川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)關(guān)鍵影響因素研究

張翠葉，辛福梅，楊小林，洛桑曲杰

(1 西藏自治區(qū)林業(yè)調(diào)查規(guī)劃研究院，西藏 拉薩 850000；2 西藏大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西藏 林芝 860000)

體細(xì)胞胚胎發(fā)生是指在離體條件下使植物體細(xì)胞通過與合子胚類似的發(fā)育途徑形成新個體的過程。相對于器官發(fā)生而言，體細(xì)胞胚胎發(fā)生具有數(shù)量多、速度快、結(jié)構(gòu)完整、再生率高等優(yōu)點(diǎn)。體細(xì)胞胚胎發(fā)生為植物細(xì)胞分化、全能性表達(dá)提供了理想的試驗(yàn)體系，在林木人工種子育苗、瀕危植物挽救等方面具有重要意義[1]。櫟屬植物是林木體細(xì)胞胚胎發(fā)生的研究熱點(diǎn)之一。目前研究涉及的主要樹種有十余種，研究較多的有歐洲栓皮櫟(Quercussuber)[2-3]、夏櫟(Quercusrobur)[4]、麻櫟(Quercusacutissima)[5-6]、栓皮櫟(Quercusvariabilis)[7]等，已在研究材料、培養(yǎng)技術(shù)等方面取得較大成功。

川滇高山櫟(Quercusaquifolioides)作為西藏東南部、四川西部、云南西北部的特有樹種，主要分布范圍為海拔2 400～3 400 m，喬木高達(dá)30 m，但在干旱陽坡或遭受經(jīng)常樵采后則退變成灌木叢林[8]。該樹種適應(yīng)性好，具有較強(qiáng)的抗環(huán)境干擾能力和旺盛的萌蘗能力以及優(yōu)良的水土保持和水源涵養(yǎng)作用，是當(dāng)?shù)刂匾脑炝謽浞N。同時也具有較高的經(jīng)濟(jì)價值，其木材堅(jiān)硬，樹皮和堅(jiān)果含單寧，可用于鞣制皮革、護(hù)膚、入藥等，亦可作為生物能源和為食用菌生產(chǎn)提供原料。因川滇高山櫟種子易受種實(shí)害蟲侵害且不耐儲藏，并且嫁接、扦插困難，目前主要依靠天然更新。前人對川滇高山櫟的研究主要集中在形態(tài)結(jié)構(gòu)、生理特征、生長特點(diǎn)、生物量、種群群落生態(tài)學(xué)等方面[9-15]，尚未見有關(guān)其體胚發(fā)生及組織培養(yǎng)方面的報道。為此，本研究以川滇高山櫟未成熟合子胚為材料，研究基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑配比、采樣時期、培養(yǎng)條件、抗氧化劑等因素對川滇高山櫟胚性細(xì)胞誘導(dǎo)的影響，以期為川滇高山櫟優(yōu)良無性系繁殖、基因保存、遺傳改良等奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

分別于2011-06-10、07-10、08-10、09-10從西藏林芝地區(qū)八一鎮(zhèn)覺木溝川滇高山櫟天然林的同一林分中采樣，每次固定從胸徑相當(dāng)、彼此相距30 m左右的10棵樹上，將前一年開花授粉所結(jié)的小堅(jiān)果連同殼斗一起采下，用塑料袋分裝帶回實(shí)驗(yàn)室，保存于4 ℃的冰箱內(nèi)備用。

1.2 川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)試驗(yàn)方法

1.2.1 外植體的消毒 接種前剝?nèi)ゴǖ岣呱綑禋ざ啡〕鐾暾?jiān)果，先用自來水沖洗2～3 h，再用體積分?jǐn)?shù)70%酒精消毒30 s，接著在1 g/L氯化汞溶液中消毒15～20 min，最后用無菌水沖洗3～5次。無菌條件下用解剖刀剝?nèi)ス?，取出種子，再剝?nèi)シN皮后，胚根向下將全胚接種于培養(yǎng)基上。

1.2.2 基本培養(yǎng)基的篩選 以MS、1/2MS、B5和WPM為基本培養(yǎng)基，同時添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，以單因素對比試驗(yàn)篩選確定川滇高山櫟胚性愈傷組織形成的最適基本培養(yǎng)基。

1.2.3 植物生長調(diào)節(jié)劑配比的篩選 以MS為基本培養(yǎng)基，設(shè)單獨(dú)添加0，1，2，4 mg/L 6-BA和0，0.5，1.0 mg/L 2,4-D的處理以及二者按上述質(zhì)量濃度兩兩配比的處理,觀察川滇高山櫟胚性愈傷組織的生長情況，以確定其最佳植物生長調(diào)節(jié)劑配比。

1.2.4 采樣時期的篩選 將2011-06-10、07-10、08-10、09-10采集的來自于同一母樹的川滇高山櫟未成熟合子胚，接種于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)觀察，以確定其最佳采樣時期。

1.2.5 培養(yǎng)條件的篩選 以MS為基本培養(yǎng)基，同時添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，接種川滇高山櫟未成熟合子胚進(jìn)行光暗培養(yǎng)條件的篩選。其中光照培養(yǎng)時光照周期為12 h/d、光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx；暗培養(yǎng)時無光照，在培養(yǎng)瓶上覆黑布。觀察光暗培養(yǎng)條件下胚性愈傷組織的生長情況。

1.2.6 抗氧化劑對褐變的抑制 所用培養(yǎng)基為MS+2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D，另附加0，0.5，1.0 g/L聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，以確定PVP最佳質(zhì)量濃度。統(tǒng)計(jì)的褐變指標(biāo)包括培養(yǎng)基中的褐變發(fā)生級別、褐變發(fā)生半徑和褐變發(fā)生高度。褐變發(fā)生級別根據(jù)褐色的深淺，劃分為無或很淺、中、深3級，分別用1、2、3表示；褐變發(fā)生半徑為褐色區(qū)域的半徑；褐變發(fā)生高度為褐色區(qū)域的豎直高度。

以上各項(xiàng)試驗(yàn)的所有處理均附加30 g/L蔗糖，4.5 g/L瓊脂，pH值5.8，培養(yǎng)溫度(25±2) ℃。除培養(yǎng)條件篩選試驗(yàn)的暗培養(yǎng)處理外，其余處理為防止褐變，均于接種后先暗培養(yǎng)3 d，然后置于光照周期12 h/d、光照強(qiáng)度1 000～2 000 lx的條件下培養(yǎng)。所有處理均接種10瓶，每瓶3個外植體，重復(fù)3次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel和SPSS13.0軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

由表1可知，將川滇高山櫟未成熟胚分別接種于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D的MS、1/2MS、B5和WPM培養(yǎng)基上，所有基本培養(yǎng)基上均有胚性愈傷組織及體胚產(chǎn)生。其中MS基本培養(yǎng)基在接種5 d后即能夠產(chǎn)生乳白色體胚和愈傷組織(圖1-A、B)，體胚誘導(dǎo)率明顯較其他處理高；1/2 MS、B5和WPM培養(yǎng)基上產(chǎn)生的體胚個數(shù)較少，愈傷組織的量也較少，且顏色偏黃；另外，所有處理均有較嚴(yán)重的褐變現(xiàn)象發(fā)生。由表1還可知，光培養(yǎng)和暗培養(yǎng)2種培養(yǎng)條件下，川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)率有較明顯變化，光培養(yǎng)條件下的誘導(dǎo)率較高，但褐變也較重，而暗培養(yǎng)時褐變較輕；與光培養(yǎng)條件相比，除B5外，其余基本培養(yǎng)基在暗培養(yǎng)條件下的體胚誘導(dǎo)率均顯著降低。

表 1 基本培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

圖1 川滇高山櫟體胚的發(fā)生過程

2.2 植物生長調(diào)節(jié)劑配比對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度的2,4-D、6-BA及二者的組合，研究各處理對川滇高山櫟胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果見表2。從表2可以看出，不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基也能誘導(dǎo)出愈傷組織，但誘導(dǎo)率較低，添加植物生長調(diào)節(jié)劑則可提高川滇高山櫟未成熟胚的誘導(dǎo)率。培養(yǎng)基中只添加6-BA時，不同質(zhì)量濃度6-BA所對應(yīng)的誘導(dǎo)率存在差異，其中當(dāng)6-BA質(zhì)量濃度為1 mg/L時，誘導(dǎo)率為36.7%，且愈傷組織量較多。培養(yǎng)基中只添加不同質(zhì)量濃度的2,4-D時，所對應(yīng)的誘導(dǎo)率差異明顯，其中2,4-D質(zhì)量濃度為1.0 mg/L時，誘導(dǎo)率為36.7%。 6-BA與2,4-D配合使用時，未成熟胚的誘導(dǎo)率較高，愈傷組織量也相應(yīng)增加，誘導(dǎo)過程中原胚經(jīng)歷了球形期、心形期、魚雷期和子葉期等發(fā)育時期(圖1-C、D、E、F)；當(dāng)1 mg/L 6-BA 與0.5 mg/L 2,4-D配合使用時，誘導(dǎo)效果顯著提高，誘導(dǎo)率高達(dá)83.3%，且愈傷組織量最多。值得注意的是，所有植物生長調(diào)節(jié)劑處理的褐變率均較高。

表 2 2,4-D與6-BA不同質(zhì)量濃度配比對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

2.3 采樣時期對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

將不同時期采集于同一母樹的川滇高山櫟未成熟合子胚統(tǒng)一接種于添加2.0 mg/L 6-BA+0.2 mg/L 2,4-D的MS培養(yǎng)基中，研究采樣時期對川滇高山櫟胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響，結(jié)果見圖2。從圖2可以看出，川滇高山櫟未成熟合子胚的采樣時期對胚性愈傷組織誘導(dǎo)的影響較大，以08-10采集的合子胚愈傷組織誘導(dǎo)率較其他采樣時期高，可產(chǎn)生大量白色透明或半透明的顆粒狀愈傷組織；06-10采集的合子胚初代培養(yǎng)20 d后出現(xiàn)少量胚性愈傷組織；07-10、08-10采集的合子胚在接種5 d后即有顆粒狀愈傷組織形成，15 d后大量發(fā)生，08-10采集的合子胚褐變率較07-10的低；09-10采集的合子胚褐變率明顯增加，且愈傷組織誘導(dǎo)率急劇降低。

圖2 采樣時期對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)的影響

2.4 PVP對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)中褐變的抑制作用

褐變在川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)中發(fā)生較嚴(yán)重，為尋找有效減輕褐變的措施，在培養(yǎng)基中添加了不同質(zhì)量濃度的抗氧化劑PVP，觀察其對褐變的抑制作用。由表3可知，不同質(zhì)量濃度PVP對控制褐變具有一定作用，在本試驗(yàn)過程中，PVP質(zhì)量濃度越高抑制效果越好，當(dāng)PVP為1.0 g/L時，所有褐變發(fā)生指標(biāo)均明顯降低；同時隨著褐變減輕，產(chǎn)生的愈傷組織量有所增加。

表 3 PVP對川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)中褐變的抑制作用

3 討 論

本研究結(jié)果表明，基本培養(yǎng)基、植物生長調(diào)節(jié)劑配比、采樣時期、培養(yǎng)條件等均會對川滇高山櫟體胚發(fā)生產(chǎn)生影響。櫟屬植物體胚誘導(dǎo)大多以MS或WPM為基本培養(yǎng)基[16-17]，本試驗(yàn)采用的4種基本培養(yǎng)基中，MS較其他培養(yǎng)基更有利于川滇高山櫟體胚的發(fā)生，可見，無機(jī)鹽含量高、微量元素齊全的MS培養(yǎng)基，除對栓皮櫟外[18]，對川滇高山櫟幼胚的體胚發(fā)生也是有利的。

櫟屬植物體胚誘導(dǎo)時，植物生長調(diào)節(jié)劑以細(xì)胞分裂素和生長素為主，一般兩者配合使用，生長素與細(xì)胞分裂素在植物體胚誘導(dǎo)中起著決定性作用[19-21]。降低或去掉生長素能提高體胚發(fā)生的誘導(dǎo)效果[22]。以川滇高山櫟未成熟合子胚為外植體誘導(dǎo)體胚發(fā)生時，不同配比的6-BA和2，4-D均能誘導(dǎo)體胚發(fā)生，但誘導(dǎo)效果存在較大差異，本試驗(yàn)中以1 mg/L 6-BA+0.5 mg/L 2,4-D的配比誘導(dǎo)效果較好。不同發(fā)育時期的未成熟合子胚因其分化程度存在差異，誘導(dǎo)率也各不相同，生長在西藏林芝地區(qū)八一鎮(zhèn)的川滇高山櫟以08-10左右采集的未成熟合子胚誘導(dǎo)率較高。

光照在體胚發(fā)生中具有較為重要的作用。櫟屬植物不同種在體胚發(fā)生中對光照的要求有較大差異，如夏櫟(Q.robur)的合子胚在暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)率較高[23]，麻櫟(Q.acutissima)和歐洲栓皮櫟(Q.suber)的合子胚則在每天16 h光照條件下培養(yǎng)體胚的誘導(dǎo)率較高[24-25]，而紅櫟(Q.rubra)在持續(xù)光照條件下具有較高的體胚誘導(dǎo)率[26]。本研究中，川滇高山櫟未成熟合子胚在光照和暗培養(yǎng)條件下均能誘導(dǎo)體胚發(fā)生，但光照條件下誘導(dǎo)率較高。

木本植物組織培養(yǎng)過程中褐化現(xiàn)象嚴(yán)重，材料中總酚含量與褐化程度呈正相關(guān)，這類褐色物質(zhì)在培養(yǎng)基中不斷擴(kuò)散，抑制其他酶的活性，毒害培養(yǎng)材料，甚至導(dǎo)致其死亡，嚴(yán)重影響組織的生長。本研究在培養(yǎng)基中添加抗氧化劑PVP能減緩褐化、促進(jìn)組織生長；另在操作過程中應(yīng)盡量減少機(jī)械損傷，以防止褐變。

本研究以川滇高山櫟未成熟合子胚為外植體，初步建立了川滇高山櫟體胚誘導(dǎo)體系，但要真正實(shí)現(xiàn)從體胚誘導(dǎo)、體胚增殖、體胚成熟、體胚萌發(fā)以及最終的試管苗的移栽，仍有許多工作需要進(jìn)一步研究完善。

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