兩株紅樹內(nèi)生真菌共培養(yǎng)正丁醇萃取部位化學(xué)成分研究*

李春遠，黃 松，佘志剛，林永成，周世寧

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院生物材料研究所，廣東 廣州 510642；2. 中山大學(xué)化學(xué)與化學(xué)工程學(xué)院，廣東 廣州 510275；3. 中山大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510275)

海洋紅樹林微生物已成為尋找新藥先導(dǎo)化合物的重要資源[1]。內(nèi)生真菌K38和E33分別采集自我國湛江濕地紅樹植物秋茄葉片及麒麟菜枝干，兩者單獨發(fā)酵的粗提物基本不顯示抗菌活性，但共培養(yǎng)液萃取物對小麥赤霉等多種危害農(nóng)業(yè)和水果的病菌顯示出較強抗菌作用[2]。前期我們分別系統(tǒng)研究了兩株菌的代謝產(chǎn)物[3-7]，并對兩菌共培養(yǎng)液乙酸乙酯提取物進行了分離[8-13]。本文進一步開展了兩株菌共培養(yǎng)液正丁醇萃取物的研究，共分離鑒定了10種化合物，分別為環(huán)(L-苯丙-L-脯)二肽(1)，環(huán)(D-脯-L-苯丙)二肽(2)，環(huán)(L-苯丙-反-4-羥基-L-脯)二肽(3)，環(huán)(順-4-羥基-D-脯-L-苯丙)二肽(4)，環(huán)(L-脯-L-酪)二肽(5)，環(huán)(D-脯-L-酪)二肽(6), 環(huán)(D-脯-D-色)二肽(7)，木糖醇(8)，腺苷(9)，尿苷(10)，其中化合物6為首次從真菌中分離到，化合物2，6，7，8為首次從海洋真菌里獲得。

1 結(jié)果與討論

化合物1的1H NMRδ7.98 (1H, br s)，4.08 (1H, dd, 4.4, 8.0 Hz), 4.35(1H, t, 4.5 Hz)和13C NMRδ169.0, 165.2表明分子可能是環(huán)二肽類化合物，根據(jù)1H NMRδ7.19～7.27(5H, m)，3.27(1H, m ), 3.35(1H , m ), 4.35(1H, t, 4.5 Hz)推測分子含有苯丙氨酸殘基，由于1H NMR只顯示δ7.98 (1H, br s)一個酰胺質(zhì)子信號，結(jié)合δ1.41 (1H, m), 1.72 (2H, m), 2.01(1H, m), 3.05(1H , m ), 3.40 (1H, m), 4.08 (1H, dd, 4.4, 8.0 Hz)等信號判斷另一部分為脯氨酸殘基，在此基礎(chǔ)上查閱文獻[14]對照波譜數(shù)據(jù)及比旋光度數(shù)值基本一致，鑒定化合物1為環(huán)(L-苯丙-L-脯)二肽。

化合物2的ESIMS顯示其分子量與化合物1完全一致，兩者的1H NMR和13C NMR譜也類似，仔細對比二者核磁數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)與化合物1相比，化合物2的1H NMR中有一個δ4附近的峰發(fā)生顯著變化，轉(zhuǎn)移到了δ2.87附近，但結(jié)合其13C NMR譜和質(zhì)譜，容易判斷二者仍具有相同的平面結(jié)構(gòu)。進一步對比二者比旋光度，發(fā)現(xiàn)化合物2的比旋光度為+67°與化合物1顯著不同，表明化合物2是化合物1的旋光異構(gòu)體，在此基礎(chǔ)上與文獻[14]波譜數(shù)據(jù)和比旋光度數(shù)據(jù)對照基本一致，鑒定化合物2為環(huán)(D-脯-L-苯丙)二肽。

化合物3的核磁共振譜與化合物1類似，表明具有類似的分子結(jié)構(gòu)，其1H NMR在δ4附近有δ4.19(1H, m)，4.30(1H , q, 6.4 Hz), 4.40(1H , t, 4.4 Hz)三組峰，比化合物1多一個，同時δ5.12(1H, br s)出現(xiàn)一個活潑H信號, 結(jié)合13C NMR中δ67.2的峰，推測分子多了一個OH, 對比兩者ESIMS, 進一步確定化合物3是化合物1取代了一個羥基的衍生物，在此基礎(chǔ)上查閱文獻[15]，對照波譜數(shù)據(jù)及比旋光度數(shù)值基本一致，鑒定化合物3為環(huán)(L-苯丙-反-4-羥基-L-脯)二肽。

化合物4的核磁共振譜與化合物2類似，仔細對比化合物4和2的1H NMR，13C NMR及ESIMS, 發(fā)現(xiàn)化合物4比化合物2多取代了一個羥基，具有與化合物3相同的平面結(jié)構(gòu)，但化合物4與化合物3相比，1H NMR中有一個δ4附近的峰移到了高場δ2.91附近，推測是由于二者空間結(jié)構(gòu)不同引起的，進一步對比二者比旋光度，發(fā)現(xiàn)化合物4的比旋光度為+36°與化合物3的-7.0°顯著不同，表明化合物4化合物3的旋光異構(gòu)體，在此基礎(chǔ)上與文獻[16]波譜數(shù)據(jù)和比旋光度數(shù)據(jù)對照基本一致，鑒定化合物4為環(huán)(順-4-羥基-D-脯-L-苯丙)二肽。

化合物5的核磁共振譜尤其是碳譜與化合物1類似，其質(zhì)譜分子離子峰m/z283.1[M+Na]+, 261.1[M+ H]+1比化合物1多16，同時1H NMR 的δ6.72(2H，d，8.0 Hz)，7.05 (2H，d，8.0 Hz)及13C NMR中δ155.7的信號(與化合物1相應(yīng)信號相比移動到低場)表明化合物5是化合物1中的苯丙氨酸殘基替換為了酪氨酸殘基的類似物。在此基礎(chǔ)上查閱文獻[17]，對照波譜數(shù)據(jù)及比旋光度基本一致，鑒定化合物5為環(huán)(L-脯-L-酪)二肽。

化合物6ESIMS顯示其相對分子質(zhì)量與化合物5一致，其1H NMR和13C NMR譜表明分子平面結(jié)構(gòu)也是由酪氨酸和脯氨酸組成的環(huán)二肽。對比二者比旋光度，發(fā)現(xiàn)化合物6的比旋光度為-36.8°與化合物5顯著不同，表明化合物6化合物5的旋光異構(gòu)體，進一步與文獻[18]波譜數(shù)據(jù)和比旋光度數(shù)據(jù)對照基本一致，鑒定化合物6為環(huán)(D-脯-L-酪)二肽。

化合物7的1H NMRδ8.20 (1H, br s)和13C NMRδ169.4, 165.6表明分子同樣是環(huán)二肽類化合物，1H NMRδ5.70(1H, br s), 7.12(1H, d, 2.0 Hz), 7.17(1H, t , 7.4 Hz), 7.28(1H, t, 6.8 Hz), 7.40(1H, d, 8.2 Hz), 7.63(1H, d, 8.2 Hz)表明分子中可能含有吲哚環(huán)，由此推測其中之一的氨基酸殘基可能是色氨酸，進一步與化合物1,2,3,4,5的核磁共振數(shù)據(jù)對比，確認另一部分氨基酸殘基仍然由脯氨酸構(gòu)成，在此基礎(chǔ)上查閱文獻[19]對照波譜數(shù)據(jù)和比旋光度數(shù)值基本一致，鑒定化合物7為環(huán)(D-脯-D-色)二肽。

化合物8的1H NMR僅在δ4.57～3.36之間有信號，表明可能是糖類或多羥基類化合物，13C NMR僅有δ63.4, 73.1, 73.2三個信號，推測具有對稱結(jié)構(gòu)。進一步經(jīng)與文獻波譜數(shù)據(jù)比較[20] , 鑒定此化合物為木糖醇(xylitol) 。

化合物9，10與實驗室標準品對照核磁共振譜及硅膠薄層Rf值基本一致，分別鑒定為腺苷和尿苷。

2 實驗部分

2.1 試劑與實驗儀器

葡萄糖(CP) 、蛋白胨、酵母膏(BR) 、乙酸乙酯(AR)、石油醚(AR)、正丁醇(AR)等為市售。結(jié)構(gòu)測定儀器：Bruker AVⅢ400 MHz核磁共振儀，LCQ-DECA-XP (Thermo，USA)質(zhì)譜儀, Horiba SEPA-300旋光儀。

2.2 菌種及細胞

真菌E33和K38分別為南海紅樹林麒麟菜和秋茄內(nèi)分離出的真菌，種屬未定，保藏在中山大學(xué)化學(xué)學(xué)院和生命科學(xué)學(xué)院。

2.3 菌種發(fā)酵培養(yǎng)

同時將兩株菌等量接種在培養(yǎng)培養(yǎng)基中，菌種發(fā)酵培養(yǎng)基的配比及發(fā)酵方法同文獻[2]，共培養(yǎng)120 L。

2.4 分離

發(fā)酵液過濾, 濾液在50 ℃下濃縮到5 L , 乙酸乙酯萃取二次, 然后用正丁醇萃取二次，合并濃縮正丁醇提取液得提取物85 g。提取物經(jīng)正相硅膠柱層析，以石油醚-乙酸乙酯-甲醇梯度淋洗分段，再經(jīng)反相硅膠反復(fù)柱層析, 反相高效制備液相色譜和重結(jié)晶純化后得到化合物1(6 mg)，2(2 mg)，3(5 mg)，4(2 mg)，5(10 mg)，6(4 mg)，7(3 mg)，8(15 mg)，9(20 mg)，10(15 mg)。

2.5 化合物的物理和波譜數(shù)據(jù)

化合物5: C14H16N2O3, 黃色粉末，[α]D-57.5°(c0.5，MeOH)。MS (ESI pos)m/z: 283.1[M+Na]+, 261.1[M+ H]+。1H NMR (400 MHz, CD3OD)δ：1.23 (1H, m)，1.81(2H, m)，2.10 (1H, m)，3.08 (2H, dd, 12.0, 4.0 Hz)，3.59 (2H, m)，4.06 (1H, m)，4.38 (1H, dd, 12.0, 4.0 Hz)，6.72(2H, d, 8.0 Hz)，7.05 (2H, d, 8.0 Hz)。13C NMR (100 MHz, CD3OD)δ:169.6, 165.1, 155.7, 130.3, 126.9, 116.2, 59.1, 56.2, 45.5, 36.0, 28.3, 22.5。

化合物6: C14H16N2O3, 黃色粉末，[α]D-36.8°(c1.0，MeOH)。MS (ESI pos)m/z: 283.1[M+Na]+, 261.1[M+H]+。1H NMR(400 MHz, C3D6O)δ：1.70(1H, m), 1.87(1H, m), 2.15(1H, m), 2.93(1H, dd, 7.1, 14.4 Hz), 3.23(1H, dd, 4.4, 14.3 Hz), 3.39(1H, m), 3.55(1H, m), 4.12(1H, m), 4.31(1H, t, 5.6 Hz), 6.53(1H, br s), 6.77(2H, d, 8.4 Hz), 7.16(2H, d, 8.4 Hz), 8.26(1H, br s)。13C NMR(100 MHz, C3D6O)δ：168.9, 165.1, 156.3, 130.7, 127.6, 115.2, 58.7, 56.3, 44.7, 35.4, 28.1, 22.0。

化合物7: C16H17N3O2, 黃色粉末，[α]D-23.5°(c1.0，MeOH)。1H NMR (400 MHz, CDCl3)δ：1.94(1H, m), 2.01(1H, m), 2.05(1H, m), 2.37(1H, m), 3.01(1H, dd, 10.9,15.1Hz), 3.62(1H, m), 3.69(1H, m), 3.79(1H, dd, 4.1,15.2 Hz ), 4.10(1H, t, 7.5 Hz), 4.40(1H, dd, 3.0, 11.1 Hz), 5.70(1H, br s), 7.12(1H, d, 2.0 Hz), 7.17(1H, t, 7.4 Hz), 7.28(1H, t, 6.8 Hz), 7.40(1H, d, 8.2 Hz), 7.63(1H, d, 8.2 Hz), 8.20 (1H, br s)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δ：169.4, 165.6, 136.7, 126.7, 123.3, 122.8, 120.0, 118.5, 111.6, 110.0, 59.2, 54.5, 45.4, 28.3, 26.8, 22.6。

化合物8: C5H12O5, 白色固體。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ：4.55(2H, d, 4.6 Hz), 4.49(1H, d 5.4 Hz), 4.33(2H, t,5.4 Hz), 3.50(4H, m), 3.33(3H, m)。13C NMR(100 MHz, DMSO-d6)δ：63.4, 72.7, 73.0。

化合物9: C10H13N5O4，白色固體。FAB-MSm/z(%): 268 [M+H]+；1H NMR (400 MHz, DMSO-d6)δ：3.56(1H, dd, 7, 12 Hz), 3.68(1H, dd, 3.5, 12 Hz), 3.98(1H, dd, 3.5, 7.0 Hz), 4.15(1H, dd,J=3.0, 5.0 Hz), 4.60(1H, t, 6.0 Hz), 5.15(1H,s), 5.41(1H, s), 5.42(1H,s), 5.88(1H, d, 6.0 Hz), 7.30(2H, s), 8.14(1H, s), 8.33(1H, s)。13C NMR (100 MHz, DMSO-d6)δ：156.1, 152.3, 149.0, 139.9, 119.4, 87.9, 85.9, 73.4, 70.6, 61.7。

化合物10: C9H12N2O6,白色針狀晶體，θmp:170～171℃。1H NMR(400 MHz, DMSO-d6)δ11.16(1H, brs), 7.84(1H, d, 8.0 Hz), 5.77(1H, d, 5.0 Hz), 5.61(1H, d, 8.0 Hz), 5.20(1H, d, 5.5 Hz), 4.94(1H, t, 5.5 Hz), 4.03(1H, dd, 5.5, 5.0 Hz), 4.92(1H, d, 5.5 Hz), 3.97(1H, dd, 5.5, 5.0 Hz), 3.84(1H, dd, 3.5, 3.5 Hz), 3.59(2H, m)。

致謝：本文的核磁共振譜，質(zhì)譜等波譜測試均在美國密西西比大學(xué)藥學(xué)院&美國國家天然產(chǎn)物研究中心完成。

[1] 林永成. 海洋微生物及其代謝產(chǎn)物[M]. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2003.

[2] 丁唯嘉，張杰，黎榮棠，等. 兩株紅樹內(nèi)生真菌混合發(fā)酵液提取物抗植物病原菌活性及LC-MS 研究[J]. 廣東化工，2010，37(12): 7-9.

[3] 李春遠, 楊瑞云, 林永成, 等. 海洋真菌K38號代謝產(chǎn)物的研究[J]. 中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2007, 46(1): 67-70.

[4] LI C Y, YANG R Y, LIN Y C, et al. A new nonadride derivative from mangrove fungus (strain No. k38). Journal of Asian Natural Products Research[J]，2007, 9(3)：285-291.

[5] 李春遠，佘志剛，林永成，等，紅樹林真菌E33代謝產(chǎn)物的分離及衍生物的制備[J]. 中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版，2007，46(6): 52-54.

[6] LI C Y, DING W J, SHE Z G, et al. A new biphenyl derivative from an unidentified marine fungus E33[J]. Chemistry of Natural Compounds, 2008, 44(2) :128-129.

[7] 李春遠，丁唯嘉，陳敏，等，來自紅樹林內(nèi)生真菌E33中的一個新的水楊酸衍生物[J]. 中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2008, 47(1):121-122.

[8] LI C Y, DING W J, SHAO C L, et al. A new diimide derivative from the co-culture broth of two mangrove fungi (strain no. E33 and K38)[J]. Journal of Asian Natural Products Research, 2010,12(9): 809-813.

[9] 李春遠，佘志剛，林永成，等.紅樹林內(nèi)生真菌K38和E33混合發(fā)酵代謝產(chǎn)物研究[J].中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2010,49(6): 136-138,144.

[10] LI C Y, ZHANG J, SHAO C L, et al. A new xanthone derivative from the co-culture broth of two marine fungi (Strain No. E33 and K38) [J]. Chemistry of Natural Compounds, 2011, 47(3): 382-384.

[11] 李春遠，張杰，鐘嘉升，等. 兩株紅樹內(nèi)生真菌混合發(fā)酵培養(yǎng)液中代謝產(chǎn)物的分離鑒定[J]. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2011，32(1): 117-119,123.

[12] 丁唯嘉， 黎榮棠，李春遠，等. 兩株紅樹林真菌共培養(yǎng)液抗植物病菌成分研究[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué), 2011, 38(9): 72-74,77.

[13] 李春遠，龔兵，黃素萍，等. 紅樹林內(nèi)生真菌K38 和E33 共培養(yǎng)代謝產(chǎn)物研究[J].中山大學(xué)學(xué)報:自然科學(xué)版, 2013,52(2): 66-69.

[14] WANG G H, DAI S K, CHEN M J, et al. Two diketopiperazine cyclo(pro-phe) isomers from marine bacteriaBacillussubtilissp. 13-2 [J]. Chemistry of Natural Compounds, 2010, 46(4): 583-585.

[15] ADAMCZEKI M, QUINOA E, CREWS P. Novel sponge-derived amino acids. 5. structures, stereochemistry, and synthesis of several new heterocycles[J]. Journal of the American chemical society, 1989, 112(2): 647-654.

[16] SHIGEMORI H, TENMA M, SHIMAZAKI K, et al. Three new metabolites from the marine yeastAureobasidiumpullulans[J]. Journal of natural products, 1998, 61(5): 696-698.

[17] 唐麗丹，梁遠維，廖小建，等. 海綿Phakelliafusca真菌稻黑孢菌PF18的次級代謝產(chǎn)物研究[J]. 中藥材, 2011，34(12): 1877-1879.

[18] 石妞妞, 徐俊, 沈月毛. 從假單胞菌1896 中分離到的5個環(huán)二肽類化合物[J]. 廈門大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2011, 50(3) : 637-640.

[19] LI X, DOBRETSOV S, XU Y, et al. Antifouling diketopiperazines produced by a deep-sea bacterium,Streptomycesfungicidicus[ J]. Biofouling, 2006, 22(3/4): 201-208.

[20] 梁之桃, 秦民堅，王崢濤. 竹葉柴胡化學(xué)成分的研究[J]. 中國藥科大學(xué)學(xué)報，2003, 34(4) : 305-308.