趨化素對大鼠血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為的實驗研究

吳美善,熊 瑋,梁新劍,董少紅

(深圳市人民醫(yī)院心血管內(nèi)科，廣東 深圳 518020)

趨化素是孤獨G蛋白偶聯(lián)受體chemR23的內(nèi)源性配體，在組織中分布廣泛，主要由脂肪組織和肝臟合成分泌，具有調(diào)節(jié)骨骼的發(fā)育和代謝，維持皮膚正常生理功能等多種生物學(xué)效應(yīng)。以往的研究表明，趨化素是一種脂肪因子，其表達(dá)水平與肥胖相關(guān),并有調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞分化、促進(jìn)脂質(zhì)代謝、調(diào)節(jié)炎癥和免疫反應(yīng)等生物學(xué)效應(yīng)，被認(rèn)為是代謝綜合征的標(biāo)志物[1-2]。最近的研究發(fā)現(xiàn)，人冠狀動脈周圍的脂肪組織及冠狀動脈病變部位的血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cell，VSMC)和泡沫細(xì)胞均可高表達(dá)趨化素，且冠狀動脈粥樣硬化病變的嚴(yán)重程度與趨化素的水平呈正相關(guān)[3]。因此，本研究借助RNA干擾技術(shù)沉默趨化素相關(guān)基因，研究其對大鼠VSMC生物學(xué)行為的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1實驗材料 無特定病原級SD大鼠購自廣東省實驗動物中心，杜氏培養(yǎng)液(dulbecco′s modified eagle medium，DMEM)、0.25%胰酶、胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)均購自Gibco公司，脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司，RNA提取試劑盒購自Qiagen公司，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)試劑盒及染料法實時熒光定量試劑盒購自Takara公司，CCK8試劑盒購自同仁化學(xué)研究所，transwell小室購自Corning公司，雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購自凱基生物公司，大鼠α肌動蛋白抗體購自博士德公司，大鼠趨化素基因抑制劑及陰性對照由吉瑪公司合成，大鼠趨化素聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)引物及磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2研究方法

1.2.1VSMC細(xì)胞培養(yǎng) 選取100～150 g 健康的無特定病原級雌性SD大鼠5只，斷頭處死，無菌條件下取出胸主動脈，剝離外膜和內(nèi)膜，取出中膜組織，以1mm3大小組織塊進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，4～6 h后翻瓶，在含20%FBS的DMEM培養(yǎng)液中培養(yǎng)VSMC，混勻后差速傳代純化1～2次，免疫熒光法鑒定VSMC α肌動蛋白。VSMC培養(yǎng)成功后在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)液、37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2趨化素抑制劑轉(zhuǎn)染 VSMC消化離心后以合適密度接種到培養(yǎng)板，24 h后細(xì)胞融合到60%～70%時按照脂質(zhì)體2000說明書進(jìn)行操作，分成空白對照組A、陰性對照組B及抑制組C，后兩組分別轉(zhuǎn)染微RNA(microRNA,miRNA)146a錯義鏈(100 nmol/L)、趨化素抑制劑(100 nmol/L)，空白對照組加入同等劑量脂質(zhì)體2000及PBS，5 h后換成完全培養(yǎng)液，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

1.2.3熒光定量PCR 轉(zhuǎn)染48 h后按照RNA提取試劑盒說明書提取VSMC總RNA，紫外分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳測定RNA的濃度和純度，按照Takara反轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)體系為5xPrimeScipt buffer 2 μL，PrimeScipt RT Enzyme Mix I 0.5 μL，Oligo dt Primer 0.5 μL，Random 6 mers 0.5 μL，總RNA5 μL及去酶水加至10 μL，反轉(zhuǎn)錄條件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。取出后放置-20 ℃冰箱保存待測。

按照染料法實時熒光定量試劑盒熒光定量PCR試劑盒說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，引物序列為：趨化素上游引物5′-ATCGGTCGACGCATGAAGTGCTTGCTGATCTC-3′，下游引物5′-ATCGCTCGAGTTTGGTTCTCAGGGC-3′，GAPDH上游引物5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′，GAPDH下游引物5′-AGATCCACAACGGATACATT-3′。反應(yīng)體系為：染料法實時熒光定量試劑盒 10 μL，上游引物0.4 μL，下游引物0.4 μL，ROX Reference Dye 0.4 μL，DNA模板2.0 μL，dH2O 6.8 μL，反應(yīng)條件：95 ℃ 10s，循環(huán)1次；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，循環(huán)40次。miR-146a與GAPDH相對表達(dá)量用公式2-ΔΔCT計算。

1.2.4VSMC增殖 細(xì)胞消化離心后以每孔1×104個細(xì)胞接種到96孔板，每組設(shè)6個復(fù)孔，24 h后進(jìn)行轉(zhuǎn)染，5 h后換成100 μL完全培養(yǎng)液，分別在0、12、24和48 h加入10 μL 細(xì)胞增殖檢測試劑盒染色，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)2 h后在酶聯(lián)免疫檢測儀下測定450 nm(參考波長650 nm)的光密度值。

1.2.5VSMC遷移 細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后消化離心，調(diào)整細(xì)胞濃度為1×105/mL，取100 μL細(xì)胞懸液加入transwell小室，培養(yǎng)板內(nèi)加入200 μL含20% FBS的DMEM培養(yǎng)液，12 h后取出transwell小室，棉拭子刮除膜上層的細(xì)胞，4%多聚甲醛固定30min，PBS洗3遍，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，每組隨機(jī)取6個視野，在顯微鏡下計算每個視野下的細(xì)胞數(shù)。

1.2.6VSMC凋亡 細(xì)胞消化離心后以每孔1×105個細(xì)胞接種到6孔板，常規(guī)轉(zhuǎn)染，48 h后以不含乙二胺四乙酸的0.25%胰酶消化離心，PBS洗滌細(xì)胞，先后加入500 μL的連接緩沖液、1 μL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒及5 μL 7-氨基放線菌素，在1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測。

2 結(jié) 果

2.1趨化素抑制劑轉(zhuǎn)染效率及PCR檢測 轉(zhuǎn)染趨化素抑制劑5 h后用熒光顯微鏡觀察，在VSMC胞質(zhì)內(nèi)可見大量顆粒狀熒光，部分熒光可呈現(xiàn)細(xì)胞輪廓，表明趨化素抑制劑已進(jìn)入VSMC內(nèi)趨化素對大鼠血管平滑肌細(xì)胞生物學(xué)行為的實驗研究。為了驗證是否干擾成功，應(yīng)用實時PCR檢測了3組細(xì)胞之間的miR-146a水平，與空白對照組A和陰性對照組B相比，抑制組C的miR-146a水平顯著下降表明RNA干擾成功(表1)。

圖1 原代VSMC(光鏡×100)

圖2 趨化素抑制劑轉(zhuǎn)染效率(熒光顯微鏡×200)

圖3 趨化素抑制劑對VSMC遷移的作用(×200)

表1 各組之間趨化素mRNA熒光定量PCR結(jié)果

ΔCt=Ct趨化素-CtGAPDH;ΔΔCt=(ΔCtB組或C組-ΔCtA組) A組:空白對照組；B組：陰性對照組；C組：抑制組

2.2趨化素抑制劑抑制VSMC增殖 為了研究沉默趨化素對VSMC增殖的作用，采用CCK8法檢測3組細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后0～48h的增殖率。轉(zhuǎn)染前，3組細(xì)胞的光密度值相比差異無統(tǒng)計意義(P>0.05)，12 h時抑制組C細(xì)胞的光密度出現(xiàn)差異，但無統(tǒng)計意義(P>0.05)，在24 h和48 h時，抑制組C與空白對照組A、陰性對照組B之間出現(xiàn)差異，有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)(表2)。

2.3趨化素抑制劑抑制VSMC遷移 在轉(zhuǎn)染趨化素抑制劑后48 h，對穿過transwell小室的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)發(fā)現(xiàn)，C組的細(xì)胞數(shù)顯著少于A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)(表3及圖3，見封三)，表明抑制趨化素可以降低VSMC的遷移能力。

表2 趨化素抑制劑對VSMC增殖的作用

A組:空白對照組；B組：陰性對照組；C組：抑制組

表3 趨化素抑制劑對VSMC穿過transwell小室數(shù)量的影響

A組:空白對照組；B組：陰性對照組；C組：抑制組

2.4趨化素抑制劑抑制VSMC凋亡的作用 在轉(zhuǎn)染趨化素抑制劑48 h后，采用雙染法測定VSMC凋亡。結(jié)果顯示，A組與B組VSMC的凋亡率分別為(5.5±0.7)%和(6.3±1.0)%，C組VSMC的凋亡率為(14.2±3.7)%，C組VSMC的凋亡率顯著高于A組和B組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.61,P<0.05)(圖4)。

*與A組比較,P<0.05

3 討 論

VSMC增殖、遷移以及凋亡發(fā)生改變可能受到各種因素的調(diào)控，因此闡明某一特定狀態(tài)下的VSMC生物學(xué)行為是治療血管增生性疾病的新舉措。前人的研究已經(jīng)初步驗證了趨化素與冠狀動脈粥樣硬化性心臟病和急性心肌梗死的發(fā)生具有相關(guān)性[4-5]，鑒于再狹窄的發(fā)生機(jī)制主要是炎癥和免疫反應(yīng)，與動脈粥樣硬化的病理過程大致相同，因而可以假設(shè)趨化素的激活和表達(dá)也可能是促進(jìn)再狹窄發(fā)生、發(fā)展的重要因素之一。所以本研究通過RNA干擾技術(shù)，以沉默VSMC中的趨化素，觀察其對VSMC增殖、遷移和凋亡的影響。

本研究中，VSMC增殖的結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染趨化素抑制劑后VSMC增殖受到顯著抑制，同時，檢測細(xì)胞凋亡的流式結(jié)果表明受到趨化素抑制劑轉(zhuǎn)染后的VSMC細(xì)胞凋亡率顯著高于空白對照組A和陰性對照組B，提示沉默趨化素不僅有抑制VSMC增殖的作用，而且兼有促進(jìn)VSMC凋亡的作用，這與Cui等[6]的研究結(jié)果近似。此外，關(guān)于對VSMC遷移的影響情況，本實驗結(jié)果顯示經(jīng)趨化素抑制劑轉(zhuǎn)染的VSMC遷移率顯著低于其余兩組，結(jié)合VSMC受到活性物質(zhì)刺激時，表型可發(fā)生改變即由收縮型轉(zhuǎn)變?yōu)楹铣尚?，增殖能力也增強，位置也可發(fā)生改變，由血管中膜遷移到內(nèi)膜，從而使血管壁增厚，管腔變窄，導(dǎo)致血管壁組織發(fā)生重構(gòu)的病理生理特點[7]，提示其可能為行經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動脈成形術(shù)患者術(shù)后再狹窄的發(fā)生機(jī)制之一。這與Asare等[8]的研究相一致。

本實驗通過RNA干擾技術(shù)沉默趨化素能夠顯著抑制大鼠VSMC的增殖和遷移，并能提高其凋亡水平，為血管增生性疾病的防治提供了試驗依據(jù)。但這些效應(yīng)的具體機(jī)制尚不清楚，有待進(jìn)一步研究。

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