湖南產石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取組分抑菌活性的比較研究

李 娟， 麻曉雪， 李順祥， 伍參榮， 陳鈺妍

（湖南中醫(yī)藥大學 中藥現(xiàn)代化教育廳重點實驗室， 湖南 長沙 410208）

湖南產石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取組分抑菌活性的比較研究

李 娟， 麻曉雪， 李順祥*， 伍參榮， 陳鈺妍

（湖南中醫(yī)藥大學 中藥現(xiàn)代化教育廳重點實驗室， 湖南 長沙 410208）

目的 石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取組分的體外抑菌活性比較。方法 采用平皿打孔法和二倍稀釋法測定各樣品的體外抑菌活性。結果 湖南產石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取組分對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白假絲酵母菌、乙型溶血性鏈球菌、幽門螺桿菌等多種致病菌表現(xiàn)出較強的抑制作用，對大腸埃希菌、痢疾志賀氏桿菌的抑制作用較弱，對綠膿桿菌無抑菌活性。石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌活性明顯強于正丁醇萃取組分和水層部分，其中水菖蒲石油醚和三氯甲烷萃取組分抑制乙型溶血性鏈球菌，水菖蒲正丁醇萃取組分抑制幽門螺桿菌的作用最強。最低抑菌濃度表明，水菖蒲乙醇提取物、石油醚和乙酸乙酯萃取組分對乙型溶血性鏈球菌，水菖蒲三氯甲烷和正丁醇萃取組分對幽門螺桿菌均具有顯著的抑制作用，最低抑菌質量濃度為 3.13 mg/mL。 結論 石菖蒲和水菖蒲均具有抑菌作用， 尤其是水菖蒲對乙型溶血性鏈球菌和幽門螺桿菌的抑制作用顯著，具有潛在的藥用開發(fā)價值。

石菖蒲；水菖蒲；乙醇提取物；萃取組分；抑菌活性

石菖蒲為天南星科植物石菖蒲 Acorus tatarinowii Schott.的干燥根莖，具有開竅豁痰，醒神益智，化濕開胃之功效。主治神昏癲癇，健忘失眠，耳鳴耳聾，脘痞不饑，噤口下痢。 主產于四川、 浙江、 江蘇、 湖南等地［1］。 水菖蒲為天南星科植物菖蒲 Acorus calamus L.的干燥根莖， 具有化痰開竅，除濕健脾，殺蟲止癢之功效。主治痰厥昏迷，中風，癲癎，驚悸健忘，耳鳴耳聾，食積腹痛，痢疾泄瀉，風濕疼痛，濕疹，疥瘡。主產于湖北、湖南、遼寧、四川等地［2］。 民間在端午節(jié)這天掛菖蒲、 薰艾葉、 佩帶香囊袋、洗菖蒲浴等以避除穢惡之氣、 防病祛疫［3］。 現(xiàn)代藥學研究表明，石菖蒲和水菖蒲粗提物和揮發(fā)油具有多種生物活性，尤其在抑菌方面［4-9］。 湖南產石菖蒲和水菖蒲資源豐富， 為了了解本地產菖蒲藥材的抑菌活性，合理利用和開發(fā)本地資源，本研究對石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取組分的體外抑菌活性進行分析，為石菖蒲和水菖蒲抑菌活性成分的進一步篩選和藥用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器、 試劑與材料

1.1.1 主要儀器 SW-CJ-1B型超凈工作臺 ( 蘇州凈化設備有限公司)， WAC-47 全自動高壓滅菌鍋 (北京勤業(yè)永為科技有限公司)， 303S-0 型電熱恒溫培養(yǎng)箱 ( 上?？德穬x器設備有限公司)， T-214 電子天平 (北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)， SHZ-D循環(huán)水式真空泵 ( 鞏義市英峪予華儀器廠)， R-201 旋轉蒸發(fā)儀 ( 上海申順生物科技有限公司)。

1.1.2 試劑 普通營養(yǎng)瓊脂 (肉湯) 培養(yǎng)基 (杭州微生物試劑有限公司)， 無菌脫纖維羊血 (北京陸橋技術有限公司)， 明膠十六烷三甲基溴化胺培養(yǎng)基 (上海源葉生物科技有限公司)， 其余試劑均為分析純。

1.1.3 藥材 石菖蒲和水菖蒲于 2011 年 12 月采自湖南瀏陽大圍山，經湖南中醫(yī)藥大學劉塔斯教授鑒定為天南星科植物石 菖 蒲 Acorus tatarinowii Schott和 菖 蒲 Acorus calamus Linn.。 將采收的石菖蒲和菖蒲洗凈去泥砂， 取根莖， 陰干，備用。

1.1.4 供試 菌 種及 來 源 金 黃 色 葡 萄 球 菌 Staphylococcus aureus(ATCC25923) ， 大 腸 埃 希 菌 Escherichia coli (ATCC25922)， 綠 膿 桿 菌Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853) ， 表 皮 葡 萄 球 菌 Staphylococcus epidermidis (ATCC1228) ， 痢 疾 志 賀 氏 桿 菌 Shigella dysenteriae (ATCC25931) ， 白 假 絲 酵 母 菌Monilia albicans (ATCC10231) ， 乙 型 溶 血 性 鏈 球 菌 Strptococous hemolyticus (ATCC32210)， 均購于南京便診生物科技有限公司， 湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院病原免疫學實驗室保存；幽門螺桿菌Helicobacter pylori為中南大學湘雅附屬一醫(yī)院范學工教授贈送，湖南中醫(yī)藥大學醫(yī)學院病原免疫學實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 石菖蒲和水菖蒲不同提取物的制備 石菖蒲藥材粉碎成粗粉， 稱取 1 kg， 加 95%乙醇浸提 4 次， 每次 24 h，濾液合并后， 45 ℃減壓濃縮至無醇味， 得乙醇提取物。 將乙醇提取物加水溶散后，依次用不同極性的溶劑萃取，得石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇不同萃取組分和水層部分。水菖蒲藥材同法處理，依次得乙醇提取物、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇不同萃取組分和水層部分。 取各樣品適量， 加二甲基亞砜 (DMSO)， 用無菌水溶解， 制成質量濃度為 100 mg/mL溶液， 作為供試品溶液。

1.2.2 培養(yǎng)基的制備 普通營養(yǎng)瓊脂 (肉湯) 培養(yǎng)基用于金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、表皮葡萄球菌和痢疾志賀氏桿菌培養(yǎng)； 普通營養(yǎng)瓊脂 (肉湯) 培養(yǎng)基中另加入 8%脫纖維羊血用于乙型溶血性鏈球菌的培養(yǎng)； Skirrow血瓊脂培養(yǎng)基用于幽門螺桿菌培養(yǎng)；明膠十六烷三甲基溴化胺培養(yǎng)基用于綠膿桿菌培養(yǎng)；沙堡氏培養(yǎng)基用于白假絲酵母菌培養(yǎng)。

1.2.3 抑菌活性的測定［10-11］采用打 孔法， 并加以改 進。取無菌試管分別加入2 mL熔融并恒溫到58 ℃左右的營養(yǎng)瓊脂和 對 數(shù) 生 長 期 菌 液 0.1 mL( 菌 液 密 度 1 ×107CFU/mL)， 充分混勻， 立即倒入已制備好的平皿中， 使其均勻鋪開，冷凝后用直徑6 mm金屬滅菌打孔器于平皿中均勻且垂直打孔，挑出瓊脂，分別用定量移液器移取供試液100 μL， 及 DMSO溶液做陰性對照， 每個樣品重復3 次，每次做平行孔3 孔。 細菌37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h(幽門螺桿菌用 37 ℃微需氧環(huán)境 (85%N2， 10%CO2， 5%O2) 培養(yǎng) 72 h)， 真菌 28 ℃培養(yǎng) 48 h 后， 以游標卡尺分別測量每一個抑菌圈兩個垂直方向的直徑，抑菌環(huán)的邊緣以肉眼看不到細菌明顯生長為限，評價不同樣品的抑菌活性。

1.2.4 抑菌能力的測定［12］采用二倍稀釋法測定藥物的最低抑菌濃度 (MIC)， 每管 1.0 mL液體培養(yǎng)基中分別加入不同質量濃度的試驗樣品，使各提取物的終質量濃度分別為 100、 50、 25、 12.5、 6.25、 3.13、 1.57、 0.79 mg/ mL， 各管最終總容量為1mL。 另設置加等量不含任何藥物M-H液體培養(yǎng)基的正常對照， 含菌不含藥 M-H液體培養(yǎng)基的陽性對照。 各實驗管分別加入密度 2 ×107CFU/m L的各菌株對數(shù)生長期新鮮培養(yǎng)物 0.1 mL， 細菌 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h ［幽門螺桿菌用37 ℃微需氧環(huán)境 (85%N2， 10% CO2， 5%O2) 培養(yǎng) 72 h］， 真菌 28 ℃培養(yǎng) 48 h 后， 肉眼觀察不同菌株生長情況，以培養(yǎng)基中沒有細菌生長的最高稀釋度為 MIC， 初步確定抑菌濃度范圍。

2 結果與分析

2.1 石菖蒲和水菖蒲不同提取物的抑菌活性比較 從抑菌圈直徑分析，石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取組分對上述8種供試菌的抑菌圈直徑存在很大差異，結果見表1。

表 1 石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取組分的抑菌活性比較 （n=9）

從表1可知，石菖蒲和水菖蒲的不同樣品對除綠膿桿菌外的7種供試菌株均表現(xiàn)出明顯的抑菌活性，但其抑菌能力和抑菌范圍存在差異。由抑菌圈結果可知，不同樣品對革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌的抑菌作用明顯強于革蘭陰性菌大腸埃希菌和痢疾桿菌，并且對幽門螺桿菌和真菌白假絲酵母菌也有較強的抑制作用。其中，通過抑菌圈直徑比較，水菖蒲石油醚和三氯甲烷萃取組分抑制乙型溶血性鏈球菌，水菖蒲正丁醇萃取組分抑制幽門螺桿菌的活性最好，所有樣品對大腸埃希菌、痢疾志賀氏桿菌和綠膿桿菌的抑制作用較差。

石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物和石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌活性明顯強于正丁醇萃取組分和水層部分。不同藥材采用同種提取方法所得樣品在抑制同種菌種中比較可知，石菖蒲乙醇提取物和石油醚萃取組分的抑菌活性:幽門螺桿菌 ＞表皮葡萄球菌 ＞乙型溶血性鏈球菌＞金黃色葡萄球菌 ＞白假絲酵母菌 ＞痢疾桿菌＞大腸埃希菌＞綠膿桿菌， 水菖蒲乙醇提取物 (石油醚萃取組分)抑菌活性:乙型溶血性鏈球菌 ＞表皮葡萄球菌 ＞幽門螺桿菌＞白假絲酵母菌＞金黃色葡萄球菌 (金黃色葡萄球菌 ＞白假絲酵母菌)＞痢疾桿菌 ＞大腸埃希菌， 并且石菖蒲乙醇提取物抑制金黃色葡萄球菌和幽門螺桿菌，石菖蒲石油醚萃取組分抑制痢疾桿菌和大腸埃希菌的作用顯著強于水菖蒲的；水菖蒲乙醇提取物抑制乙型溶血性鏈球菌，水菖蒲石油醚萃取組分抑制表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的作用顯著強于石菖蒲的。石菖蒲 (水菖蒲) 三氯甲烷萃取組分抑菌活性: 表皮葡萄球菌 (乙型溶血性鏈球菌)＞幽門螺桿菌 ＞乙型溶血性鏈球菌 (表皮葡萄球菌)＞金黃色葡萄球菌＞白假絲酵母菌 ＞大腸埃希菌 ＞痢疾桿菌， 水菖蒲三氯甲烷萃取組分抑制乙型溶血性鏈球菌、表皮葡萄球菌、幽門螺桿菌、白假絲酵母菌和金黃色葡萄球菌的作用顯著強于石菖蒲的。石菖蒲 (水菖蒲) 乙酸乙酯萃取組分抑菌活性:乙型溶血性鏈球菌＞幽門螺桿菌 ＞表皮葡萄球菌＞金黃色葡萄球菌＞白假絲酵母菌＞痢疾桿菌 (大腸埃希菌)＞大腸埃希菌 (痢疾桿菌)。 石菖蒲乙酸乙酯萃取組分抑制金黃色葡萄球菌、痢疾桿菌和白假絲酵母菌的作用顯著強于水菖蒲的。 石菖蒲 (水菖蒲) 正丁醇萃取組分抑菌活性:幽門螺桿菌 ＞表皮葡萄球菌 ＞乙型溶血性鏈球菌＞白假絲酵母菌＞金黃色葡萄球菌＞大腸埃希菌 (痢疾桿菌)＞痢疾桿菌 (大腸埃希菌)， 并且水菖蒲正丁醇萃取組分抑制表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和幽門螺桿菌的作用顯著強于石菖蒲的。 石菖蒲 (水菖蒲) 水層部分抑菌活性:幽門螺桿菌 ＞白假絲酵母菌 ＞乙型溶血性鏈球菌 ＞表皮葡萄球菌 (金黃色葡萄球菌)＞金黃色葡萄球菌 (表皮葡萄球菌)＞大腸埃希菌 ＞痢疾桿菌， 并且兩者的抑菌活性無顯著性差異。

2.2 石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取組分的最低抑菌質量濃度 從表2可知，石菖蒲和水菖蒲不同樣品對革蘭陽性菌金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌以及對革蘭陰性菌幽門螺桿菌的 MIC范圍 3.13 ～12.50 mg/m L， 對白假絲酵母菌的 MIC 12.50 mg/mL。 其中， 水菖蒲的乙醇提取物、石油醚、乙酸乙酯萃取組分對乙型溶血性鏈球菌，水菖蒲三氯甲烷萃取組分對幽門螺桿菌均具有顯著的抑制作用， 最低抑菌質量濃度為 3.13 mg/m L， 當不同樣品的質量濃度為 12.5 mg/mL時， 均能抑制上述5 種供試菌株的生長。

3 結論

預實驗中對兩種藥材的乙醇浸提物和浸提后藥渣水煎煮液進行抑菌活性比較，發(fā)現(xiàn)水煎煮液的抑菌活性較弱，說明抑菌活性物質主要集中在脂溶性成分，并參考相關文獻［9，13-15］， 石菖蒲和水菖蒲 采用乙醇浸提， 既 提 取出脂溶性的成分，又避免因加熱引起的成分不穩(wěn)定，因此，本實驗采用 95%乙醇浸提。

湖南產石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取組分對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌、幽門螺桿菌和白假絲酵母菌等多種致病菌表現(xiàn)出較強的抑制作用，對大腸埃希菌和痢疾桿菌的抑制作用較弱，對綠膿桿菌無抑菌活性。石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物和石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取組分的抑菌活性明顯強于正丁醇萃取組分和水層部分。其中，通過抑菌圈直徑比較，水菖蒲石油醚和三氯甲烷萃取組分抑制乙型溶血性鏈球菌，水菖蒲正丁醇萃取組分抑制幽門螺桿菌的作用最強。不同藥材采用同種提取方法所得樣品在抑制同種菌種中比較可知，石菖蒲乙醇提取物抑制金黃色葡萄球菌和幽門螺桿菌，石油醚萃取組分抑制痢疾志賀氏桿菌和大腸埃希菌的活性強于水菖蒲；水菖蒲乙醇提取物抑制乙型溶血性鏈球菌，石油醚萃取組分抑制表皮葡萄球菌和乙型溶血性鏈球菌的活性明顯強于石菖蒲；水菖蒲三氯甲烷萃取組分抑制乙型溶血性鏈球菌、表皮葡萄球菌、幽門螺桿菌、白假絲酵母菌和金黃色葡萄球菌的活性明顯強于石菖蒲；石菖蒲乙酸乙酯萃取組分抑制金黃色葡萄球菌、痢疾志賀氏桿菌和白假絲酵母菌的活性明顯強于水菖蒲；水菖蒲正丁醇萃取組分抑制表皮葡萄球菌、乙型溶血性鏈球菌和幽門螺桿菌的活性明顯強于石菖蒲。最低抑菌濃度實驗表明，水菖蒲的乙醇提取物和石油醚、乙酸乙酯萃取組分對乙型溶血性鏈球菌，三氯甲烷萃取組分對幽門螺桿菌均具有顯著的抑制作用， 最低抑菌質量濃度為 3.13 mg/mL， 當不同樣品的質量濃度為12.5mg/mL時， 均能抑制金黃色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌、白假絲酵母菌、乙型溶血性鏈球菌和幽門螺桿菌的生長。

表 2 石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取組分的 M IC

實驗證明石菖蒲和水菖蒲均具有抑菌作用，尤其是水菖蒲的乙醇提取物和石油醚、三氯甲烷萃取組分對乙型溶血性鏈球菌，水菖蒲三氯甲烷、正丁醇萃取組分對幽門螺桿菌的抑制作用非常顯著，為進一步篩選抑菌活性成分提供依據(jù)。

中藥抗菌相對于西藥而言，是從整體水平發(fā)揮抗感染效應，許多藥物在抗感染的同時兼有解熱和消炎的作用，具有療效確切、副作用小、較少出現(xiàn)耐藥性等特點，因此，從具有抑菌活性的石菖蒲和水菖蒲中獲得抑菌活性物質，對中藥抑菌藥物的開發(fā)，有著非常積極的作用。

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:1001-1528(2014)02-0393-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.041

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國家中醫(yī)藥管理局 “藥用植物學” 重點學科課題 (國中醫(yī)藥發(fā) ［2009］ 30 號)， 湖南省高校科技創(chuàng)新團隊 (湘教通［2010］ 212 號)， 湖南中醫(yī)藥大學研究生創(chuàng)新課題 (校行研字 ［2012］ 4 號)

李 娟 (1979—) ， 女， 助理研究員， 研究方向: 中藥物質基礎與作用機制。 E-mail:Forever-lijuan@163.com

*通信作者: 李順祥， 博士生導師， 研究員， 研究方向: 中藥有效成分與資源。 E-mail:lishunxiang@hotmail.com