng)用各種促排卵方案以改善卵巢儲備功能減退患者的治療結(jié)局［2-8］。

近年來有證據(jù)表明：在一次月經(jīng)周期中有2～3個卵泡波的發(fā)育，這為臨床醫(yī)師在輔助生殖技術(shù)中采用新的卵泡刺激方案提供了理論基礎(chǔ)［9］。有研究報道表明，患惡性腫瘤需要生育的患者，在化療前為保留生育能力而進(jìn)行輔助生殖技術(shù)助孕時，在月經(jīng)周期的不同時期隨機(jī)開始促排卵治療而獲得成熟卵母細(xì)胞并形成優(yōu)質(zhì)胚胎［10-15］。然而，到目前為止，這種報道較少且主要用于卵巢儲備功能正常的患者。對于卵巢儲備功能減退的患者，利用卵泡波發(fā)育理論進(jìn)行促排卵治療的報道甚少［16］。我生殖中心于2013年開始，利用卵泡波的發(fā)育原理，對一些年齡大卵巢儲備功能減退的患者，第一周期采用改良短方案促排卵治療效果差，在獲得患者的知情同意后在進(jìn)行第二周期治療時采用卵泡期聯(lián)合黃體期促排卵，本研究就這些患者的治療結(jié)果進(jìn)行總結(jié)報道。

資料與方法

一、研究對象

從2013年1月到12月，共有37例卵巢儲備功能減退的患者納入研究，平均年齡（38.5±6.3）歲（35～55歲，），平均不孕年限（6.4±4.3）年，平均雙側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)（2.8±1.7）個，基礎(chǔ)卵泡刺激素（FSH）濃度（13.01±6.47）U／L，原發(fā)不孕占27%，繼發(fā)不孕占73%。所有患者第一周期用改良短方案促排卵行胚胎移植后受孕失敗，在簽署知情同意書后采用卵泡期聯(lián)合黃體期促排卵方案實施第二周期的治療。卵巢儲備功能減退診斷標(biāo)準(zhǔn)：至少符合下述3 項中任意2 項標(biāo)準(zhǔn)：（1）基礎(chǔ)卵泡刺激素（bFSH）≥8.5 U／L，或FSH 與 黃 體 生 成 素 比（FSH／LH）＞3.6；（2）年齡≥35歲；（3）自然周期經(jīng)陰道B超提示雙側(cè)卵巢竇卵泡數(shù)≤5個［2，5］。本研究經(jīng)過了中南大學(xué)湘雅醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)中心醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)。

二、方法

1.常規(guī)改良短方案促排卵：月經(jīng)周期的第2～8天用達(dá)必佳（輝凌醫(yī)藥，德國）0.1mg／d，從月經(jīng)的第3天開始用麗申寶／或果納芬（默克雪蘭諾，德國）225～300U／d，劑量根據(jù)患者的卵巢儲備功能和年齡及體重指數(shù)而定。定期經(jīng)陰道B超檢查卵泡的發(fā)育情況并同時調(diào)整用藥劑量，當(dāng)1～2個卵泡直徑達(dá)到18～20 mm 時肌肉注射人絨毛膜促性腺激素（HCG，珠海麗珠醫(yī)藥）10 000U 促進(jìn)卵泡進(jìn)一步發(fā)育成熟，34～36h 后取卵，根據(jù)我中心的操作手冊進(jìn)行常規(guī)體外受精（IVF）或卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）授精，原核期和卵裂期進(jìn)行胚胎評分，取卵后第2～3天進(jìn)行胚胎移植，最多移植胚胎數(shù)不超過2個，取卵日開始進(jìn)行黃體支持：安琪坦（法杏制藥，法國）300mg，2次／d，陰道給藥。

2.卵泡期聯(lián)合黃體期促排卵：卵泡期采用克羅米芬（高特制藥，塞浦路斯）聯(lián)合麗申寶（珠海麗珠醫(yī)藥）促排卵方案，從月經(jīng)第5 天開始服用克羅米芬50mg／d至HCG 日，定期經(jīng)陰道B 超檢查卵泡發(fā)育情況，根據(jù)卵泡發(fā)育情況適時加用麗申寶75～150U／d促卵泡發(fā)育，當(dāng)1～2個卵泡平均直徑達(dá)到18～20mm 時皮下注射達(dá)必佳（輝凌醫(yī)藥，德國）0.2mg促卵泡進(jìn)一步發(fā)育成熟，34～36h后取卵，根據(jù)我中心的操作手冊進(jìn)行常規(guī)IVF或ICSI，原核期和卵裂期進(jìn)行胚胎評分，所有優(yōu)質(zhì)胚胎予以凍存。

取卵后第3天，陰道B超檢查了解竇卵泡情況，當(dāng)竇卵泡直徑小于8mm 時，肌注麗申寶150U／d促卵泡發(fā)育，B超定期檢查卵泡發(fā)育情況，當(dāng)1～2個卵泡發(fā)育至20mm 左右時肌肉注射HCG10 000U 誘導(dǎo)卵泡進(jìn)一步發(fā)育成熟，34～36h 后再次取卵，常規(guī)IVF 或ICSI授精，原核期和卵裂期進(jìn)行胚胎評分，因胚胎與子宮內(nèi)膜發(fā)育不同步，優(yōu)質(zhì)胚胎予以凍存。

3.優(yōu)質(zhì)胚胎評判標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)我院生殖中心的胚胎評判標(biāo)準(zhǔn)，對原核期和卵裂期胚胎進(jìn)行評分，取卵后第3天卵裂球7～10細(xì)胞，碎片＜5%，卵裂球大小均一評為Ⅰ級胚胎；當(dāng)5%≤碎片≤20%，卵裂球大小較均勻評為Ⅱ級胚胎，Ⅰ～Ⅱ級胚胎認(rèn)為是優(yōu)質(zhì)胚胎。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，正態(tài)分布的計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差，率的比較用卡方檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、聯(lián)合促排卵方案與改良短方案促排卵的臨床和實驗室結(jié)果比較

聯(lián)合促排卵方案組，促排卵天數(shù)、平均獲MⅡ卵母細(xì)胞數(shù)、受精率、MⅡ卵母細(xì)胞平均受精數(shù)及平均優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)均顯著高于改良短方案促排卵組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；促性腺激素（Gn）用量高于改良短方案促排卵組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。（表1）。

二、聯(lián)合促排卵周期中卵泡期和黃體期促排卵臨床結(jié)果比較

為了解卵泡期促排卵和黃體期促排卵所獲得卵母細(xì)胞的質(zhì)量，我們比較了聯(lián)合促排卵方案中卵泡期和黃體期促排卵的臨床和實驗室結(jié)果。黃體期促排卵中HCG 日雌激素（E2）濃度、孕激素（P）濃度、Gn用量、平均MⅡ卵母細(xì)胞獲得數(shù)均顯著高于卵泡期促排卵組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義；促排卵天數(shù)、MⅡ卵母細(xì)胞受精率、優(yōu)質(zhì)胚胎率與卵泡期組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義；HCG 日LH 濃度卵泡期顯著高于黃體期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（表2、3）；卵泡期促排卵中有2例患者未獲得卵母細(xì)胞，但在隨后的黃體期促排卵中成功獲得卵母細(xì)胞并有優(yōu)質(zhì)胚胎凍存，黃體期有1例患者在取卵日未獲得卵母細(xì)胞。

表1 聯(lián)合促排卵方案與改良短方案促排卵的實驗室和臨床結(jié)果比較［（±s），n（%）］

表1 聯(lián)合促排卵方案與改良短方案促排卵的實驗室和臨床結(jié)果比較［（±s），n（%）］

注：與改良短方案組比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.001

組 別 促排卵天數(shù)（d）Gn用量（U）獲MⅡ卵細(xì)胞總數(shù)（枚）平均獲MⅡ卵細(xì)胞數(shù)（枚）MⅡ卵細(xì)胞受精率MⅡ卵細(xì)胞平均受精數(shù)（枚）獲優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)（枚）聯(lián)合方案 17.4±4.7＊＊ 1 838±1 020 161 4.4±2.8＊ 130（80.7）＊ 3.51±0.35＊ 1.65±0.28＊改良短方案 10.0±2.5 2 295± 960 114 3.1±1.9 78（68.4）2.11±1.56 0.81±0.19

表2 聯(lián)合促排卵組中卵泡期和黃體期促排卵臨床結(jié)果比較（±s）

表2 聯(lián)合促排卵組中卵泡期和黃體期促排卵臨床結(jié)果比較（±s）

注：與卵泡期比較，＊P＜0.05，＊＊P＜0.001

組 別 HCG 日LH（U／L） HCG 日E2（pmol／L） HCG 日P（nmol／L） 促排卵天數(shù)（d） Gn用量（U）卵泡期 10.1±5.1 3 265.3±1 588.7 6.7±18.4 8.4±2.3 315±725黃體期 3.0±2.0＊＊ 4 269.3±2 289.7＊ 48.3±44.5＊＊ 8.9±4.5 1 515±840＊＊

表3 聯(lián)合促排卵組中卵泡期和黃體期促排卵實驗室結(jié)果比較［（±s），n（%）］

表3 聯(lián)合促排卵組中卵泡期和黃體期促排卵實驗室結(jié)果比較［（±s），n（%）］

注：與卵泡期比較，＊P＜0.05

組 別 總獲卵數(shù)（枚） MⅡ卵細(xì)胞獲得率 平均獲卵數(shù)（枚）受精率 優(yōu)質(zhì)胚胎率卵泡期 77 65（84.4） 1.8±1.5 54／65（83.1） 28／54（51.9）黃體期 110 96（87.3） 2.6±1.9＊ 76／96（79.2） 41／76（53.9）

討 論

目前我國隨著雙胎政策的開放及失獨(dú)家庭的增多，有生育要求且年齡大的卵巢儲備功能減退的患者逐漸增加，在實施輔助生殖技術(shù)過程中，卵巢儲備功能減退尤其是年齡大的患者的治療方案一直是對臨床醫(yī)師的一種挑戰(zhàn)，各種治療方案效果均不佳。卵巢儲備功能減退尤其是年齡大的患者，竇卵泡數(shù)少，卵母細(xì)胞質(zhì)量下降，對藥物反應(yīng)差，用單一方案促排卵治療后，每一治療周期募集卵母細(xì)胞少，受精后胚胎質(zhì)量差，優(yōu)質(zhì)胚胎率低，相應(yīng)可移植的優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)少，妊娠率低，如果妊娠失敗，繼續(xù)下一治療周期又需等待下一月經(jīng)周期再進(jìn)行新的促排卵治療，時間跨度大，患者往返醫(yī)院時間較長并所需費(fèi)用較高，從時間、精神和經(jīng)濟(jì)上都增加了患者的壓力。根據(jù)我中心數(shù)據(jù)資料顯示，在同一時期因年齡大，卵巢儲備功能減退行改良短方案促排卵的患者有181 例，促排卵過程中因無可移植胚胎而取消周期10例，完成移植周期171 例，妊 娠27 例，妊 娠 率15.79%，流 產(chǎn) 率18.52%。大部分患者因經(jīng)濟(jì)原因第一周期失敗后未繼續(xù)來院治療。本研究中37 例卵巢儲備功能減退的患者，第一周期采用常規(guī)改良短方案促排卵，移植后妊娠失敗，第二周期采用聯(lián)合卵泡期和黃體期促排卵方案，共獲得161 枚MⅡ卵母細(xì)胞和69 枚優(yōu)質(zhì)胚胎，均明顯高于改良短方案周期，而總的Gn用量兩個周期比較無顯著性差異，促排卵天數(shù)與改良短方案周期比僅多7d左右，提示對卵巢儲備功能減退的患者，卵泡期和黃體期聯(lián)合促排卵能夠為患者短期內(nèi)募集更多的成熟卵母細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)胚胎，可明顯減少患者時間和經(jīng)濟(jì)及精神上的壓力。同時，既往文獻(xiàn)［10-15］報道，都是單一的卵泡期或黃體期促排卵，而且都是針對卵巢儲備功能正常的患者，本生殖中心根據(jù)近期提出的卵泡波發(fā)育理論，對卵巢儲備功能減退的患者采用聯(lián)合卵泡期和黃體期促排卵，取得了滿意的獲卵率和優(yōu)質(zhì)胚胎數(shù)。卵泡發(fā)育的生理機(jī)制目前還沒十分清楚，傳統(tǒng)的觀念認(rèn)為，在每一月經(jīng)周期中有一批卵泡開始募集發(fā)育，最后有單個優(yōu)勢卵泡發(fā)育而其他卵泡發(fā)生閉鎖凋亡［17-18］，乃是目前輔助生殖技術(shù)中從卵泡期開始促排卵的理論依據(jù)。近年研究［19］證實，黃體期出現(xiàn)的卵泡在發(fā)育過程中不一定閉鎖而是另一批卵泡募集發(fā)育的開始，因此提出了卵泡波的理論，在同一月經(jīng)周期中有2～3個卵泡波發(fā)育。利用卵泡波發(fā)育理論，已證實在不同月經(jīng)周期靈活促排卵可獲得滿意結(jié)局，S?nmezer等［14］報道，對3例乳腺癌需要實施緊急化療的患者，為保留生育能力，隨機(jī)在不同月經(jīng)周期用來曲唑聯(lián)合FSH 及促性腺激素釋放激素（GnRH）拮抗劑進(jìn)行促排卵獲得了成熟卵母細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)胚胎。Nayak 等［13］對癌癥患者用GnRH拮抗劑方案從晚卵泡期或黃體期促排卵獲得了14～40個卵母細(xì)胞，5～20 枚凍存胚胎。在另一研究中，Maman等［12］比較了從卵泡期和黃體期來源的卵母細(xì)胞，其成熟率、受精率、凍存胚胎數(shù)等均無統(tǒng)計學(xué)差異。與以往的研究結(jié)果相似［12，20］。本研究中，卵巢儲備功能減退的患者，黃體期促排卵獲得的成熟卵母細(xì)胞具有同樣的受精能力和形成優(yōu)質(zhì)胚胎的能力。

本研究在聯(lián)合促排卵方案中，卵泡期促排卵的HCG 日，沒有觀察到有內(nèi)源性LH 高峰的出現(xiàn)，提示從月經(jīng)第5天開始用克羅米芬至HCG 日可能會有效抑制內(nèi)源性LH 高峰的出現(xiàn)，但具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。在之后的黃體期促排卵的HCG 日中抽血查的P 激素濃度明顯高于卵泡期［（48.3±44.5）nmol／L vs.（6.7±18.4）nmol／L，P＜0.05），在高孕激素濃度下促排卵獲得的成熟卵母細(xì)胞，其受精能力和優(yōu)質(zhì)胚胎形成率沒有明顯下降，表明黃體期高孕激素對卵母細(xì)胞和胚胎無負(fù)面影響，結(jié)果也與文獻(xiàn)［20-21］報道相符。究其原因可能是黃體期高孕激素水平抑制了LH 分泌，從而可使黃體期的一批卵泡通過促排卵而能夠繼續(xù)發(fā)育成熟、正常受精和形成高質(zhì)量的優(yōu)質(zhì)胚胎。在聯(lián)合促排卵方案中，卵泡期促排卵有2例患者未獲得卵母細(xì)胞，在隨后的黃體期促排卵中均獲得卵母細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)胚胎，為我們提供了一種新的思路，卵泡期促排卵獲取卵母細(xì)胞失敗，繼續(xù)本周期黃體期促排卵可能獲得成熟卵母細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)胚胎，減少了周期取消率，使患者獲得優(yōu)質(zhì)胚胎妊娠的機(jī)會。

本研究采用自身病例對照研究方式，研究了同一患者不同治療方案進(jìn)行輔助生殖助孕，對其臨床和實驗室結(jié)局進(jìn)行分析，其結(jié)果具有可比性。但因為聯(lián)合治療周期中，內(nèi)膜通過黃體期促排卵，與胚胎發(fā)育不同步，不能進(jìn)行本周期胚胎移植，只能進(jìn)行全胚冷凍，因此不能評估本周期的臨床妊娠結(jié)局；同時，研究樣本量較少，需要大樣本的前瞻性臨床研究來進(jìn)一步證實：聯(lián)合卵泡期和黃體期微刺激方案促排卵對卵巢儲備功能減退且年齡大的患者的有效性。

綜上所述，本結(jié)果顯示，對卵巢儲備功能減退的大齡患者，聯(lián)合卵泡期和黃體期方案促排卵能夠在短期內(nèi)獲得滿意的成熟卵母細(xì)胞和優(yōu)質(zhì)胚胎，且為這類患者的治療提供了一種新的思路。

［1］ Kupesic S，Kurjak A，Bjelos D，et al.Three-demensional ultrasonographic ovarian measurements and in vitro fertilization outcome are related to age［J］.Fertil Steril，2003，79：190-197.

［2］ Kyrou D，Kolibianakis EM，Venetis CA，et al.How to improve the probability of pregnancy in poor responders undergoing in vitro fertilization：a systematic review and metaanalysis［J］.Fertil Steril，2009，91：749-766.

［3］ Revelli A，Casano S，Salvagno F，et al.Milder is better？Advantages and disadvantages of‘mild’ovarian stimulation for human in vitro fertilization［J］.Reprod Biol Endocrinol，2011，9：25.

［4］ Lamazou F，F(xiàn)uchs F，Grynberg M，et al.Cancellation of IVFET cycles：poor prognosis，poor responder，or variability of the response to controlled ovarian hyperstimulation？An analysis of 142 cancellations［J］.Gynecol Obstet Biol Reprod，2012，41：41-47.

［5］ 聶麗娜，何國平，童先宏，等.五種促排卵方案在卵巢儲備功能下降患者中臨床用藥與結(jié)局的比較［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2011，20：470-474.

［6］ 董麗霞，李麗瑋.體外受精-胚胎移植卵巢低反應(yīng)的處理對策［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2013，22：77-80.

［7］ 李冬梅，梁細(xì)妹，黃昌平，等.超長方案與微刺激方案在卵巢低反 應(yīng) 患 者 的 應(yīng) 用 價 值［J］.生 殖 醫(yī) 學(xué) 雜 志，2012，21：451-453.

［8］ 何方方.卵巢低反應(yīng)人群超促排卵的治療策略［J］.生殖醫(yī)學(xué)雜志，2012，21：528-530.

［9］ Baerwald AR，Adams GP，Picrson RA.Characterization of ovarian follicular wave dynamics in women［J］.Biol Reprod，2003，69：1023-1031.

［10］ Bentov Y，Esfandiari N，Gokturk A，et al.An ongoing pregnancy from two waves of follicles developing during a long follicular phase of the same cycle［J］.Fertil Steril，2010，94：350.e8-11.

［11］ Demirtas E，Elizur E，Holzer H，et al.Immature oocyte retrieval in the luteal phase to preserve fertility in cancer patients［J］.Reprod Biomed，2008，17：520-523.

［12］ Maman E，Meirow D，Brengauz M，et al.Luteal phase oocyte retrieval and in vitro maturation is an optional procedure for urgent fertility preservation［J］.Fertil Steril，2011，95：64-67.

［13］ Nayak SR，Wakim AN.Random-start gonadotropin releasing hormone（GnRH）antagonist-treated cycles with GnRH agonist trigger for fertility preservation［J］.Fertil Steril，2011，96：e51-54.

［14］ S?nmezer M，Türkcüo?lu I，Coskun U，et al.Random-start controlled ovarian hyperstimulation for emergency fertility preservation in letrozole cycles［J］.Fertil Steril，2011，95：2125.e9-11.

［15］ Von Wolff M，Thaler CJ，F(xiàn)rambach T，et al.Ovarian stimulation to cryopreserve fertilized oocytes in cancer patients can be started in the luteal phase［J］.Fertil Steril，2009，92：1360-1365.

［16］ Bin Xu，Yanping Li.Flexible ovarian stimulation in a poor responder：a case report and literature review［J／OL］.Reprod Biomed Online，2013，26：378-383.

［17］ Pache T，Wladimiroff J，DeJong F，et al.Growth patterns of nondominant ovarian follicles during the normal menstrual cycle［J］.Fertil Steril，1990，54：338-342.

［18］ Hodgen G.The dominant ovarian follicle［J］.Fertil Steril，1982，38：281-300.

［19］ Baerwald AR，Adams GP，Pierson RA.Characterization of ovarian follicular wave dynamics in women［J］.Biol Reprod，2003，69：1023-1031.

［20］ Buendgen NK，Schultze-Mosgau A，Cordes T，et al.Initiation of ovarian stimulation independent of the menstrual cycle：a case-control study［J］.Arch Gynecol Obstet，2013，288：901-904.

［21］ Kuang Y，Hong Q，Chen Q，et al.Luteal-phase ovarian stimulation is feasible for producing competent oocytes in women undergoing in vitro fertilization／intracytoplasmic sperm injection treatment，with optimal pregnancy outcomes in frozen-thawed embryo transfer cycles［J］.Fertil Steril，2014，101：105-111.