胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩及其研究進(jìn)展

麻曉靜，沈建新，秦達(dá)念，王海燕

(汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院 1生理學(xué)教研室， 2病理生理學(xué)教研室，廣東 汕頭 515041)

胰腺腺泡細(xì)胞在興奮劑刺激下產(chǎn)生的規(guī)律性鈣振蕩是指胞質(zhì)游離鈣的周期性升高和恢復(fù)，是一種普遍的胞內(nèi)鈣信號形式，幾乎在迄今研究過的所有細(xì)胞中均可觀察到[1]。胰腺腺泡細(xì)胞是一種非興奮性細(xì)胞，主要負(fù)責(zé)分泌胰液。生理情況下，胰腺腺泡細(xì)胞的分泌主要受迷走神經(jīng)末梢釋放的乙酰膽堿(acetylcholine，ACh)和小腸黏膜中I細(xì)胞分泌的一種多肽激素縮膽囊素(cholecystokinin，CCK)的雙重調(diào)節(jié)。離體研究中發(fā)現(xiàn)，ACh和CCK都可作為受體激動劑引起胰腺腺泡細(xì)胞產(chǎn)生鈣振蕩。可見鈣振蕩與胰腺腺泡細(xì)胞的分泌功能密切相關(guān)[1-2]。ACh和CCK引起的鈣振蕩各有特點(diǎn)，這可能與它們的產(chǎn)生機(jī)制不同有關(guān)。

1 胰腺腺泡細(xì)胞

正常情況下，機(jī)體中胰腺腺泡細(xì)胞在形態(tài)結(jié)構(gòu)上有極性，其酶原顆粒集中在細(xì)胞頂端形成分泌極；細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)非常發(fā)達(dá)，形成一個稠密的相互連通的管狀系統(tǒng)，包圍著位于細(xì)胞基底部的細(xì)胞核，并占據(jù)了基底區(qū)的主要部分，其終端延伸到酶原顆粒區(qū)并一路貫穿到頂端細(xì)胞膜；高爾基體和線粒體位于細(xì)胞核與酶原顆粒區(qū)之間(圖1，見封三)[3]。離體的單個胰腺腺泡細(xì)胞在形態(tài)上雖有較大改變，但保留了完整的胞內(nèi)Ca2+信號系統(tǒng)，是研究Ca2+信號的常用模型[4]。

2 胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩

2.1胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的特征 神經(jīng)遞質(zhì)ACh和激素CCK可引起特征不同的鈣振蕩模式[5]。低濃度(生理濃度，25～500 nmol)ACh可引起高頻(0.050～0.133 Hz)正弦波鈣振蕩，一般開始于細(xì)胞的分泌極，并傳播到整個細(xì)胞；低濃度(生理濃度，1～50 pmol)CCK可引起低頻(<0.017 Hz)的持續(xù)時間較長的一系列離散的鈣瞬變。在鈣瞬變過程中，胞內(nèi)Ca2+濃度的升高和恢復(fù)比較慢，并且?guī)缀跬瑫r遍及整個細(xì)胞[5-6]。由ACh引起的高頻鈣振蕩具有細(xì)胞外Ca2+的依賴性，在排除細(xì)胞外Ca2+后振蕩逐漸消失；而CCK引起的低頻鈣瞬變對細(xì)胞外Ca2+的依賴性較小，故在缺乏胞外Ca2+時仍能持續(xù)[6]。ACh在特殊條件下也能引起類似于CCK引起的低頻鈣瞬變[6]。另外，CCK能顯著增強(qiáng)ACh引起的反應(yīng)，把局部高頻鈣振蕩變成持續(xù)時間較長的整體鈣瞬變，這個現(xiàn)象依賴于環(huán)ADP核糖受體的激活[2,7-8]。

在胰腺腺泡細(xì)胞中，不同濃度的CCK也可引起波形有所不同的鈣振蕩。低濃度(≤5 pmol)CCK可引起局部短時持續(xù)鈣峰，而稍高濃度(10～20 pmol)CCK可引起短時持續(xù)鈣峰和較寬鈣瞬變的混合波[5]。10 pmol的CCK可引起規(guī)律性鈣振蕩，CCK受體拮抗劑FK480(10 nmol)能完全阻斷這種振蕩，并且這種抑制作用能持續(xù)相當(dāng)長的時間[9]。用20 pmol的CCK刺激腺泡細(xì)胞，無論是否存在胞外Ca2+，都可引起鈣振蕩[10-11]。

2.2胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的測定方法

2.2.1直接法 直接法即鈣熒光指示劑法，鈣熒光指示劑與胞內(nèi)游離鈣離子結(jié)合后，用相應(yīng)波長的激發(fā)光可使其發(fā)出特定波長的熒光。

Fura-2是典型的雙波長熒光指示劑，其本身的激發(fā)波長為380 nm；與游離Ca2+結(jié)合后形成Fura-2-Ca2+復(fù)合物，激發(fā)波長為340 nm；發(fā)射熒光波長均約為510 nm。因此，F(xiàn)ura-2與游離Ca2+結(jié)合后，380 nm處熒光減弱，而340 nm處熒光增強(qiáng)。通過熒光比值(F340/F380)變化的Ca2+依賴性可定量測定胞內(nèi)游離Ca2+濃度[12]。

Fluo-3是典型的單波長指示劑，其最大吸收波峰為506 nm，最大發(fā)射波長為526 nm，可在遠(yuǎn)離340～380 nm波長范圍(屬紫外光)內(nèi)被可見激光(488nm)激發(fā)而測得鈣熒光。Fluo-3結(jié)合Ca2+后的熒光強(qiáng)度比游離態(tài)的高出35～40倍，可有效避免透鏡吸收和細(xì)胞自身的熒光干擾。Fluo-3對Ca2+的特異性強(qiáng)，親和力弱，易解離，適合測定胞內(nèi)Ca2+的快速、微量變化，常與激光共聚焦顯微鏡或雙光子顯微鏡聯(lián)用，以測定胞內(nèi)Ca2+的動態(tài)變化。

Fluo-4是將Fluo-3結(jié)構(gòu)中的Cl替換成F的鈣熒光指示劑，由于F的電子吸引力更強(qiáng)，其最大激發(fā)波長為494nm，這與氬激光的激發(fā)波長(488 nm)更接近，故其激發(fā)熒光強(qiáng)度可比Fluo-3強(qiáng)一倍[12-13]。

鈣熒光強(qiáng)度的變化可用熒光顯微鏡、激光共聚焦掃描顯微鏡、雙光子顯微鏡等儀器檢測，從而定量研究胰腺腺泡鈣振蕩。直接法可受指示劑區(qū)域化、熒光衰減或光漂白、酯不完全水解、猝滅劑的干擾，以及細(xì)胞毒、細(xì)胞自身熒光干擾等因素的影響，測定時需加以注意并按需要選擇[12-13]。

2.2.2間接法 間接法即通過全細(xì)胞膜片鉗法記錄胞內(nèi)鈣激活的氯離子流變化。經(jīng)典的做法是在全細(xì)胞膜片鉗模式下將膜電位鉗制在-30 mV，往胞外液中加入胰腺腺泡細(xì)胞的受體激動劑ACh或CCK，此時所記錄到的全細(xì)胞電流主要為胞質(zhì)Ca2+濃度變化所激活的氯離子通道電流，可間接但實(shí)時地反映激動劑ACh或CCK所引起的胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩(圖2)[14]。

A和C是采用熒光成像法(fura-2)記錄的分別由ACh(A)和CCK(C)引起的胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩，B和D是采用全細(xì)胞膜片鉗法記錄的分別由ACh(B)和CCK(D)引起的胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩

圖2不同測定方法記錄的胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩

2.3胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的發(fā)生機(jī)制 從20世紀(jì)90年代至今，針對不同的細(xì)胞種類和興奮劑，人們從不同的角度提出了多種鈣振蕩模型，大致可概括為以下兩類[1]：①基于三磷酸肌醇(inositol-1,4,5-trisphosphate,IP3)代謝的模型，該模型假設(shè)胞質(zhì)IP3濃度的周期性波動引起鈣振蕩；②基于各種通道功能活動的模型，按涉及的通道不同又可分成三類：細(xì)胞膜電壓門控Ca2+通道依賴型、蘭尼堿受體依賴型和IP3受體依賴型。由于能影響鈣振蕩的因素多種多樣，目前尚未能找到一種理想的模型可以囊括已有的主要研究成果并對鈣振蕩的確切機(jī)制做出可檢驗(yàn)的多種預(yù)測。

在胰腺腺泡細(xì)胞中，IP3受體和蘭尼堿受體之間的相互作用有非常重要的生理學(xué)意義[1]。由ACh和CCK刺激引起的Ca2+振蕩也總是依賴于這兩種受體[2,15]。研究表明，CCK結(jié)合胞膜上的CCK1受體，而ACh結(jié)合胞膜上的M3受體(一種毒蕈堿型乙酰膽堿受體)[7]。CCK與CCK1受體結(jié)合后以某種方式激活A(yù)DP核糖環(huán)化酶，進(jìn)而形成兩種信號信使：煙酸腺苷二磷酸和環(huán)ADP核糖。這兩種信號信使可輪流激活胞內(nèi)鈣庫(即內(nèi)質(zhì)網(wǎng))上的蘭尼堿受體，從而釋放Ca2+，胞內(nèi)Ca2+水平因而升高。ACh則通過經(jīng)典的G蛋白(一種由α、β和γ三亞基組成的三聚體蛋白)通路來激活磷脂酶C，進(jìn)而形成IP3和二酰甘油，IP3再激活胞內(nèi)鈣庫上的IP3受體，從而釋放Ca2+[7]。另外，膽汁酸(如牛磺石膽酸)也可通過胞膜上的Gpbar1受體遵循與ACh類似的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路使胞內(nèi)IP3增多，從而升高胞內(nèi)Ca2+水平[2]。鈣庫釋放的鈣又可遵循鈣誘導(dǎo)鈣釋放的機(jī)制使鈣庫內(nèi)的鈣不斷減少，鈣庫內(nèi)鈣量減少的信息可被鈣庫膜上的感受蛋白間質(zhì)相互作用分子1(stromal interaction molecule 1，STIM1)所感知，之后STIM1可因此轉(zhuǎn)位到細(xì)胞膜上與膜上的鈣庫儲量依賴性鈣通道的亞基Orai結(jié)合，這樣胞外鈣可循此通道流入胞內(nèi)，并進(jìn)入鈣庫中使鈣庫再次充盈[2,7]。胞內(nèi)持續(xù)升高的Ca2+可被細(xì)胞膜上的鈣泵移出胞外或被鈣庫膜上的鈣泵重吸收回鈣庫中[2]。胞內(nèi)的線粒體在一定鈣水平的作用下則可通過氧化還原反應(yīng)產(chǎn)生足夠的能量(ATP)以滿足主動轉(zhuǎn)運(yùn)鈣的需要[2]。上述有關(guān)過程可能以目前尚未完全明確的方式交叉進(jìn)行，循環(huán)往復(fù)，從而形成胰腺腺泡細(xì)胞中規(guī)律性的振蕩(圖3)[2,7]。

ADP-ribosyl cyclase：ADP核糖環(huán)化酶;NAADP：煙酰胺腺苷二磷酸;cADPR：環(huán)ADP核糖;RyR：蘭尼堿受體;PLC:磷脂酶C;IP3：三磷酸肌醇;IP3R：三磷酸肌醇受體；TLC-S：牛磺石膽酸；SOC channels：鈣庫儲量依賴性鈣通道；PMCA：細(xì)胞膜上的鈣泵；SERCA：鈣庫膜上的鈣泵；Plasma Membrane：細(xì)胞膜，ER：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)；Mitochondrion：線粒體

圖3CCK和ACh引起胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的不同機(jī)制示意圖[2,7]

與可興奮細(xì)胞相比，胰腺腺泡細(xì)胞的跨膜化學(xué)和生物物理參數(shù)不太容易監(jiān)控，所以要完全明確鈣振蕩發(fā)生的機(jī)制仍有許多困難。因此，盡管鈣振蕩的機(jī)制已經(jīng)被廣泛地研究了20多年，但鈣振蕩產(chǎn)生的確切機(jī)制仍存在不少爭議[1]。

2.4胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的生理和“病理生理學(xué)”意義 生理情況下，不管是ACh還是CCK，都是通過引起胞內(nèi)產(chǎn)生鈣振蕩的方式來引起腺泡細(xì)胞分泌胰酶的。胞質(zhì)游離Ca2+作為胞內(nèi)第二信使，其濃度的周期性漲落必然引起它所介導(dǎo)的生物效應(yīng)，如分泌等過程呈周期性起伏。鈣振蕩過程中，Ca2+濃度的起伏波動既能有效地觸發(fā)相應(yīng)的生理效應(yīng)，同時又能防止胞內(nèi)Ca2+濃度長時間過度升高，以免損傷細(xì)胞自身，并維護(hù)了細(xì)胞對刺激的反應(yīng)性[16]。

ACh和CCK通過引起細(xì)胞頂端局部的胞質(zhì)鈣振蕩來控制細(xì)胞分泌[17]。在正常的分泌活動中，胰腺腺泡細(xì)胞中規(guī)律性的鈣振蕩通常只局限于分泌極[18-19]；而某些過度刺激因素如高濃度的乙醇代謝產(chǎn)物則可引起持續(xù)的全細(xì)胞Ca2+濃度升高，由此可引起異常的酶原激活、空泡形成以及細(xì)胞壞死，出現(xiàn)急性胰腺炎癥狀[2,20-21]。胰腺是人體的一個重要的分泌器官，胞內(nèi)Ca2+在胰腺刺激-分泌耦聯(lián)中的重要性已被公認(rèn)，但對于腺泡細(xì)胞分泌與其鈣振蕩之間的確切關(guān)系還需更深入的研究。

3 小 結(jié)

綜上所述，胰腺腺泡細(xì)胞的鈣振蕩與腺泡細(xì)胞的分泌功能密切相關(guān)，這類鈣振蕩不僅反映了正常胰腺腺泡細(xì)胞的功能，異常鈣振蕩可能還是某些胰腺疾病的產(chǎn)生機(jī)制(如急性胰腺炎)。因此，研究胞內(nèi)鈣振蕩的產(chǎn)生機(jī)制和調(diào)控具有重要的生理和病理生理學(xué)意義。到目前為止，人們采用直接法和間接法對鈣振蕩的特征和變化規(guī)律進(jìn)行了廣泛的研究，已經(jīng)有了很多認(rèn)識，但其確切的機(jī)制仍需進(jìn)一步闡明。把共聚焦/雙光子成像和多道膜片鉗技術(shù)結(jié)合起來，對鈣振蕩相關(guān)的多種指標(biāo)(包括鈣信號，細(xì)胞的不同區(qū)域、不同通道和受體的功能狀態(tài)，以及某些胞內(nèi)特殊成分的功能改變等信息)進(jìn)行同步實(shí)時的監(jiān)測和比較分析(目前還未見有這樣做的研究結(jié)果出現(xiàn)，但這樣做的技術(shù)條件已經(jīng)成熟)，對于更深入探討胰腺腺泡細(xì)胞鈣振蕩的發(fā)生機(jī)制將會有重要意義。

[1] Dupont G,Combettes L,Bird GS,etal.Calcium oscillations[J].Cold Spring Harb Perspect Biol,2011,3(3).

[2] Booth DM,Mukherjee R,Sutton R,etal.Calcium and reactive oxygen species in acute pancreatitis:friend or foe?[J].Antioxid Redox Signal,2011,15(10):2683-2698.

[3] Petersen OH,Burdakov D,Tepikin AV.Polarity in intracellular calcium signaling[J].Bioessays,1999,21(10):851-860.

[4] Park MK,Lee M,Petersen OH.Morphological and functional changes of dissociated single pancreatic acinar cells:testing the suitability of the single cell as a model for exocytosis and calcium signaling[J].Cell Calcium,2004,35(4):367-379.

[5] Petersen CC,Toescu EC,Petersen OH.Different patterns of receptor-activated cytoplasmic Ca2+oscillations in single pancreatic acinar cells:dependence on receptor type,agonist concentration and intracellular Ca2+buffering[J].EMBO J,1991,10(3):527-533.

[6] Toescu EC,Lawrie AM,Gallacher DV,etal.The pattern of agonist-evoked cytosolic Ca2+oscillations depends on the resting intracellular Ca2+concentration[J].J Biol Chem,1993,268(25):18654-18658.

[7] Petersen OH,Tepikin AV.Polarized calcium signaling in exocrine gland cells[J].Annu Rev Physiol,2008,70:273-299.

[8] Ito K,Miyashita Y,Kasai H.Kinetic control of multiple forms of Ca2+spikes by inositol trisphosphate in pancreatic acinar cells[J].J Cell Biol,1999,146(2):405-413.

[9] An YP,Xiao R,Cui H,etal.Selective activation by photodynamic action of cholecystokinin receptor in the freshly isolated rat pancreatic acini[J].Br J Pharmacol,2003,139(4):872-880.

[10] Fernández-Sánchez M,del Castillo-Vaquero A,Salido GM,etal.Ethanol exerts dual effects on calcium homeostasis in CCK-8-stimulated mouse pancreatic acinar cells[J].BMC Cell Biol,2009,10(1):77.

[11] González A,Schmid A,Sternfeld L,etal.Cholecystokinin-evoked Ca2+waves in isolated mouse pancreatic acinar cells are modulated by activation of cytosolic phospholipase A2,phospholipase D,and protein kinase C[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,261(3):726-733.

[12] Takahashi A,Camacho P,Lechleiter JD,etal.Measurement of intracellular calcium[J].Physiol Rev,1999,79(4):1089-1125.

[13] Spinelli KJ,Gillespie PG.Monitoring intracellular calcium ion dynamics in hair cell populations with Fluo-4 AM[J].PLoS One,2012,7(12):e51874.

[14] Wu J,Takeo T,Suga S,etal.2-aminoethoxydiphenyl borate inhibits agonist-induced Ca2+signals by blocking inositol trisphosphate formation in acutely dissociated mouse pancreatic acinar cells[J].Pflugers Arch,2004,448(6):592-595.

[15] Cancela JM,Gerasimenko OV,Gerasimenko JV,etal.Two different but converging messenger pathways to intracellular Ca2+release:the roles of nicotinic acid adenine dinucleotide phosphate,cyclic ADP-ribose and inositol trisphosphate[J].EMBO J,2000,19(11):2549-2557.

[16] 胡清華,王迪潯.鈣振蕩[J].生理科學(xué)進(jìn)展,1994,25(2):131-136.

[17] Petersen OH,Sutton R.Ca2+signalling and pancreatitis:effects of alcohol,bile and coffee[J].Trends Pharmacol Sci,2006,27(2):113-120.

[18] Criddle DN,Gerasimenko JV,Baumgartner HK,etal.Calcium signalling and pancreatic cell death:apoptosis or necrosis?[J].Cell Death Differ,2007,14(7):1285-1294.

[19] Petersen OH.Ca2+signalling and Ca2+-activated ion channels in exocrine acinar cells[J].Cell Calcium,2005,38(3/4):171-200.

[20] Criddle DN,Raraty MG,Neoptolemos JP,etal.Ethanol toxicity in pancreatic acinar cells:mediation by nonoxidative fatty acid metabolites[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2004,101(29):10738-10743.

[21] Kim JY,Kim KH,Lee JA,etal.Transporter-mediated bile acid uptake causes Ca2+-dependent cell death in rat pancreatic acinar cells[J].Gastroenterology,2002,122(7):1941-1953.