烏司他丁對(duì)膿毒癥致急性腎損傷大鼠腎臟病理及尿相關(guān)指標(biāo)的影響

曹波　張琳琳　柴春香等

[摘要] 目的 探討烏司他丁對(duì)盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)（CLP）所致大鼠膿毒癥急性腎損傷腎臟病理及尿相關(guān)指標(biāo)的影響。 方法 SD健康雄性大鼠55只，按隨機(jī)化原則分成3組：正常對(duì)照組5只、模型組25只、烏司他丁治療組25只，后兩組再隨機(jī)分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1、6、12、24、48 h），每組每時(shí)間點(diǎn)各5只，采用CLP復(fù)制膿毒癥模型，烏司他丁治療組造模后立即給予烏司他丁100 000 U/kg，尾靜脈注射，分別在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)采血、留尿標(biāo)本，處死大鼠摘取腎臟，進(jìn)行腎功能血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN），尿腎損傷分子（KIM-1）、白細(xì)胞介素-18（IL-18）和中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）檢測(cè)分析，光鏡下觀察腎臟病理變化。 結(jié)果 模型組SCr、BUN的濃度CLP術(shù)后6 h開始升高，24 h達(dá)高峰，48 h開始下降，均顯著高于對(duì)照組（P<0.05），烏司他丁治療組12、24、48 h均顯著低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組（P<0.05）。模型組尿KIM-1、NGAL、IL-18含量于CLP術(shù)后1 h開始升高，12 h達(dá)高峰，24 h開始下降，均顯著高于對(duì)照組，烏司他丁治療組6、12、24、48 h均顯著低于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組（P<0.05）。腎臟病理改變明顯好于模型組。 結(jié)論 烏司他丁對(duì)膿毒癥所致急性腎損傷具有腎臟保護(hù)作用。

[關(guān)鍵詞] 烏司他丁；膿毒癥；急性腎損傷；腎臟病理

[中圖分類號(hào)] R692 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2014）02（c）-0011-04

膿毒癥并發(fā)急性腎損傷的發(fā)病率為19%～23%，當(dāng)膿毒癥并發(fā)急性腎損傷時(shí)，不僅給有效干預(yù)手段帶來困難，增加患者死亡率，而且耗費(fèi)巨大的醫(yī)療資源和巨額醫(yī)療費(fèi)用，因此，及早防治膿毒癥并發(fā)急性腎損傷，保護(hù)腎功能意義重大[1]。烏司他丁是從尿中分離純化出來的一種糖蛋白，具有穩(wěn)定細(xì)胞膜及細(xì)胞亞膜、穩(wěn)定溶酶體膜抑制溶酶體釋放、清除自由基、抑制炎癥介質(zhì)釋放、改善微循環(huán)衰竭狀態(tài)、抑制蛋白質(zhì)分解代謝亢進(jìn)等作用，并對(duì)多臟器損傷有保護(hù)作用[2-4]。本研究通過盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)[5]（cecal ligation and puncture，CLP）建立膿毒癥大鼠急性腎損傷模型，觀察烏司他丁對(duì)膿毒癥所致急性腎損傷的腎臟病理及尿指標(biāo)變化，探討烏司他丁對(duì)腎臟的保護(hù)作用及其機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器

烏司他?。◤V東天普生物化學(xué)制藥公司）；腎損傷分子1（KIM-1）、ELISA試劑盒（美國(guó)R&D公司），白細(xì)胞介素18（IL-18）、ELISA試劑盒（武漢博士德公司），中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運(yùn)載蛋白（NGAL）、ELISA試劑盒（上海藍(lán)基生物有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和分組

SD健康雄性大鼠55只，體質(zhì)量200～250 g，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，實(shí)驗(yàn)大鼠按隨機(jī)化原則分成3組。①正常對(duì)照組（n=5）：尾靜脈推注生理鹽水2 ml；②模型組（n=25）：行CLP；③烏司他丁治療組（n=25）：行CLP后即刻尾靜脈注射烏司他丁100 000 U/kg。模型組、烏司他丁治療組，再隨機(jī)分為5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（1、6、12、24、48 h），每組每時(shí)間點(diǎn)各5只，術(shù)后均補(bǔ)充生理鹽水3 ml/100 g抗休克。

1.3 動(dòng)物模型制備

實(shí)驗(yàn)前禁食12 h，手術(shù)組采用經(jīng)典的CLP復(fù)制膿毒癥急性腎損傷模型，即用10%水合氯醛0.3 ml/100 g腹腔麻醉，無菌條件下沿腹中線切開長(zhǎng)約2 cm，分離、結(jié)扎盲腸，在盲端腸壁用12號(hào)針穿刺2次，留置1條長(zhǎng)1 cm寬2 mm、兩頭貫穿盲腸的橡皮片，擠出少許糞便，將盲腸還納腹腔，逐層縫合腹壁，編號(hào)，清醒后轉(zhuǎn)入代謝籠內(nèi)自由進(jìn)水、進(jìn)食。術(shù)畢補(bǔ)充生理鹽水3 ml/100 g，術(shù)后自由飲食（水）。

1.4 留取標(biāo)本

從術(shù)后腹壁縫合結(jié)束開始計(jì)時(shí)，分別于1、6、12、24、48 h取材，下腔靜脈抽血5 ml，離心（3000 r/min）15 min，取血清于-20℃保存，待測(cè)血肌酐（SCr）、尿素氮（BUN）；膀胱分離，膀胱穿刺收集尿標(biāo)本于-20℃保存，待測(cè)KIM-1、IL-18、NGAL；后放血處死大鼠，取左腎切開置于10%多聚甲醛中固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下×200下取3個(gè)視野觀察腎臟病理變化。

1.5 指標(biāo)檢測(cè)

采用生化分析儀測(cè)定SCr、BUN。尿液標(biāo)本均采用ELISA法檢測(cè)KIM-1、IL-18和NGAL。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，應(yīng)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟的病理改變

HE染色光鏡下，正常對(duì)照組腎小球、腎小管結(jié)構(gòu)正常；模型組12 h開始出現(xiàn)炎性損傷，以24 h最為顯著，表現(xiàn)為腎組織彌漫性單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間隙水腫明顯，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腫脹、脫落，甚至出現(xiàn)裸膜，部分腎小管腔閉塞，腎小管腔代償擴(kuò)張，管型形成；烏司他丁治療組也存在單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間隙水腫，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腫脹、脫落，部分腎小管腔閉塞，腎小管腔代償擴(kuò)張，管型形成，明顯輕于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組。

2.2 大鼠腎功能的變化

CLP術(shù)后6 h，兩組大鼠SCr、BUN的濃度開始升高，24 h達(dá)高峰，48 h開始下降，均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。烏司他丁治療組12、24、48 h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)SCr、BUN均顯著低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；烏司他丁治療組大鼠48 h時(shí)SCr、BUN的濃度明顯回落，但仍然高于對(duì)照組（P<0.05）（表1、表2）。

2.3 兩組大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18含量的變化

CLP術(shù)后兩組大鼠尿KIM-1、NGAL、IL-18均于1 h開始明顯升高，12 h達(dá)高峰，24、48 h下降，均顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。烏司他丁治療組6、12、24、48 h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)尿KIM-1、NGAL、IL-18含量顯著低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；烏司他丁治療組大鼠48 h時(shí)尿KIM-1、NGAL、IL-18含量回落顯著，但仍高于對(duì)照組（P<0.05）（表3～表5）。

3 討論

臨床實(shí)踐中，膿毒癥一旦并發(fā)腎臟損害，治療難度明顯增加，而且耗費(fèi)巨大的醫(yī)療資源和巨額醫(yī)療費(fèi)用。因此，及早防治膿毒癥并發(fā)急性腎損傷，保護(hù)腎功能意義重大[8-9]。膿毒癥致急性腎損傷的機(jī)制許多學(xué)者[1，4-6]認(rèn)為可能是感染時(shí)所釋放的毒素以及活化的炎性細(xì)胞和炎癥介質(zhì)釋放，激活Toll樣受體4，經(jīng)過一系列級(jí)聯(lián)信號(hào)傳遞，相互促進(jìn)，形成炎癥瀑布，從而啟動(dòng)后續(xù)的一系列病理生理改變，導(dǎo)致急性腎損傷。KIM-1是一種新的Ⅰ型跨膜蛋白，參與腎小管上皮組織形態(tài)和功能的恢復(fù)，在急性腎損傷后呈現(xiàn)高水平表達(dá)，并可在尿中檢測(cè)出，在急性腎損傷大鼠模型的報(bào)道顯示其升高明顯早于其他傳統(tǒng)檢測(cè)指標(biāo)的改變，可以作為急性損傷早期的檢測(cè)指標(biāo)和治療效果評(píng)定指標(biāo)[8-10]。NGAL是一種分泌性蛋白，研究表明，NGAL在正常腎組織中呈低水平表達(dá)，但在腎缺血/再灌注損傷和順鉑誘導(dǎo)小鼠腎損傷模型中，損傷后3 h時(shí)的尿液中即可檢測(cè)到NGAL，明顯早于尿NAG、β2微球蛋白及SCr的改變，是急性腎損傷的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子，也是目前基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常選用的評(píng)價(jià)急性腎損傷的指標(biāo)[8，10]。IL-18被認(rèn)為與膿毒癥時(shí)臟器功能受損關(guān)系密切，IL-18能促進(jìn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致免疫功能紊亂，促進(jìn)臟器功能損傷。曾有研究顯示，在小鼠腎缺血性損傷模型中，IL-18在Caspase-1作用下被激活，激活后IL-18可裂解為成熟形式釋放入尿，并可在尿中被檢測(cè)出，是目前經(jīng)常選用的評(píng)價(jià)機(jī)體炎性反應(yīng)程度和治療效果的指標(biāo)[2，10]。有研究[10]證實(shí)KIM-1、NGAL、IL-18聯(lián)合檢測(cè)在評(píng)價(jià)膿毒癥致急性腎損傷程度及治療效果方面有更高的價(jià)值。本研究中采用經(jīng)典的CLP復(fù)制急性腎損傷模型，應(yīng)用腎臟病理變化，評(píng)價(jià)腎功能傳統(tǒng)指標(biāo)SCr、BUN，及新型腎損傷標(biāo)志物KIM-1、NGAL及反映炎性反應(yīng)程度和治療效果的IL-18來反映膿毒癥大鼠急性腎損傷的變化。實(shí)驗(yàn)大鼠結(jié)果顯示，腎臟病理：模型組12 h開始出現(xiàn)炎性損傷，以24 h最為顯著，表現(xiàn)為腎組織彌漫性單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間隙水腫明顯，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腫脹、脫落，甚至出現(xiàn)裸膜，部分腎小管腔閉塞，代償擴(kuò)張，管型形成；CLP術(shù)后6 h，兩組大鼠SCr、BUN的濃度開始升高，24 h達(dá)高峰，48 h開始下降，尿KIM-1、NGAL、IL-18均于1 h開始明顯升高，12 h達(dá)高峰，24、48 h下降，均顯著高于對(duì)照組。

烏司他丁是從尿中分離純化出來的一種糖蛋白，主要通過靜脈方式給藥，給藥后在腎與肝迅速積累，5 min達(dá)到峰值，其生物利用度為100%，半衰期為40 min，主要通過腎臟代謝，具有抑制多種水解酶的活性，減輕水解酶對(duì)組織器官的損害，穩(wěn)定溶酶體膜、清除氧自由基及脂多糖、調(diào)控炎性介質(zhì)釋放，抑制血栓素、血管內(nèi)皮素的升高，維持內(nèi)源性血管活性物質(zhì)的動(dòng)態(tài)平衡，抑制凝血系統(tǒng)活化，改善重要臟器灌流，改善循環(huán)障礙，起到多臟器的保護(hù)作用[11]。炎性細(xì)胞因子及介質(zhì)的釋放在膿毒癥造成腎損傷中起了關(guān)鍵的作用[4-6]；Aosasa等[12]揭示烏司他丁通過抑制單核細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶C及核因子-κB（NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來直接抑制TNF-α的翻譯和分泌；Inoue等[13]在小鼠腹腔注射脂多糖成功制造膿毒癥模型后給予烏司他丁干預(yù)能夠降低致炎因子的生成；余劍波等[14]報(bào)道顯示感染性休克炎性細(xì)胞因子TNF-α、IL-6和IL-8生成和釋放因?yàn)跛舅〉膽?yīng)用得到抑制；陸艷娟等[15]在脂多糖致大鼠多器官功能衰竭抗氧自由基的實(shí)驗(yàn)中證實(shí)烏司他丁能夠糾正超氧化物歧化酶和丙二醛的惡性變化，對(duì)大鼠肝、腎組織有一定的保護(hù)作用；Nakatani等[16]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，烏司他丁不僅抑制細(xì)胞外中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶活性，還抑制其在細(xì)胞內(nèi)的活性和分泌，從而抑制中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷；以上研究均從不同角度驗(yàn)證了烏司他丁在多臟器損傷中抑制炎癥反應(yīng)程度、抗氧自由基和治療效果方面的優(yōu)勢(shì)，起到臟器保護(hù)作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，烏司他丁治療組腎臟病理變化：光鏡下存在單核-巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，組織間隙水腫，腎小管上皮細(xì)胞空泡變性、腫脹、脫落，部分腎小管腔閉塞，代償擴(kuò)張，管型形成，明顯輕于相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)模型組；造模后在12、24、48 h較模型組同時(shí)間點(diǎn)SCr、BUN均顯著低，于48 h時(shí)開始回落，但仍然高于對(duì)照組；尿KIM-1、NGAL、IL-18含量在造模后6、12、24、48 h較模型組相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)均顯著低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，于48 h時(shí)含量回落顯著，同樣高于對(duì)照組。從烏司他丁治療組病理變化、腎功能變化、反映腎損傷程度和炎癥反應(yīng)狀態(tài)的指標(biāo)變化分析，均起到了很好的腎臟保護(hù)作用，其機(jī)制可能與抑制炎癥因子及介質(zhì)的釋放有關(guān)。

本研究通過CLP復(fù)制膿毒癥急性腎損傷模型，經(jīng)烏司他丁治療，不論是腎功能指標(biāo)，還是新型尿生物學(xué)指標(biāo)的變化，腎臟病理的改善，均顯示了很好的腎臟保護(hù)作用，推測(cè)可能通過抑制炎癥介質(zhì)釋放、改善微循環(huán)衰竭狀態(tài)等機(jī)制，達(dá)到對(duì)膿毒癥急性腎損傷大鼠腎臟的保護(hù)作用。

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（收稿日期：2013-12-27 本文編輯：郭靜娟）

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（收稿日期：2013-12-27 本文編輯：郭靜娟）

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（收稿日期：2013-12-27 本文編輯：郭靜娟）