曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的建立

趙繼鵬，楊淑慎

(西北農(nóng)林科技大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，陜西 楊凌 712100)

紫杉醇(Taxol)是存在于紅豆杉科紅豆杉屬植物中的一種四環(huán)二萜酰胺類化合物，經(jīng)臨床證明，其對(duì)治療卵巢癌、肺癌等多種癌癥有特效，市場(chǎng)需求量日益增加[1]。但由于其藥源植物紅豆杉生長緩慢，且紫杉醇含量極低(0.01%～0.02%)，無法滿足市場(chǎng)需求[2]。

曼地亞紅豆杉(Taxusmedia)是東北紅豆杉與歐洲紅豆杉的天然雜交品種。該植物枝葉茂盛，生長速度快，對(duì)環(huán)境適應(yīng)能力強(qiáng)，能在多種氣候和土壤條件下生長，且樹皮和枝葉中均含有紫杉醇(0.04%左右)，因此成為提取紫杉醇的最佳原料[3]。

目前, 紫杉醇的生產(chǎn)途徑主要有:從樹皮中提取、化學(xué)合成、真菌生產(chǎn)和植物細(xì)胞培養(yǎng)等。其中細(xì)胞培養(yǎng)具有原料豐富、大規(guī)模反應(yīng)較易實(shí)現(xiàn)等優(yōu)點(diǎn)，因此成為工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇的最佳途徑[4]。本研究以曼地亞紅豆杉愈傷組織為材料，以愈傷組織接種量、蔗糖質(zhì)量濃度、激素類型及配比和防褐化試劑為考察因素，通過單因素試驗(yàn)或正交試驗(yàn)，對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為大規(guī)模培養(yǎng)紅豆杉細(xì)胞、擴(kuò)大紫杉醇生產(chǎn)量奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材 料

試驗(yàn)材料為曼地亞紅豆杉愈傷組織：從西北農(nóng)林科技大學(xué)博覽園中栽培的7年生曼地亞紅豆杉采集幼莖，在西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞工程實(shí)驗(yàn)室中，經(jīng)過5次以上繼代生長獲得。

1.2 曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響條件

1.2.1 愈傷組織接種量對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響 以蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L且不含激素的液體B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，每個(gè)50 mL錐形瓶中加入12.5 mL液體B5培養(yǎng)基，愈傷組織接種量設(shè)置0.06，0.08，0.10，0.12，0.14 g/mL 5個(gè)水平，培養(yǎng)15 d后，測(cè)定細(xì)胞的生物量與褐化程度。每樣品設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，研究愈傷組織接種量對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響。

1.2.2 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響 以不含激素的液體B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，設(shè)置20，25，30，35，40 g/L 5個(gè)不同蔗糖質(zhì)量濃度，愈傷組織接種量為1.25 g/瓶，培養(yǎng)15 d后，測(cè)定細(xì)胞的生物量。每樣品設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)，研究蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響。

1.2.3 激素類型及配比對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響 以蔗糖質(zhì)量濃度為30 g/L的液體B5培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，愈傷組織接種量為1.25 g/瓶，選擇2,4-D、NAA、KT 3種激素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，激素單因素試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)為：2,4-D (0,0.1,0.3,0.5,0.7,0.9 mg/L)，NAA(0,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0 mg/L)，KT (0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5 mg/L)。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)(表1)，培養(yǎng)15 d后,根據(jù)細(xì)胞的生物量與褐化程度確定激素的最優(yōu)組合，每樣品設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。

表 1 激素配比對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響的L9(34)正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)

1.2.4 防褐化試劑對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響 以B5+2,4-D 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+蔗糖30 g/L為基本培養(yǎng)基，愈傷組織接種量為1.25 g/瓶，選取檸檬酸、PVP和水解乳蛋白3種防褐化試劑進(jìn)行單因素試驗(yàn)，防褐化試劑單因素試驗(yàn)水平設(shè)計(jì)為：檸檬酸 (0(對(duì)照CK),100,200,300,400,500 mg/L)，PVP (0(對(duì)照CK),100,300,500,700,900 mg/L)，水解乳蛋白 (0(對(duì)照CK),100,300,500,700,900 mg/L)。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行三因素三水平正交試驗(yàn)(表2)，研究3種防褐化試劑對(duì)細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響，以獲得最佳的防褐化試劑組合，每樣品設(shè)3個(gè)平行試驗(yàn)。

表 2 3種防褐化試劑對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響的L9(34)正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)

1.3 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.3.1 愈傷組織的指標(biāo)測(cè)定 (1)褐化程度的測(cè)定。 觀察愈傷組織的顏色，將其褐化程度分為4個(gè)等級(jí)[5]。1級(jí)：表示沒有褐化；2級(jí)：表示輕微褐化；3級(jí)：表示褐化嚴(yán)重；4級(jí)：表示褐化很嚴(yán)重。(2)細(xì)胞鮮質(zhì)量的測(cè)定。 曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞5 000 r/min離心10 min,去掉上清液，沉淀物用濾紙吸干剩余水分，然后稱其鮮質(zhì)量。(3)愈傷組織增殖指標(biāo)。 增質(zhì)量(g)=每瓶懸浮細(xì)胞鮮質(zhì)量-愈傷組織接種量；增殖倍數(shù)=增質(zhì)量/接種量；比鮮質(zhì)量增長率(d-1)=增質(zhì)量/愈傷組織接種量×培養(yǎng)時(shí)間[6]。

1.3.2 紫杉醇含量的測(cè)定 將1.3.1中離心獲得的細(xì)胞在40 ℃條件下烘干至恒質(zhì)量，研磨，稱取0.1 g細(xì)胞干樣置于試管中，加入乙酸乙酯-丙酮(體積比為1∶1)10.0 mL，浸提24 h，超聲處理20 min后過濾，將濾液于40 ℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至浸膏狀，再用二氯甲烷-水(體積比為1∶1) 10.0 mL進(jìn)行2次萃取，取有機(jī)相，水相中則再加入等體積的二氯甲烷萃取，合并有機(jī)相，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40 ℃下濃縮至干燥，用甲醇10.0 mL定容[7-10]。采用文獻(xiàn)[8]中的方法進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)紫杉醇含量的測(cè)定。

1.4 曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系的驗(yàn)證

以B5+2,4-D 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L+檸檬酸220 mg/L+PVP 350 mg/L+水解乳蛋白450 mg/L +蔗糖30 g/L為培養(yǎng)基，愈傷組織接種量為1.25 g/瓶，在每個(gè)50 mL培養(yǎng)瓶中裝12.5 mL液體B5培養(yǎng)基(均已高壓滅菌，滅菌前pH=5.8)，在培養(yǎng)箱中110 r/min、25 ℃黑暗振蕩培養(yǎng)。從培養(yǎng)的第1天起到第31天，每隔3 d取1次樣，3次重復(fù)。根據(jù)細(xì)胞鮮質(zhì)量計(jì)算細(xì)胞的增殖倍數(shù)，繪制生長曲線；根據(jù)細(xì)胞內(nèi)的紫杉醇含量繪制紫杉醇含量變化曲線。

2 結(jié)果與分析

2.1 愈傷組織接種量對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響

2.1.1 對(duì)懸浮細(xì)胞生長的影響 愈傷組織接種量對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響見圖1。由圖1可以看出，在愈傷組織接種量低于0.08 g/mL 時(shí)，曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長緩慢，當(dāng)接種量為0.10 g/mL時(shí)，細(xì)胞的比鮮質(zhì)量增長率達(dá)到最大，統(tǒng)計(jì)分析表明達(dá)差異顯著水平(P<0.05)。說明細(xì)胞密度需積累到一定程度才有利于細(xì)胞懸浮生長，接種量稍大或稍小均不利于細(xì)胞生長。

圖1 愈傷組織接種量對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響

2.1.2 對(duì)懸浮細(xì)胞褐化的影響 由表3和圖2可以看出，曼地亞紅豆杉愈傷組織接種量對(duì)細(xì)胞褐化的影響很大。隨著接種量的增大，細(xì)胞褐化的程度逐漸加重，接種量為0.12和0.14 g/mL的細(xì)胞褐化嚴(yán)重，這可能是因?yàn)榻臃N量大，細(xì)胞密度高，養(yǎng)分不足，致使細(xì)胞褐化加重。

綜合接種量對(duì)細(xì)胞生長和細(xì)胞褐化的影響，細(xì)胞懸浮培養(yǎng)中曼地亞紅豆杉愈傷組織接種量以0.1 g/mL較適宜。

表 3 愈傷組織接種量對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞褐化的影響

圖2 愈傷組織接種量對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞褐化的影響

2.2 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響

圖3顯示，蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)具有較大的影響，在蔗糖質(zhì)量濃度為20～30 g/L時(shí)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞的生長率呈上升趨勢(shì)；當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度高于30 g/L時(shí)，細(xì)胞的比鮮質(zhì)量增長率呈下降趨勢(shì)，所以選擇30 g/L作為曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的適宜蔗糖質(zhì)量濃度。

2.3 激素類型及配比對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響

從圖4可知，在曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)體系中，2,4-D、NAA和KT 3種激素的適宜質(zhì)量濃度分別為0.7，1.0和1.0 mg/L；且均表現(xiàn)為隨著激素質(zhì)量濃度的增加，懸浮細(xì)胞的比鮮質(zhì)量增長率呈先增加后降低的趨勢(shì)。

圖3 蔗糖質(zhì)量濃度對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響

圖4 2,4-D、NAA和KT 3種生長激素對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

以3種激素的單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表4。從表4可知，3種激素的最佳配比為A1B1C2:2,4-D 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L，3種激素對(duì)曼地亞紅豆杉愈傷組織增殖的影響大小為NAA>KT>2,4-D。

表 4 2,4-D、NAA和KT 3種生長激素對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.4 防褐化試劑對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長的影響

防褐化試劑檸檬酸、PVP和水解乳蛋白對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生長影響的單因素試驗(yàn)結(jié)果見表5。由表5可以看出，3種防褐化試劑均能有效降低細(xì)胞的褐化程度，且對(duì)細(xì)胞生長有促進(jìn)作用，均表現(xiàn)為隨著防褐化試劑質(zhì)量濃度的增加，懸浮細(xì)胞的增殖倍數(shù)呈先增高后降低的趨勢(shì)，檸檬酸、PVP、水解乳蛋白的最適質(zhì)量濃度分別為200，300和500 mg/L。

表 5 3種防褐化試劑對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)的影響

以3種防褐化試劑的單因素試驗(yàn)結(jié)果為基礎(chǔ)進(jìn)行正交試驗(yàn)，結(jié)果見表6。表6表明，防褐化試劑的最佳配比為A3B3C1：檸檬酸220 mg/L+PVP 350 mg/L+水解乳蛋白450 mg/L， 3種防褐化試劑對(duì)懸浮細(xì)胞生長的影響大小依次為檸檬酸>PVP>水解乳蛋白。對(duì)比表5和表6可以發(fā)現(xiàn)，正交試驗(yàn)中曼地亞紅豆杉愈傷組織的最大增殖倍數(shù)低于單因素試驗(yàn)中水解乳蛋白為500 mg/L時(shí)的細(xì)胞增殖倍數(shù)，這是因?yàn)樵谡辉囼?yàn)中，各組的試劑配比未達(dá)到3種防褐化試劑的最佳配比，且PVP可能對(duì)水解乳蛋白和檸檬酸產(chǎn)生吸附作用，降低了其在懸浮培養(yǎng)液中的實(shí)際質(zhì)量濃度。

表 6 3種防褐化試劑對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)影響的正交試驗(yàn)結(jié)果

2.5 曼地亞紅豆杉細(xì)胞生長曲線和紫杉醇含量變化曲線

在最佳的懸浮培養(yǎng)體系中，曼地亞紅豆杉細(xì)胞的生長曲線(圖5-A)體現(xiàn)了紅豆杉細(xì)胞生長緩慢的特點(diǎn)，在培養(yǎng)前4 d細(xì)胞鮮質(zhì)量變化不明顯，接種后第5天細(xì)胞迅速生長，16 d時(shí)，細(xì)胞增殖倍數(shù)達(dá)到3左右，細(xì)胞生長進(jìn)入穩(wěn)定期。細(xì)胞內(nèi)紫杉醇含量在培養(yǎng)前7 d逐漸減少(圖5-B)，10 d時(shí)紫杉醇含量開始增加；22 d時(shí)細(xì)胞內(nèi)的紫杉醇含量趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)榕囵B(yǎng)液內(nèi)碳源等營養(yǎng)物質(zhì)不斷消耗，使細(xì)胞生長受到影響，因此紫杉醇含量的增幅減小。

圖5 曼地亞紅豆杉細(xì)胞生長曲線(A)和紫杉醇含量變化曲線(B)

3 討 論

通過紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)紫杉醇是解決紫杉醇藥源問題的有效途徑，國內(nèi)許多研究者做了大量有價(jià)值的探索，但是對(duì)我國大面積種植的曼地亞紅豆杉的研究較少[11-12]。本試驗(yàn)通過對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)條件的研究，建立了曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系。

建立良好的細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系是進(jìn)行大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)的必要準(zhǔn)備[13]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，曼地亞紅豆杉細(xì)胞的接種量以0.1 g/mL為最佳，接種量低于0.1 g/mL時(shí)，細(xì)胞不能很好地生長；高于0.1 g/mL時(shí)，細(xì)胞很快會(huì)褐化，影響細(xì)胞的生長。蔗糖是細(xì)胞生長的重要碳源,適宜質(zhì)量濃度的蔗糖能提高培養(yǎng)細(xì)胞的生長速率，而較高的蔗糖質(zhì)量濃度則容易使細(xì)胞產(chǎn)生褐變[14]。本研究結(jié)果表明，利于曼地亞紅豆杉細(xì)胞生物量增加的蔗糖質(zhì)量濃度以30 g/L為最優(yōu)，當(dāng)蔗糖質(zhì)量濃度高于30 g/L時(shí),細(xì)胞褐化嚴(yán)重,影響細(xì)胞的正常生長。

植物生長激素能夠促進(jìn)植物細(xì)胞的生長和繁殖，但是較高質(zhì)量濃度的激素反而會(huì)對(duì)細(xì)胞生長起抑制作用，合適的激素類型和配比是懸浮體系建立成功與否的關(guān)鍵[15-16]。有研究表明，外源2,4-D 有利于愈傷組織的生長[17]，但對(duì)次生代謝物的合成往往有抑制作用[18]。如司徒琳莉等[19]在東北紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加一定質(zhì)量濃度的 2,4-D 可以顯著提高細(xì)胞的生長速率，增加生物量；同時(shí)再添加適宜質(zhì)量濃度的NAA 和KT則可以提高紫杉醇的積累。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，在曼地亞紅豆杉細(xì)胞培養(yǎng)中，2,4-D、NAA和KT 3種激素的適宜配比為：2,4-D 0.6 mg/L+NAA 0.8 mg/L+KT 1.0 mg/L；3種激素對(duì)曼地亞紅豆杉細(xì)胞生長的影響大小依次為NAA>KT>2,4-D。

防褐化試劑(如水解乳蛋白和檸檬酸)可以有效抑制細(xì)胞的褐化，延長細(xì)胞的生長周期，且一些防褐化試劑可以促進(jìn)細(xì)胞的生長和細(xì)胞內(nèi)紫杉醇含量的提高[20-24]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，水解乳蛋白、PVP和檸檬酸3種防褐化試劑對(duì)曼地亞紅豆杉懸浮培養(yǎng)細(xì)胞褐化具有明顯的抑制作用，且以檸檬酸對(duì)細(xì)胞生長的影響最大。

本研究建立的曼地亞紅豆杉細(xì)胞懸浮培養(yǎng)體系，對(duì)于通過細(xì)胞培養(yǎng)生產(chǎn)臨床急需的抗腫瘤藥物紫杉醇具有極其重要的價(jià)值，對(duì)工業(yè)化生產(chǎn)紫杉醇也將產(chǎn)生極大的促進(jìn)作用。

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