實驗設(shè)計-響應(yīng)面法優(yōu)化大葉當(dāng)歸中阿魏酸的閃式提取工藝

許代福，方應(yīng)權(quán)

(重慶三峽醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校，重慶萬州 404020)

當(dāng)歸為傘形科植物當(dāng)歸Angelica sinensis(Oliv.)Diels的干燥根，具有調(diào)經(jīng)止痛，活血補血的功效［1］。大葉當(dāng)歸(A.megaphylla)是我國特有的傘形科當(dāng)歸屬植物，分布于四川等地，在三峽庫區(qū)的巫溪、巴東、石柱和巫山等地區(qū)尤為常見，當(dāng)?shù)孛耖g常用作當(dāng)歸的代用品。本品含有與正品當(dāng)歸相同的藁本內(nèi)酯、揮發(fā)油、阿魏酸等活性成分［2-3］。阿魏酸 (ferulic acid)作為大葉當(dāng)歸的主要活性成分之一，具有抑制血小板聚集、抗血栓、抗心肌缺血、抗氧化，抗癌等作用。此外，阿魏酸在食品、醫(yī)藥、化妝品及添加劑等領(lǐng)域均有廣泛的用途［4-6］。阿魏酸的傳統(tǒng)提取方法包括滲漉法［7］、乙醇回流法［8］和超聲提取法［9］等。這些方法存在能量消耗大、所需溶劑多，操作時間長等缺點?，F(xiàn)代提取方法如超臨界CO2萃取法［7］、加速溶劑萃取法［10］以及微波輔助提取法［11］等用于提取當(dāng)歸中的阿魏酸也已見文獻報道，但這些方法也存在設(shè)備成本高，能耗大等缺點。

閃式提取法，又名組織破碎提取法，是近年來發(fā)展起來的一種新型提取技術(shù)，具有高效、迅速和節(jié)能等優(yōu)點［12-13］，該方法利用高速剪切力和超分子滲濾技術(shù)在短時間內(nèi)將藥材粉碎至細微顆粒，使藥材中有效成分迅速達到溶解平衡，從而實現(xiàn)高效提取。本實驗首次采用實驗設(shè)計結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)選閃提法提取大葉當(dāng)歸中阿魏酸的工藝條件，并與傳統(tǒng)的提取方法進行比較。

1 儀器與材料

Agilent 1200系列高效液相色譜儀，Agilent ChemStation B.04.02工作站 (美國安捷倫公司);JHBE-50S型中草藥閃式提取器 (河南金鼎科技發(fā)展有限公司);RE 52-86A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 (上海亞榮生化儀器廠);Millipore simplicity-185超純水器 (美國密里博公司);Sartorius BS110S分析天平(北京賽多利天平有限公司)。

大葉當(dāng)歸，采自巫溪大寧河畔1500米高山上，由三峽中藥研究所付紹智教授鑒定為A.megaphylla的根。阿魏酸對照品 (中國食品藥品檢定研究院提供，批號110773-200611);甲醇為色譜純，其余試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 大葉當(dāng)歸中阿魏酸測定方法 參考文獻［1，14］，測定大葉當(dāng)歸中阿魏酸的量。色譜條件為:安捷倫 SB C18高效液相色譜柱 (150 mm×4.6 mm，5 μm);以甲醇-水-磷酸 (30∶70∶0.3)為流動相;檢測波長為316 nm;體積流量為1.0 mL/min;柱溫35℃;進樣量20 μL;在1.98～99.00 μg/mL范圍內(nèi)阿魏酸質(zhì)量濃度與峰面積呈線性關(guān)系(r=0.9999);精密度RSD＜0.96%;平均加樣回收率為97.26%，RSD為1.75%。

2.2 實驗設(shè)計

2.2.1 考察因素和水平的確定 參考相關(guān)文獻報道及前期預(yù)試驗結(jié)果［9-11，15］，采用甲醇或乙醇提取當(dāng)歸中阿魏酸的效果較好，考慮安全因素，本研究選用乙醇為溶劑，并保持粉末粒徑為粗粉，閃提工作電壓120V，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積 (液料比)和提取時間對提取得率的影響。

取干燥大葉當(dāng)歸根莖，干燥，制成粗粉 (20目)，稱取20 g，進行閃式提取，提取完成后過濾提取液，濾液加70%甲醇-鹽酸 (100∶1)稀釋至500 mL，密塞，稱定質(zhì)量，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇-鹽酸 (100∶1)補足質(zhì)量，搖勻，靜置，取上清液，以0.45 μm孔徑濾膜濾過，按“2.1”項測定阿魏酸的含有量，以阿魏酸得率作為考察指標(biāo)，采用單因素法考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比和提取時間對閃式提取的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)15倍量 (v/m)65%乙醇提取時間80 s時，閃式提取大葉當(dāng)歸中阿魏酸得率較高。

2.2.2 Box-Behnken實驗設(shè)計及響應(yīng)面分析 選取影響閃式提取工藝的三個因素，即乙醇體積分?jǐn)?shù) (x1)，乙醇體積倍數(shù) (x2)，提取時間 (x3)為考察因素，以阿魏酸得率(Y)為響應(yīng)值，進行Box-Behnken試驗，各因素取3水平，分別記為－，0，+，各因素和水平編碼及實際值見表1，實驗方案及結(jié)果見表2。

表1 Box-Behnken試驗因素水平

表2 Box-Behnken試驗結(jié)果

采用 Design Expert 7.0.0(Stat-Ease Inc.Minneapolis)軟件對表2中不同試驗條件下所得到的阿魏酸收率進行回歸分析，得擬合方程:

其中Y為響應(yīng)值，βi代表不同的回歸系數(shù)，應(yīng)用統(tǒng)計分析軟件Design Expert 7.0.0對數(shù)據(jù)進行多元回歸和方差分析，結(jié)果如表3所示。

表3 Box-Behnken實驗設(shè)計方差分析

可見考察因素與響應(yīng)值之間呈二次二項式模型，該模型呈現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)極顯著意義 (P=0.001)。因素x1、x2和x3對響應(yīng)值 (得率)均具有顯著影響;各因素交互作用項中，乙醇倍數(shù) (x2)與提取時間 (x3)的交互作用對阿魏酸得率的影響呈現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)顯著意義，其它交互作用項的作用不顯著;各因素的二次項對響應(yīng)值都具有顯著性影響。為簡化方程求解，在保證擬合度的前提下，進行了相應(yīng)的方程簡化，在P＜0.1水平上拒絕無顯著相關(guān)的項目后，響應(yīng)值與試驗因素的擬合方程為:

上述方程中，模型P＜0.001，表明建立的模型具有極顯著意義，校正決定系數(shù) (Adj.R2)為0.9816，說明該方程擬合程度好。模型失擬值 (lack of fit)檢驗結(jié)果為:F值為3.09，P=0.2625，即模型失擬不具有統(tǒng)計學(xué)顯著意義［16］。各因素與響應(yīng)值的3D響應(yīng)面和等高線圖見圖1。劑消耗的綜合作用，其公式如下:

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積和提取時間對阿魏酸提取得率作用的響應(yīng)面 (3D)和等高線圖

其中，pi為響應(yīng)值的權(quán)重;n為響應(yīng)值的數(shù)目;di為單個響應(yīng)值的渴求函數(shù)。D值在0～1之間，D值越接近1則說明所確定的最優(yōu)條件越接近全局最優(yōu)條件。本研究設(shè)響應(yīng)值目標(biāo)為:得率最高，溶劑消耗最少，其中以得率為主要目標(biāo)，因此本實驗阿魏酸得率權(quán)重取10，乙醇體積分?jǐn)?shù)和乙醇體積倍數(shù)權(quán)重均取1。利用Design-Expert軟件整合渴求函數(shù)的計算功能，得最大化總體渴求值 (D)為0.796，因素的最佳水平組合為:乙醇64%，體積為藥材13倍(v/m)，提取時間100 s。在此工藝條件下，根據(jù)模型預(yù)測阿魏酸得率為0.0299%。

為驗證優(yōu)選工藝的可靠性和模型的預(yù)測性，取大葉當(dāng)歸30 g，按最優(yōu)工藝進行閃式提取，平行操作3份，按“2.1”項下測定，阿魏酸得率均值為0.0292%，RSD為1.20%，與模型預(yù)測值的偏差為－2.31%。表明該工藝穩(wěn)定可行，具可操作性和重復(fù)性，且模型預(yù)測性好。

2.4 與其他提取方法的比較 根據(jù)文獻［7-9］，分別采用滲漉法、乙醇回流法和超聲提取法提取大葉當(dāng)歸中的阿魏酸，每種方法重復(fù)3次，結(jié)果見表4。

表4 提取方法比較

3 討論

近年來，實驗設(shè)計 (design of experiment，DoE)結(jié)合響應(yīng)面法 (response surface methodology，RSM)在中藥提取和制備中應(yīng)用日益廣泛［17-18］。本研究在參考文獻和前期實驗的基礎(chǔ)上，通過實驗設(shè)計-響應(yīng)面法，結(jié)合計算渴求函數(shù)值，得到了閃式提取大葉當(dāng)歸中阿魏酸的最佳工藝條件，藥材制成粗粉 (20目)，以13倍 (m/V)的64%乙醇為提取溶劑，工作電壓120 V，提取時間100 s。該方法操作簡單穩(wěn)定，重現(xiàn)性好，提取率較高。

比較閃式提取法和傳統(tǒng)提取方法可見 (表4)，乙醇回流法得率高，但液料比也高，閃提法和超聲輔助提取法的溶劑消耗量比較接近，為乙醇回流法的一半左右，得率分別為乙醇回流法的92.1%和89.9%。滲漉法溶劑消耗最少，但提取前需要浸泡2 d，因此操作時間最長，得率也相對較低。閃提法在提取時間上具有明顯優(yōu)勢，超聲輔助提取法、乙醇回流法和滲漉法所需時間分別是其30倍、108倍和2160倍。綜合考慮，閃提法不失為提取大葉當(dāng)歸中阿魏酸的一種良好方法。

從實驗和文獻［9，12，14］中可以看到，大葉當(dāng)歸中阿魏酸的含有量低于正品當(dāng)歸，因此在使用上，可適當(dāng)增大中藥的用量，以保證治療效果。而大葉當(dāng)歸中其它有效成分的量也有待于進一步考察，以保證用藥安全。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典:2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:124-125.

［2］宋萍萍，徐增萊，王年鶴.天目當(dāng)歸和大葉當(dāng)歸化學(xué)成分研究［J］.中藥材，2010，33(8):1249-1251.

［3］嚴(yán) 輝，段金廒，錢大瑋，等.我國不同產(chǎn)地當(dāng)歸藥材質(zhì)量的分析與評價［J］.中草藥，2009，40(12):1988-1992.

［4］王玉華，容 蓉，魏英勤，等.四物湯中阿魏酸對兔血指標(biāo)的相關(guān)聯(lián)系［J］.中成藥，2010，32(2):260-264.

［5］呂海濤，王艷麗，王英芹.當(dāng)歸提取液中阿魏酸穩(wěn)定性研究［J］.中成藥，2008，30(10):1555-1557.

［6］謝仲德，方應(yīng)權(quán)，李文烈，等.當(dāng)歸調(diào)經(jīng)膠囊的薄層鑒別與阿魏酸、芍藥苷的測定［J］.中成藥，2013，35(2):427-430.

［7］歐陽廣娜.當(dāng)歸藥效成分提取研究進展［J］.實用中醫(yī)藥雜志，2011，27(8):569-570.

［8］陳象青，屈 建，盧 今，等.田口實驗設(shè)計法優(yōu)選當(dāng)歸中阿魏酸的提取工藝［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2012，32(17):1366-1368.

［9］金汝城，李貴文，馬素麗，等.當(dāng)歸中阿魏酸提取工藝的優(yōu)化研究［J］.中成藥，2008，30(4):516-519.

［10］周桂芬，呂圭源，陳素紅.響應(yīng)面分析法優(yōu)化加速溶劑萃取當(dāng)歸中阿魏酸的工藝參數(shù)［J］.中成藥，2010，32(5):775-778.

［11］任占軍，谷學(xué)新，侯士果，等.微波萃取法提取當(dāng)歸中阿魏酸的研究［J］.藥物分析雜志，2008，28(1):115-117.

［12］于 敏，韓德強.閃式提取法提取丹參中有效成分的研究［J］.中成藥，2010，32(9):1609-1612.

［13］徐瑞超，董自亮.響應(yīng)面法優(yōu)化大豆異黃酮閃式提取工藝研究［J］.成都中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報，2012，35(1):48-51.

［14］方應(yīng)權(quán)，易為丹.HPLC測定三峽庫區(qū)道地藥材巫溪大葉當(dāng)歸中阿魏酸的含量［J］.中國實驗方劑學(xué)雜志，2013，19(6):90-92.

［15］于 敏，嚴(yán)升平，邵煒軍，等.閃式提取法提取當(dāng)歸中阿魏酸的實驗研究［J］.藥物生物技術(shù)，2009，16(4):374-376.

［16］Golabchifar A A，Rouini M R，Shafaghi B，et al.Optimization of the simultaneous determination of imatinib and its major metabolite，CGP74588，in human plasma by a rapid HPLC method using D-optimal experimental design［J］.Talanta，2011，85(5):2320-2329.

［17］吳秋月，陳 鵬，仲月明，等.響應(yīng)面法優(yōu)化提取銀杏雄株葉片聚戊烯醇的工藝研究［J］.中成藥，2013，35(2):267-272.

［18］馬瑞麗，張 蓉，徐秀泉，等.響應(yīng)面分析法優(yōu)化大血藤中總酚的超聲提取工藝［J］.中成藥，2013，35(2):404-407.