白頭翁皂苷D抗肝癌作用的藥效學研究

徐 坤， 舒 展， 王永林， 許瓊明， 楊世林， 劉艷麗*

（1.蘇州大學醫(yī)學部藥學院， 江蘇 蘇州 215123； 2.貴陽醫(yī)學院藥學院， 貴州 貴陽 550004）

白頭翁皂苷D抗肝癌作用的藥效學研究

徐 坤1，2， 舒 展1， 王永林2， 許瓊明1， 楊世林1，2， 劉艷麗1*

（1.蘇州大學醫(yī)學部藥學院， 江蘇 蘇州 215123； 2.貴陽醫(yī)學院藥學院， 貴州 貴陽 550004）

目的 研究白頭翁皂苷 D( 毛茛科植物白頭翁 Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel的干燥根) 體內抗小鼠 H22肝癌細和體外的抗人肝癌 SMMC-7721 作用。 方法 在體外實驗中， 采用 MTT法考察白頭翁皂苷 D對 SMMC-7721 細胞增殖的抑制作用； 在體內實驗中， 采用小鼠 H22實體瘤進行體內抑瘤實驗， 測定腫瘤生長抑制率， 利用光鏡 (HE染色)、電鏡等方法進行形態(tài)學觀察。 結果 白頭翁皂苷 D處理人肝癌 SMMC-7721 細胞 24、 48、 72h 后， 給藥組均出現了不同程度的細胞增殖抑制。 白頭翁皂苷 D(4.5、 6.0mg/kg) 對小鼠 H22肝癌細胞實體瘤的生長有明顯的抑制作用， 抑瘤率分別為 38.67%和 41.59%(P＜0.01， 與模型組比較)。 組織學觀察顯示， 腫瘤細胞大量變性壞死， 電鏡下可見凋亡細胞和凋亡小體。結論 白頭翁皂苷D具有一定的體內、外抗腫瘤作用。

白頭翁皂苷D；肝癌；抗腫瘤；細胞增殖；細胞凋亡

白頭翁為毛茛科植物白頭翁 Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel的干燥根， 具有清熱解毒、 涼血止痢、燥濕殺蟲等功效，臨床上用于治療細菌性痢疾、 婦科陰道炎、 阿米巴痢疾等病癥［1］。 近年來從正品白頭翁中提取的新化學成分主要為皂苷類［2］。本課題組對白頭翁化學成分進行研究時分離得到白頭翁皂苷 D(pulsatilla saponin D)。

目前對白頭翁抗腫瘤的研究主要集中在其粗提物的體內外實驗［3-5］，Yong Kim等［6］研究發(fā)現，白頭翁皂苷 D對人肺癌 A549 細胞等腫瘤細胞有明顯的細胞毒活性， 且對 Lewis肺癌小鼠有顯著的體內抑瘤活性。 因此本實驗采用體外 MTT實驗， 初步確定白頭翁皂苷 D的抗肝癌作用， 其次， 建立 H22荷瘤模型，進一步觀察白頭翁皂苷D的抗肝癌作用，以期為確定白頭翁抗肝癌作用的物質基礎提供參考。

1 材料

1.1 藥品與試劑 白頭翁皂苷 D(Pulsatilla saponin D)， 蘇州大學天然藥物教研室提供； 注射用環(huán)磷酰胺 (0.2 g/支)， 批號 10072721， 江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司。 MTT，美國 Amersco公司； RPMI 1640 培養(yǎng)基， 小牛血清， Gibco公司；其他試劑均為國藥集團化學試劑有限公司產品。

白頭翁皂苷 D結構鑒定: 白色粉末 (甲醇)，ESI-MS m/z935.2 ［M+Na］+(C47H76O17Na， 計算值 935.2)； Liebermann-Burchard 反應呈陽性； Molish 反 應 呈 陽 性。1H-NMR(500 MHz， C5D5N) δ: 1.01， 1.01， 1.08， 1.10， 1.17， 1.31(each 3H， s，CH3)，5.54(1H， brs， H-12)， 1.73(3H，brs， 6-H3of rha)， 6.33(1H，brs， 1-H of rha)， 5.06(1H，d， J=8.0 Hz， 1-H of glc) ， 5.19(1H， d， J=6.0 Hz， 1-H of ara)。13C-NMR(125 MHz， C5D5N) δ: 81.18(C-3)，122.72(C-12)， 145.03(C-13)，64.04(C-23)， 180.64(C-28)， 104.54(Cara-1)，76.42(Cara-2)， 75.15(Cara-3)， 80.56(Cara-4)，65.53(Cara-5) 。 101.82(Crha-1)， 72.41(Crha-2)， 72.59(Crha-3)， 74.27(Crha-4)， 69.78 (Crha-5)，18.76(Crha-6)， 106.89(Cglc-1)，75.62(Cglc-2)， 78.93(Cglc-3)， 71.37(Cglc-4)，78.69(Cglc-5)， 62.64(Cglc-6)。 以上數據與文獻［7］ 報道一致，故鑒定化合物為白頭翁皂苷 D (pulsatilla saponin D)。結構見圖 1。

1.2 儀器 倒置熒光顯微鏡， eclipse TE2000-U型(日本 Nikon 公司)； Thermo MVLTISKANFC型酶標儀 (德國 Thermo Scientific公司)；BB-IS 型二氧化碳培養(yǎng)箱 ( 德國 Thermo Scientific公司)；超凈臺(蘇州凈化設備有限公司)； 22PC電子分析天平(上海精密科學儀器有限公司)； H-600 型透射式電子顯微鏡 (日本日立公司)。

圖1 白頭翁皂苷D結構式Fig.1 Structure of pulsatilla saponin D

1.3 細胞 人肝癌細胞 SMMC-7721、 H22腹水型小鼠肝癌細胞均購于中國科學院上海生命科學研究院。

1.4 動物 ICR小鼠， 清潔級， 雄性，體質量18 ～22 g， 動物合格證號 SCXK(滬)2007—0005。購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司。

2 方法

2.1 細胞培養(yǎng) 復蘇凍存的細胞， 離心去除凍存液， 加入 RPMI-1640 培養(yǎng)液 ( 含體積分數 10%已滅活的小牛血清、 青霉素 l×105U/L、 鏈霉素 100 mg/L)， 于 37 ℃、 5%CO2、 飽和濕度孵箱中靜置培養(yǎng)。次日換液，3～4 d傳代，取指數生長期細胞用于實驗。

2.2 細胞增殖抑制實驗 采用 MTT法［8］， 收集對數生長期 SMMC-7721 人肝癌細胞， 調整細胞懸液濃度至 1 ×105個/mL， 于 96 孔板每孔加入 100 μL， 置于 5%CO2、 37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h 至細胞完全貼壁，加入不同質量濃度的白頭翁皂苷D使終 濃 度 分 別 為 3.125、 6.25、12.5、 25、 50 μg/mL， 每個質量濃度設3 個復孔，藥物與細胞作用 24、 48、 72h， 終止培養(yǎng)前 4 h 加入 5 mg/mL的MTT 10 μL/孔， 培養(yǎng)結束后棄上清， 加入 100 μL DMSO振搖 10 min 使結晶充分溶解， 以酶標儀檢測 490 nm處各孔吸光度 A值。 取其均值計算藥物對細胞增殖抑制率 (%)， 并求其 IC50值， 重復 3次實驗。

2.3 體內抗腫瘤作用［9-10］

2.3.1 小鼠肝癌細胞 H22荷瘤小鼠模型制備 H22瘤株經小鼠腹腔傳3代以上，取腹部明顯膨大小鼠，脫臼處死，酒精消毒，一次性無菌注射器抽取乳白色腹水，置于已滅菌的離心管中，細胞計數器計數， 用生理鹽水調整細胞密度至 5 ×106個/mL，每只小鼠右腋下接種 0.2 m L。 小鼠接種瘤細胞24 h后， 隨機分為空白組、 模型組、 陽性組 (CTX 20 mg/kg， ip.)、 白 頭 翁 皂 苷 D 給 藥 組 (3.0、4.5、6.0 mg/kg， ip.)，每組 12 只?？瞻捉M及模型組用空白溶媒每天腹腔注射 0.2 mL/只； 陽性對照組腹腔注射環(huán)磷酰胺 20 mg/kg， 隔日 1 次； 白頭翁皂苷 D(3.0、4.5、6.0mg/kg， ip.)，連續(xù)給藥10 d， 每天稱取小鼠體質量。 最后一次給藥后 24 h， 剝離瘤體， 稱取瘤質量， 并計算抑瘤率。

2.3.2 腫瘤細胞形態(tài)學觀察 將各組腫瘤組織放入 10%甲醛液中， 石蠟包埋， 切片并進行 HE染色，光學顯微鏡下觀察并拍照。取各組小鼠腫瘤組織，按電鏡標本常規(guī)處理，透射電鏡觀察腫瘤細胞超微結構形態(tài)并拍照。

2.4 統(tǒng)計學方法

3 結果

3.1 體外對人肝癌細胞生長抑制作用

經不同質量濃度白頭翁皂苷D處理后，人肝癌細胞株 SMMC-7721 細胞的生長受到不同程度的抑制， 并呈濃度、 時間相關。 當白頭翁皂苷 D 50 μg/mL時， 作用 SMMC-7721 細胞 24、 48、 72 h 的增殖抑制率分別為 84.26%、 92.12%及 93.48%，其 IC50值 分 別 為 (7.17 ±2.92)、(5.73 ±1.59) 及(6.53 ±1.42) μg/mL。結果見表 1。

表 1 白頭翁皂苷 D 對人肝癌細胞 S MMC-7721 增殖的影響 （）Fig.1 Effects of pulsatilla saponin D on human liver cancer cell SMMC-7721 （）

表 1 白頭翁皂苷 D 對人肝癌細胞 S MMC-7721 增殖的影響 （）Fig.1 Effects of pulsatilla saponin D on human liver cancer cell SMMC-7721 （）

注:與模型組比較，*P＜0.05；與模型組比較，**P＜0.01

組別質量濃度/ (μg·m L-1) 7721 細胞 A值24 h(增殖抑制率/%)48 h(增殖抑制率/%)72 h(增殖抑制率/%)對照00.741 4 ±0.027 0(0)1.394 4 ±0.481 8(0)2.270 9 ±0.281 5(0)白頭翁皂苷 D3.1250.452 6 ±0.074 3*(39.08)0.738 2 ±0.294 1*(46.88)1.256 4 ±0.037 0**(44.27) 6.250.400 5 ±0.128 1**(46.33)0.716 5 ±0.201 4*(47.39)1.176 4 ±0.316 5**(48.48) 12.50.291 8 ±0.039 0**(60.66)0.573 9 ±0.183 9**(58.49)1.087 6 ±0.223 0**(52.38) 250.265 4 ±0.038 8**(64.24)0.433 6 ±0.194 3**(68.88)0.722 9 ±0.286 4**(68.73) 500.117 4 ±0.036 3**(84.26)0.106 8 ±0.026 0**(92.12)0.145 3 ±0.080 8**(93.48) 5-FU250.584 5 ±0.055 9(21.26)0.580 9 ±0.228 9*(58.79)0.205 5 ±0.085 4**(91.14)

3.2 體內抗腫瘤作用

3.2.1 對小鼠肝癌細胞 H22荷瘤的影響 與模型組相比，白頭翁皂苷D各個劑量組小鼠瘤質量明顯降低 (P＜0.01)； 環(huán)磷酰胺組瘤質量也顯著減低 (P＜0.01)。 白頭翁皂苷 D 4.5、 6.0 mg/kg劑量組 的 抑 瘤 率 分 別 為 38.67%、 41.59%， 陽 性(CTX) 組為 55.59%。 結果見表 2。

表 2 白頭翁皂苷 D 對小鼠肝癌細胞 H22荷瘤小鼠的影響（）Tab.2 Effect of Pulsatilla saponin D on H22cells in tumorbearing m ice（）

表 2 白頭翁皂苷 D 對小鼠肝癌細胞 H22荷瘤小鼠的影響（）Tab.2 Effect of Pulsatilla saponin D on H22cells in tumorbearing m ice（）

注: 與模型組比較，*P＜0.05； 與模型組比較，**P＜0.01

組別劑量/ (mg·kg-1)體質量/g始末瘤質量/g抑瘤率/%模型-24.6 ±1.4 33.6 ±3.71.767 ±0.726-白頭翁皂苷 D3.024.8 ±1.3 28.8 ±2.41.250 ±0.526*29.27 4.524.9 ±1.5 26.8 ±2.41.084 ±0.419**38.67 6.025.1 ±1.5 25.8 ±1.51.032 ±0.460**41.59環(huán)磷酰胺(CTX)2024.3 ±1.5 29.7 ±2.70.785 ±0.262**55.59

3.2.2 腫瘤細胞形態(tài)學觀察 光鏡下觀察， 模型組腫瘤細胞多呈團灶狀分布，有的呈腺樣排列，有的沿骨骼肌呈侵襲性生長， 將骨骼肌分離。 CTX組腫瘤細胞呈彌漫性分布，可見大量壞死細胞，細胞正常結構消失。白頭翁皂苷D處理組腫瘤細胞呈彌漫性分布，細胞大小不等，形態(tài)不規(guī)則，細胞核深染、出現異形和固縮，可見腫瘤細胞大量壞死，壞死區(qū)周圍可見凋亡細胞，且呈劑量依賴關系。結果見圖2。

電鏡下觀察，模型組腫瘤細胞呈圓形，細胞核較大， 結構完整， 核膜清晰，核仁明顯；CTX組腫瘤細胞大部分發(fā)生崩解、壞死現象，染色質凝集成塊，胞質內無明顯細胞器結構，呈溶解樣改變，可見凋亡小體。白頭翁皂苷D給藥組腫瘤細胞體積變小，細胞表面微絨毛減少或消失，核異染色質濃縮成塊，向核周邊凝集，核周間隙增寬，可見凋亡小體。 結果見圖3。

4 討論

圖2 HE染色病理切片觀察Fig.2 HE staining for pathological observation

圖3 透射電鏡觀察腫瘤細胞超微結構Fig.3 U ltrastructu re of tum or cells was observed under the transm ission electron m icroscope

惡性腫瘤是目前危害人類生命健康的嚴重疾病之一，據統(tǒng)計，每年全球肝癌發(fā)病率位居惡性腫瘤發(fā)病率的第 5 位， 死亡率居第 3 位［11］。 而我國每年死于肝癌的人數約為 11萬， 占全世界肝癌死亡人數的 45%［12］。 化學治療一直是臨床上治療腫瘤的主要手段之一，特別是對不適于手術治療或放射治療的患者。目前臨床上應用的廣譜抗腫瘤藥物如鉑類化合物、長春堿類藥物等，往往因較嚴重的毒副作用而限制了它們的臨床應用［13］。 為開發(fā)新型抗腫瘤藥物，我們對白頭翁皂苷D進行較系統(tǒng)的研究。

本次實驗的給藥劑量是參照本課題組在其它類白頭翁單體抗腫瘤實驗中的劑量以及前期預試實驗的劑量設定， 具體參照本課題組相關專利［14］。 在前期預試實驗中，環(huán)磷酰胺體內表現出了良好的體內抗腫瘤活性和穩(wěn)定性。然而，在體外實驗中未表現出良好的活性和穩(wěn)定性， 氟尿嘧啶 (5-FU) 卻表現出了很好的穩(wěn)定性及活性。通過查閱相關文獻發(fā)現，有的文獻報道在體內外實驗時采用了不同的陽性藥［15-16］。 所以本 次 實 驗 分 別 選 擇 5-FU、 環(huán) 磷酰胺 (CTX) 為體外和體內試驗陽性藥進行研究。經研究發(fā)現， 人肝癌細胞株 SMMC-7721 經3.125 ～50 μg/mL的白頭翁皂苷 D處理 24 h、 48 h 及 72 h后，其細胞生長受到不同程度的抑制，表明其對體外肝癌細胞生長有良好的抑制作用且呈劑量依賴性。體內實驗結果證實，白頭翁皂苷D對小鼠肝癌細胞 H22荷瘤生長有明顯的抑制作用， HE染色、電鏡顯示，白頭翁皂苷D給藥組腫瘤細胞大量壞死或凋亡，細胞核固縮，細胞核變小，可見凋亡小體等，提示其對肝癌細胞的增殖具有明顯抑制作用，作用機制可能與促腫瘤細胞凋亡有關。

本實驗為尋找抗腫瘤高效低毒的先導化合物提供理論依據，但其抗腫瘤作用機制及其與荷瘤機體免疫功能之間的關系，尚有待進一步研究。

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Effect of Pulsatilla saponin D on hepatocarcinoma in vivo and in vitro

XU Kun1，2， SHU Zhan1， WANG Yong-lin2， XU Qiong-ming1， YANG Shi-lin1，2， LIU Yan-li1*

(1.Department of Pharmacy， Soochow University， Suzhou 215123， China； 2.Department of Pharmacy， Guiyang University of Medicine， Guiyang 550004， China)

AIM To study the effect of Pulsatilla saponin D from root of Pulsatilla chinensis(Bge.)Regel on human hepatocarcinoma cell line SMMC-7721 in vitro andmouse H22hepatoma carcinoma cell in vivo.M ETHODS In vitro experiments，MTT assay was used to evaluate proliferational inhibition of P.saponin D on SMMC-7721 cells.In vivo experiments， ICR mice were used to establish H22hepatoma carcinoma cell tumor model.The suppression ratio of H22hepatoma carcinoma cell growth was determined.The morphologic and apoptotic body were evaluated by lightmicroscope(HE staining)and electronmicroscope.RESULTS Medication groups showed different levels of SMMC-7721 cells proliferation inhibition after24 h， 48 h， 72 h with P.saponin D.Marked inhibitory effect of Pulsatilla saponin D on the transplanted hepatocellular carcinoma H22was observed in the tumor-bearing mice.The inhibitory rateswere 38.67%and 41.59%respectively at the dose of 4.5 and 6.0 mg/kg P.saponin D， respectively.(P＜0.01 vs.modelgroup).Histopathological examination revealed widespread necrosiswith massive accumulation of infiltrating lymphocytes and plasmacytes in the tumors.Numerous apoptotic cells and apoptotic bodieswere observed in the tumors under the electron microscope.CONCLUSION Pulsatilla saponin D has anti-tumor effects in vivo and in vitro.

Pulsatilla saponin D；liver cancer； anti-tumor； cell proliferation； apoptosis

R966

:A

:1001-1528(2014)02-0240-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.005

2013-03-04

重大新藥創(chuàng)制國家科技 重大專 項 (2011ZX09102-001-19) ； 國家自 然科學基金 青年基金 (81102818) ； 國家自然 科學 基金(81273402)

徐 坤 (1988—) ， 男， 碩士生， 研究方向: 中藥活性成分。 Tel:15185996322 ， E-mail:xukun1633@126.com

*通信作者: 劉艷麗 (1974-) ， 女， 副教授， 研究方向: 中藥抗腫瘤。 Tel:(0512)69561421， E-mail:liuyanli@suda.edu.cn