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    七葉鬼燈檠總酚微波輔助提取工藝優(yōu)化及其DPPH自由基清除能力分析

    2014-11-04 15:09:12肖婭萍
    中成藥 2014年2期
    關(guān)鍵詞:總酚清除率提取物

    孫 婷,姚 佳,肖婭萍

    (藥用資源與天然藥物化學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,西北瀕危藥材資源開發(fā)國家工程實(shí)驗(yàn)室,陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,陜西西安 710062)

    七葉鬼燈檠 (Rodgersia aesculifolia Batalin)是虎耳草科 (Saxifragaceae)鬼燈檠屬多年生草本植物[1]。以根莖入藥,藥材稱為索骨丹。其藥用歷史悠久,具有清熱解毒、止瀉、止血、生肌等功效,主治跌打損傷,月經(jīng)不調(diào)和風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等[2-3]。七葉鬼燈檠的根莖含蒽醌苷、強(qiáng)心苷、淀粉、糖類、鞣質(zhì)[4],入藥可治療濕熱下痢、久瀉、便血、瘡毒等[5]。七葉鬼燈檠含有巖白菜素、兒茶素、沒食子酸、熊果苷等酚酸類化合物,均有很強(qiáng)的生理和藥理活性[6-7]。目前研究報(bào)道較少,多數(shù)集中在主要成分巖白菜素的研究,也有部分該屬植物的化學(xué)成分研究,隨著研究的不斷深入,鬼燈檠屬植物中更多的活性物質(zhì)以及生物學(xué)活性有待于發(fā)掘。

    微波輔助萃取技術(shù) (microwave-assistedextraction,MAE),是將被萃取的原料浸于溶劑中,利用微波能使原料中的化學(xué)成分迅速溶出萃取的方法。具有選擇性高、能耗低、效率高、污染小并且對成分破壞小等優(yōu)點(diǎn),已被廣泛用于藥用植物有效成分的提取。本研究擬采用單因素試驗(yàn)法,分別考察微波輔助下微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取時(shí)間等不同因素對總酚提取率的影響,并在單因素基礎(chǔ)上進(jìn)行正交試驗(yàn),以確定七葉鬼燈檠總酚的最佳提取工藝方案。同時(shí),我們還對其總酚成分清除DPPH自由基能力進(jìn)行了分析。

    1 材料與方法

    1.1 材料 七葉鬼燈檠于2010年8月采自陜西寧陜縣旬陽壩,經(jīng)陜西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院田先華教授鑒定為虎耳草科鬼燈檠屬植物七葉鬼燈檠Rodgersia aesculifolia Batalin。稱取七葉鬼燈檠干燥根莖250g,粉碎后過40目篩,備用。

    1.2 試劑與儀器 沒食子酸對照品 (100mg,中國藥品生物制品檢定所);Folin-Phenol,無水乙醇 (天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠);亞硝酸鈉、硝酸鋁均為分析純 (天津北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);丁基羥基茴香醚 (BHT)和1,1-二苯基苦基苯肼 (DPPH)購自Sigma公司;蒸餾水、超純水為本實(shí)驗(yàn)室自制。

    MAS-Ⅱ型常壓微波催化合成/萃取儀 (上海新儀微波化學(xué)科技有限公司);RⅡ旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 (上海豫康科教儀器設(shè)備有限公司);UV-2450紫外可見分光光度計(jì) (島津(香港)有限公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 總酚酸含量的計(jì)算 參照Folin-Ciocalteu法[8-9]測定七葉鬼燈檠中總酚酸含量。

    1.3.2 單因素試驗(yàn) 微波功率 將材料用70%乙醇按料液比1∶30預(yù)浸泡30 min,提取溫度65℃,提取時(shí)間5 min,分別在微波功率為300、400、500、600、700 W對樣品進(jìn)行總酚提取。

    乙醇體積分?jǐn)?shù) 將材料分別用20%、30%、40%、50%、60%的乙醇在料液比為1∶30預(yù)浸泡30 min,提取最佳功率500 W,提取溫度65℃,提取時(shí)間5 min進(jìn)行總酚提取。

    料液比 將材料用上面最佳乙醇體積分?jǐn)?shù),按料液比1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70分別進(jìn)行預(yù)浸泡30 min,提取最佳功率500 W,提取溫度65℃,提取時(shí)間5 min進(jìn)行總酚提取。

    提取時(shí)間 在最佳微波功率500 W,乙醇體積分?jǐn)?shù)40%和料液比1∶30的條件下,浸泡30 min,提取時(shí)間分別為4、6、8、10、12 min進(jìn)行總酚提取。

    1.3.3 待測樣品總酚提取率的計(jì)算 吸取適量樣品溶液,樣品中總酚濃度通過沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線公式進(jìn)行計(jì)算。按下式計(jì)算總酚提取率,每組試驗(yàn)重復(fù)3次??偡犹崛÷?%)=濃度×提取液體積/原料干重×100%

    1.3.4 總酚DPPH自由基清除率的計(jì)算 稱取七葉鬼燈檠總酚微波輔助最佳工藝提取物以及陽性對照BHT,用甲醇配制成質(zhì)量濃度為120 μg/mL的樣品溶液。將配制好的樣品溶液分別稀釋成90、60、30、15、9 μg/mL。用甲醇配制質(zhì)量濃度為80 μg/mL的DPPH自由基溶液。

    以甲醇為空白在波長517 nm處測定其吸光度A作為對照。另取0.1 mL不同質(zhì)量濃度的七葉鬼燈檠總酚 (9、15、30、60、90、120 μg/mL)與3 mL 0.08 mmol/L DPPH 自由基搖勻,在黑暗條件下放置30 min,以無水乙醇為空白在波長517 nm處測定其吸光度 (A樣品)。并按照以下公式計(jì)算DPPH自由基清除率。DPPH自由基清除率 (%)=(A對照-A樣品)/A對照×100

    2 結(jié)果與討論

    2.1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 稱取10.0 mg沒食子酸對照品,用甲醇溶解為100 μg/mL的沒食子酸對照品溶液。分別吸取對照品溶液0.1、0.2﹑0.3﹑0.4﹑0.5﹑0.6 mL于10 mL量瓶中,并補(bǔ)充適當(dāng)甲醇至1.0 mL。再各加入0.5 mL福林酚溶液,3 min后,分別加入1.5 mL,0.2 g/mL Na2CO3溶液,然后用去離子水定容至10.0 mL,混勻后靜置2 h,以水作空白,在波長760 nm處測定其吸光度。以吸光值A(chǔ)為縱坐標(biāo),質(zhì)量濃度C為橫坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得回歸方程為A=0.1063x+0.0277,R2=0.9994,質(zhì)量濃度在1~6 μg/mL之間線性關(guān)系良好。

    2.2 單因素試驗(yàn)

    2.2.1 微波功率對提取率的影響 微波功率對提取率的影響結(jié)果如圖1所示,結(jié)果表明,總酚提取率隨微波功率的增大而增加,在500 W時(shí)達(dá)到最高值,之后略有下降。因此,選擇500 W作為最佳微波功率。

    圖1 微波功率對總酚提取率的影響

    2.2.2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對提取率的影響如圖2所示,結(jié)果表明,當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)從20%升到30%時(shí),總酚提取率大幅上升;乙醇體積分?jǐn)?shù)由30%升到40%時(shí),總酚提取率上升趨勢緩慢;當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%時(shí),七葉鬼燈檠總酚提取率最高,之后開始下降,所以選擇體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇作為提取最佳溶劑。

    圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對總酚提取率的影響

    2.2.3 料液比對提取率的影響 料液比對多酚提取率的影響如圖3所示,結(jié)果顯示,料液比為1∶30時(shí)總酚提取率值最大,之后提取率下降,故選擇料液比為1∶30。材料使用小于1∶30的料液比時(shí),溶劑與材料反應(yīng)較劇烈,會噴濺不易操作,所以料液比選擇從1∶30開始。

    圖3 料液比對總酚提取率的影響

    2.2.4 提取時(shí)間對提取率的影響 提取時(shí)間對提取率的影響見圖4,結(jié)果表明,隨著提取時(shí)間的延長,總酚的提取率逐漸增加,在時(shí)間為8 min時(shí)達(dá)到最大值,之后開始逐漸下降。因此,選8 min為最佳提取時(shí)間。

    圖4 提取時(shí)間對總酚提取率的影響

    2.3 正交試驗(yàn) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果,選取提取時(shí)間、料液比、微波功率、乙醇體積分?jǐn)?shù)作為微波提取的因素,選擇正交表設(shè)計(jì)四因素三水平優(yōu)化七葉鬼燈檠總酚微波輔助提取的工藝。結(jié)果見表1。

    表1 正交試驗(yàn)

    由表1可知,得率最高的一組為第4組,即A2B1C2D3時(shí)總酚提取率達(dá)到最大值,4種因素對總酚提取率影響的順序?yàn)榱弦罕?(B) >乙醇體積分?jǐn)?shù) (D) >提取時(shí)間(A)>提取功率 (C)。極差分析結(jié)果表明,最佳提取工藝為A1B1C3D3,即提取時(shí)間為6 min、料液比為1∶30、功率為600 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)50%。由于C組R值最小,所以以C組功率為誤差列統(tǒng)計(jì)軟件SPSS17.0方差分析結(jié)果顯示,料液比P值為0.002小于0.01,表明料液比對得率的影響具有極顯著性差異;乙醇體積分?jǐn)?shù)和時(shí)間的P值分別為0.078和0.122均大于0.05,表明乙醇體積分?jǐn)?shù)和時(shí)間對得率的影響不顯著,極差分析和方差分析結(jié)果一致。由于提取時(shí)間和提取功率對得率影響不顯著,綜合考慮,提取時(shí)間選取6 min,提取功率選取500 W,料液比為1∶30、乙醇體積分?jǐn)?shù)為50%,即最佳組合為A1B1C2D3。對正交試驗(yàn)得到的最佳總酚提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),結(jié)果如表2所示??梢缘贸?,250 g的七葉鬼燈檠干燥根莖在最佳工藝優(yōu)化條件下得到的提取率為8.07%。

    表2 最佳工藝驗(yàn)證結(jié)果

    2.4 DPPH自由基的清除能力 從圖5可知,不同質(zhì)量濃度的七葉鬼燈檠總酚提取物對DPPH自由基均具有較強(qiáng)的清除能力,隨著提取物濃度的增大,對DPPH自由基的清除率也增加。在終質(zhì)量濃度為120 μg/mL時(shí),陽性對照BHT的清除率為98.51%,七葉鬼燈檠的微波輔助最佳總酚工藝的提取物對DPPH自由基的清除率為98.03%。自由基清除率為50%時(shí)的濃度稱為半清除率濃度,用IC50表示。IC50值越小說明對達(dá)到半清除率時(shí)所需的濃度就越小,也就是自由基清除活性越強(qiáng)。

    七葉鬼燈檠總酚提取物對DPPH自由基均有清除作用,并且其微波總酚提取物的IC50(12.20±1.60)μg/mL小于BHT的IC50(13.60±1.10)μg/mL,顯示了七葉鬼燈檠總酚提取物具有較強(qiáng)的抗氧化活性。特別此工藝優(yōu)化下提取物清除自由基的能力要好于BHT,且由于其是天然抗氧化物質(zhì),毒性小,相對于人工合成的抗氧化劑而言,具有很大的開發(fā)潛力以及很好的應(yīng)用前景[10],見圖5。

    圖5 BHT和七葉鬼燈檠不同提取物對DPPH自由基的清除率

    2.5 討論 微波萃取可廣泛應(yīng)用在中草藥、食品、化妝品等領(lǐng)域[11-12]。近年來在天然產(chǎn)物提取中有較多應(yīng)用。己有較多文獻(xiàn)報(bào)道微波用于中草藥中酚酮類成分的提取。微波萃取技術(shù)與傳統(tǒng)方法相比節(jié)約了時(shí)間,同時(shí)得率也有所提高[13]。微波輔助萃取具有選擇性高、能耗低、效率高、污染小并且對成分破壞小等優(yōu)點(diǎn),在植物的成分提取上已經(jīng)有廣泛的應(yīng)用。微波輔助提取已廣泛應(yīng)用于黃姜色素提?。?4]、馬錢子中總生物堿的提?。?5]、板藍(lán)根總有機(jī)酸的提?。?6]、獼猴桃根的多糖提?。?7]、玫瑰花的總黃酮提?。?8]等多種植物成分的提取。表明微波輔助萃取法在植物有效成分提取方面的應(yīng)用比較多。

    植物多酚是以苯酚為基本骨架的多羥基酚類化合物的總稱,存在于植物的葉、皮、殼和果肉中[19]。隨著研究的不斷深入,人們發(fā)現(xiàn)植物多酚具有抗氧化、抗衰老、抗炎、防輻射和降血壓等生物學(xué)活性[20]。植物多酚在醫(yī)藥、生物化學(xué)以及食品等領(lǐng)域的研究被受關(guān)注,對多酚類物質(zhì)的提取方法也在不斷的改進(jìn)[21]。

    七葉鬼燈檠中多酚含量較高,本試驗(yàn)通過微波輔助對七葉鬼燈檠總酚進(jìn)行了萃取,提取效率高,穩(wěn)定性好,操作簡便。為七葉鬼燈檠多酚類物質(zhì)的提取提供一定的參考。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明七葉鬼燈檠多酚提取物具有很強(qiáng)的抗氧化活性,而且是天然抗氧化物質(zhì),毒性小,相對于人工合成的抗氧化劑而言,具有很大的開發(fā)潛力以及很好的應(yīng)用前景,值得進(jìn)一步開發(fā)利用和研究。

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