上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化與肺纖維化的研究進(jìn)展

曾仁鳳 何振華 張秀峰

肺纖維化（pulmonary fibrosis，PF）通常是慢性肺疾病最終的表現(xiàn)結(jié)果，是全球肺疾病發(fā)病率及死亡率的重要原因之一。肺纖維化是以多種原因引起的上皮細(xì)胞受損，修復(fù)障礙，上皮細(xì)胞活化、損傷，導(dǎo)致大量細(xì)胞因子釋放、細(xì)胞外基質(zhì)沉積、異常間質(zhì)細(xì)胞活化和增生為特征的疾病。其病理特點(diǎn)主要為大量間質(zhì)細(xì)胞（成纖維細(xì)胞、肌成纖維細(xì)胞）積聚及增殖，而這些間質(zhì)細(xì)胞來源尚不清楚。最近研究報(bào)道，這些細(xì)胞是通過上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithlial to mesenchymal transition，EMT）而來的[1]。

1 EMT

EMT是細(xì)胞塑形的一種過程，上皮細(xì)胞失去極性，上皮細(xì)胞標(biāo)志物丟失或下調(diào)，細(xì)胞骨架重建，細(xì)胞變成紡錘體形態(tài)，獲得間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，并且細(xì)胞的黏附能力減弱、增殖和遷移能力增強(qiáng)。

2 EMT的主要表型標(biāo)志物

EMT發(fā)生時(shí)，上皮細(xì)胞標(biāo)志物丟失，并獲得間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，代表上皮細(xì)胞的標(biāo)志物主要有E-鈣粘素(E-cadherin，E-cad)，緊密連接蛋白 1（zonula occludens-1，ZO-1)；代表間質(zhì)細(xì)胞的標(biāo)志物主要有α-平滑肌肌動(dòng)蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、波形蛋白（vimentin）、I型膠原蛋白（col type I）、纖維連接蛋白（fibronectin）、纖維狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）。下面介紹3種肺纖維化中EMT的主要表型標(biāo)志物。

2.1 E-cadherin E-cadherin，是典型的EMT上皮細(xì)胞標(biāo)志物[2]。E-cad，分子量大小為120 KDa，廣泛分布于胚胎和成熟組織上皮細(xì)胞中，位于同種上皮細(xì)胞側(cè)面的中間連接處，是一類介導(dǎo)細(xì)胞之間互相黏附的鈣依賴性跨膜糖蛋白，參與介導(dǎo)上皮型細(xì)胞—細(xì)胞間的黏附、胚胎發(fā)育以及正常組織中上皮細(xì)胞層的形成和維持，是細(xì)胞連接的重要分子。人類E-cad基因位于16 q 22.1 附近，由723～748個(gè)氨基酸組成，包括N端胞外區(qū)、高度疏水的跨膜區(qū)及C端胞內(nèi)區(qū)。N端是Ca2+的結(jié)合位點(diǎn)，對(duì)Ca2+有高度敏感性，通過與Ca2+特異性結(jié)合而發(fā)揮黏附功能；胞內(nèi)區(qū)通過連環(huán)素（catenin）與微絲、中間絲、肌動(dòng)蛋白相連接，形成復(fù)合體，使E-cad被錨定于細(xì)胞骨架上，與相鄰細(xì)胞形成穩(wěn)定連接[3]。當(dāng)組織受到損傷時(shí)，在修復(fù)過程中，上皮細(xì)胞間E-cad連環(huán)素復(fù)合物及其核心骨架蛋白發(fā)生酪氨酸磷酸化，破壞了該復(fù)合體結(jié)構(gòu)的完整性，使得E-cad不能準(zhǔn)確定位于膜上，胞漿內(nèi)蛋白酶將其降解進(jìn)入胞漿，喪失其黏附的能力，增加了上皮細(xì)胞增殖和遷移能力，從而促進(jìn)上皮細(xì)胞的再生修復(fù)。

2.2 a-SMA a-SMA是一種間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，由血管平滑肌機(jī)細(xì)胞及肌上皮細(xì)胞表達(dá)。a-SMA是一種中等大小的蛋白質(zhì)，由375個(gè)氨基酸組成，分子量為43 KDa。a-SMA被認(rèn)為是肌成纖維細(xì)胞的一種標(biāo)志物，而這些肌成纖維細(xì)胞來自于上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，并且與肺纖維化有關(guān)[4]，a-SMA的表達(dá)與肺纖維化的進(jìn)展是成正相關(guān)的。

2.3 Vimentin Vimentin是常見的EMT間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物，來源于成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和白細(xì)胞等中胚層細(xì)胞。Vimentin是中間纖維家族中的一員，構(gòu)成間質(zhì)細(xì)胞中最主要的中間纖維，其重要功能是與微管、微絲共同形成一個(gè)細(xì)胞支架網(wǎng)絡(luò)而維持細(xì)胞完整性。人的vimentin基因位于人類染色體10 p 13上，相對(duì)分子量大小約為57 KDa，總共編碼466個(gè)氨基酸。Vimentin由頭部的氨基端（N端）、尾部的羧基端（C端）和兩端之間的螺旋桿狀區(qū)3部分構(gòu)成，不僅參與腫瘤分化、轉(zhuǎn)移和增殖有著密切的關(guān)系，還在細(xì)胞的黏附、遷移、增殖、凋亡等生理功能中起重要作用。在炎癥的修復(fù)過程中，多種細(xì)胞因子的參與下，上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生時(shí)，波形蛋白的表達(dá)上調(diào)[5]。

3 EMT促進(jìn)了肺纖維化

EMT是目前肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究熱點(diǎn)，在肺纖維化的形成中扮演了非常重要的角色。EMT是肺纖維化重要的病理過程[1,6]。EMT是上皮細(xì)胞失去極性，上皮細(xì)胞標(biāo)志物丟失或下調(diào)，細(xì)胞骨架進(jìn)行重建，細(xì)胞變成紡錘體形態(tài)，并獲得間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物的過程[7]。EMT分為3型，Ⅰ型EMT參與胚胎發(fā)育、器官形成，Ⅱ型EMT在肺纖維化中發(fā)揮作用，Ⅲ型EMT與腫瘤形成、進(jìn)展有關(guān)[8]。很多研究證明EMT與肺纖維化有著密切的關(guān)系[5-6,9]。博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的肺泡上皮細(xì)胞（alveolar epithelial cells，AECs）及氣道上皮細(xì)胞（bronchial epithelial cells，BECs）發(fā)生了上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化[6]，實(shí)驗(yàn)結(jié)果是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad的表達(dá)下降，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物a-SMA、F-actin的表達(dá)增加。在C^amara[9]的研究中，人的氣道上皮細(xì)胞（human bronchial epithelial cells，HBECs)）也發(fā)生了上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致E-cad的丟失，獲得vimentin、a-SMA。同樣，Milara等[5]的研究，無論是在體外實(shí)驗(yàn)的A 549細(xì)胞中，還是在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的特發(fā)性肺纖維化患者中，都證明了上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)化,伴隨上皮細(xì)胞標(biāo)志物ZO-1、E-cadherin的下調(diào)，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物α-SMA、vimentin、col type I的上調(diào)。這些研究表明EMT的發(fā)生促進(jìn)了肺纖維化的形成。

4 EMT促進(jìn)肺纖維化的信號(hào)通路

4.1 TGF-β/smad通路 轉(zhuǎn)化生長因子β（TGF-β）是一種多功能的細(xì)胞因子，通過影響細(xì)胞的增生、分化、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)生成來調(diào)節(jié)組織的形態(tài)發(fā)生及分化，被譽(yù)為是誘導(dǎo)縱多組織（包括肺組織）纖維化的總開關(guān)。在正常的哺乳動(dòng)物上皮細(xì)胞中，TGF-β是肺纖維化中上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化的主要誘導(dǎo)者，包括腎小管上皮細(xì)胞、角膜上皮細(xì)胞和肺泡上皮細(xì)胞[7]。在Kasai等[10]的研究中，使用TGF-β處理的A 549細(xì)胞，相差顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生了形態(tài)學(xué)的改變，并且檢測(cè)到成纖維細(xì)胞表型標(biāo)志物vimentin的表達(dá)上升，上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad表達(dá)下調(diào)，同時(shí)致纖維化因子Ⅰ型、Ⅲ型膠原蛋白及結(jié)締組織生長因子（CTGF）的表達(dá)升高。這個(gè)研究證明了TGF-β能夠誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞發(fā)生EMT，而且此項(xiàng)研究還證明了TGF-β誘導(dǎo)EMT是通過活化了的Smad 2。另外，還有研究證明Smad 3也參與了EMT[7]。

TGF-β/Smad信號(hào)通路是參與肺纖維化EMT的重要轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。Smad是肺纖維化EMT信號(hào)通路中TGF-β的下游底物。TGF-β家族細(xì)胞受體是跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，TGF-β與其胞膜上的受體結(jié)合磷酸化進(jìn)入胞漿，將信號(hào)傳遞給胞漿內(nèi)的Smad 2與Smad 3，磷酸化的Smad 2與Smad 3再與Smad4結(jié)合形成復(fù)合體，激活胞核內(nèi)的核轉(zhuǎn)錄因子，從而啟動(dòng)一系列的反應(yīng)，促進(jìn)纖維化的形成。

核轉(zhuǎn)錄因子包括Snail家族、ZEB家族和helix-loophelix(HLH)家族[11]。Snail屬鋅指轉(zhuǎn)錄因子，其成員包括Snail 1、Snail 2（又稱Slug）和Snail 3。在肺纖維化中，主要是Snail1 參與，Smad與Snail1啟動(dòng)子結(jié)合，然后進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，Snail1通過識(shí)別E-cad，并且與E-cad啟動(dòng)子部位的E-box結(jié)合，從而抑制E-cad的表達(dá)。在Kim等[12]的研究中，TGF-β介導(dǎo)的A 549細(xì)胞不盡發(fā)生了EMT，還發(fā)現(xiàn)Snail1的高表達(dá)導(dǎo)致E-cad的丟失。這就表明Snail1與EMT有著密切關(guān)系。ZEB包括ZEB1和ZEB 2，ZEB蛋白誘導(dǎo)及調(diào)節(jié)下游的E-cad，使其表達(dá)減少，并且促進(jìn)細(xì)胞的遷移。HLH包括蛋白E 12、E 47、Twist、Id等，也參與了EMT。

4.2 非Smad通路 TGF-β介導(dǎo)的EMT的途徑縱多，主要是依賴Smad的信號(hào)通路，也是當(dāng)前研究最熱門的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，還有其他非Smad的信號(hào)通路，包括RhoA/Rock、MAPK、PI3 K/AKt、Wnt等信號(hào)通路。

4.2.1 RhoA/Rock 在貂的肺上皮細(xì)胞和小鼠乳腺上皮細(xì)胞中，小G蛋白R(shí)hoA及其下游的Rock被證明參與了TGF-β介導(dǎo)的EMT，對(duì)EMT過程中細(xì)胞骨架的重排扮演了非常重要的角色[13]。

4.2.2 MAPK TGF-β可以激活MAPK，激活的MAPK影響細(xì)胞的緊密連接，細(xì)胞骨架重排，促進(jìn)細(xì)胞的遷移，導(dǎo)致上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變[11]。

4.2.3 PI3 K/AKt TGF-β通過酪氨酸激酶受體快速激活PI3激酶，是通過Akt激酶活化mTOR/S6激酶1，導(dǎo)致蛋白的合成增加及細(xì)胞的增生，參與EMT，抑制間質(zhì)細(xì)胞表型標(biāo)志物E-cad的表達(dá)下降[3]。

4.2.4 Wnt Wnt蛋白本身不能誘導(dǎo)EMT，典型的Wnt信號(hào)通路是被β-catenin調(diào)節(jié)的。β-catenin是細(xì)胞緊密連接的一部分，連接細(xì)胞骨架間的E-cad。如果Wnt信號(hào)被活化，將抑制GSK-3 β，導(dǎo)致胞質(zhì)中的β-catenin大量累積[11]。激活Wnt信號(hào)，抑制GSK-3 β，可以下調(diào)E-cad的表達(dá)，從而調(diào)節(jié)EMT[14]。

5 結(jié)論

肺纖維化呈進(jìn)行性發(fā)展，是呼吸系統(tǒng)最嚴(yán)重慢性疾病之一，最終導(dǎo)致呼吸衰竭而亡。目前肺纖維發(fā)病機(jī)制尚不清楚，缺乏有效的治療手段。TGF-β介導(dǎo)的EMT在肺纖維化形成機(jī)制中扮演了非常重要的角色，因此加強(qiáng)對(duì)EMT的科學(xué)研究，為肺纖維化的治療提供新靶點(diǎn)。

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