快速DNA提取環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)結(jié)核分枝桿菌的成本分析

歐喜超 夏輝 李強(qiáng) 逄宇 趙冰 張治英 李俊晨 章建康 池俊英 趙雁林

結(jié)核病的早期診斷，對(duì)于很好地控制結(jié)核病的傳播具有十分重要的意義。固體培養(yǎng)具有很高的診斷價(jià)值，但耗時(shí)較長(zhǎng)，至少需要6～8周的時(shí)間。近年來(lái)涌現(xiàn)出很多新的技術(shù)和方法用于結(jié)核分枝桿菌的快速診斷及鑒定[1-2]。然而除了檢測(cè)效能，檢測(cè)成本也是制約各種技術(shù)或方法能否推廣的決定性因素之一。結(jié)核分枝桿菌快速DNA提取環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)(procedure for ultra rapid extraction of loop-mediated isothermal amplification, PURE-LAMP；Eiken Chemical，日本)是一種基于分子生物學(xué)原理的快速檢測(cè)試劑盒，整個(gè)試劑盒采用封閉的反應(yīng)體系，在反應(yīng)體系內(nèi)加入2條內(nèi)引物和2條外引物，67 ℃等溫?cái)U(kuò)增40 min，然后通過(guò)紫外線照射觀察熒光強(qiáng)度進(jìn)行結(jié)果判斷[3]。國(guó)內(nèi)外的相關(guān)研究表明，PURE-LAMP檢測(cè)操作簡(jiǎn)單、檢測(cè)準(zhǔn)確性高，非常適合在實(shí)驗(yàn)室條件不足或技術(shù)力量薄弱的結(jié)核病高負(fù)擔(dān)地區(qū)應(yīng)用[4]。目前尚缺乏關(guān)于PURE-LAMP檢測(cè)成本的相關(guān)報(bào)道，本研究通過(guò)對(duì)比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)法和PURE-LAMP檢測(cè)的成本，從成本角度出發(fā)，評(píng)估PURE-LAMP檢測(cè)在我國(guó)縣(區(qū))級(jí)實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的可行性。

材料和方法

一、研究資料的來(lái)源

選取項(xiàng)目指定的河南省新鄉(xiāng)市結(jié)核病防治(簡(jiǎn)稱“結(jié)防”)所、獲嘉縣CDC以及河南省CDC作為研究現(xiàn)場(chǎng)。2011年3月至2012年2月，新鄉(xiāng)市結(jié)防所和獲嘉縣CDC共連續(xù)納入1378例臨床初診肺結(jié)核可疑患者，新鄉(xiāng)市923例，獲嘉縣455例。實(shí)驗(yàn)室對(duì)每份納入患者痰標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)，培養(yǎng)陽(yáng)性的菌株4 ℃冰箱保存，每月送至河南省CDC完成對(duì)硝基苯甲酸(PNB)菌群鑒定。為保證鑒定結(jié)果的準(zhǔn)確性，每批固體培養(yǎng)陽(yáng)性菌株在鑒定前需要進(jìn)行傳代復(fù)蘇。

二、研究方法

每例納入患者留取3份痰標(biāo)本(即時(shí)痰、夜間痰和晨痰)，實(shí)驗(yàn)室工作人員對(duì)晨痰和夜間痰進(jìn)行固體培養(yǎng)試驗(yàn)和PURE-LAMP檢測(cè)，培養(yǎng)陽(yáng)性菌株送至河南省CDC，對(duì)每例患者選取生長(zhǎng)狀態(tài)最好的1管陽(yáng)性菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)和菌群鑒定試驗(yàn)。

1. 結(jié)核分枝桿菌的傳統(tǒng)固體培養(yǎng)：遵照《分枝桿菌分離培養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)化操作程序及質(zhì)量保證手冊(cè)》[5]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序，將每份處理后痰標(biāo)本接種到2支商品化固體改良羅氏培養(yǎng)管中，培養(yǎng)基購(gòu)自珠海貝索生物技術(shù)有限公司。

2. 菌群鑒定：采取PNB法進(jìn)行菌群鑒定，具體操作參照《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]中的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序執(zhí)行。接種后3 d 觀察結(jié)果，以后每周觀察1次，直至孵育4周，同時(shí)記錄PNB培養(yǎng)基和中性改良羅氏培養(yǎng)基上菌落生長(zhǎng)情況。在PNB培養(yǎng)基上未見菌落生長(zhǎng)即為結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群感染，生長(zhǎng)則為非結(jié)核分枝桿菌感染。

3. PURE-LAMP檢測(cè)：使用PURE-LAMP法熒光檢測(cè)試劑盒，按照日本榮研化學(xué)公司提供的標(biāo)準(zhǔn)化操作手冊(cè)進(jìn)行操作[7]。

4.“要素法”成本分析：收集檢測(cè)整個(gè)過(guò)程(從實(shí)驗(yàn)室接收標(biāo)本到報(bào)告結(jié)果和廢棄物處理等)所有直接和間接成本[8]，涉及以下幾方面要素：(1)管理費(fèi)：維持實(shí)驗(yàn)室正常運(yùn)轉(zhuǎn)的基本費(fèi)用，如水、電、辦公費(fèi)、清潔、廢棄物和垃圾處理、安保等；(2)建筑費(fèi)：實(shí)驗(yàn)室建筑、改造及維修費(fèi)用；(3)設(shè)備費(fèi)：儀器設(shè)備的購(gòu)買、維修、維護(hù)費(fèi)用；(4)人員費(fèi)：從事檢測(cè)相關(guān)人員工資、福利、津貼費(fèi)用；(5)試劑費(fèi)：檢測(cè)相關(guān)試劑費(fèi)用；(6)耗材費(fèi)：耗材及個(gè)人防護(hù)相關(guān)費(fèi)用。

為了有效核算相關(guān)成本，需要針對(duì)實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的所有步驟和程序分別收集相關(guān)數(shù)據(jù)，進(jìn)行評(píng)估。固體培養(yǎng)試驗(yàn)包括試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本收集登記、培養(yǎng)操作、培養(yǎng)結(jié)果觀察登記和廢棄物處理等步驟。PNB菌群鑒定試驗(yàn)包括試驗(yàn)試劑耗材準(zhǔn)備、鑒定試驗(yàn)操作、結(jié)果觀察登記、廢棄物處理等步驟；PURE-LAMP試驗(yàn)包括試劑準(zhǔn)備、前處理及核酸擴(kuò)增檢測(cè)幾個(gè)過(guò)程。

實(shí)驗(yàn)人員按照要求在3個(gè)不同工作日，分別記錄3次高、中和低不同工作量情況下傳統(tǒng)固體培養(yǎng)、PURE-LAMP檢測(cè)和PNB菌群鑒定試驗(yàn)全過(guò)程中的資源使用情況，各要素的成本以試驗(yàn)過(guò)程中使用的各要素的數(shù)量乘以各要素的單位價(jià)格。其中資本性費(fèi)用如實(shí)驗(yàn)室空間、建筑物和設(shè)備等，其單位價(jià)格根據(jù)其采購(gòu)價(jià)格和預(yù)計(jì)的使用年限按照年度折算；管理費(fèi)用的計(jì)算是根據(jù)實(shí)驗(yàn)室工作人員數(shù)量、人員工作時(shí)間和其他與該系統(tǒng)相關(guān)的基礎(chǔ)設(shè)施、建筑物的使用狀況，將相關(guān)費(fèi)用分配到各次檢測(cè)中。PURE-LAMP檢測(cè)試劑的價(jià)格采用項(xiàng)目采購(gòu)價(jià)格106元計(jì)算，固體培養(yǎng)和菌群鑒定相關(guān)耗材的價(jià)格采用目前市場(chǎng)采購(gòu)價(jià)格。

結(jié) 果

一、每份痰標(biāo)本固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)成本分析

固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)的單位檢測(cè)平均成本分別為51.10和120.90元，均以試劑費(fèi)和耗材費(fèi)所占比例較高，新鄉(xiāng)市固體培養(yǎng)檢測(cè)成本略高于獲嘉縣，主要是由于新鄉(xiāng)市的管理成本、人員費(fèi)和耗材費(fèi)用較高，新鄉(xiāng)市和獲嘉縣PURE-LAMP檢測(cè)平均建筑費(fèi)分別為0.0042和0.0027元(表1)。

二、每例菌株傳代和菌群鑒定試驗(yàn)成本分析

菌株傳代和PNB菌群鑒定的單位檢測(cè)成本分別為21.37和56.68元(表2)。

三、每例患者傳統(tǒng)方法檢測(cè)和PURE-LAMP檢測(cè)成本分析

傳統(tǒng)方法檢測(cè)每例患者是否感染結(jié)核分枝桿菌(2份培養(yǎng)，1份傳代，1份PNB鑒定試驗(yàn))需要180.25元，PURE-LAMP檢測(cè)每例患者是否感染結(jié)核分枝桿菌需要120.90元，比傳統(tǒng)方法低59.35元。

四、不同檢測(cè)準(zhǔn)確度及患病流行率不同時(shí)， PURE-LAMP檢出每例結(jié)核病患者的成本

計(jì)算在不同結(jié)核病患病流行率的可疑人群中，與固體培養(yǎng)試驗(yàn)相比，不同敏感度和特異度的PURE-LAMP檢出1例結(jié)核病患者的平均成本，平均成本=PURE-LAMP檢測(cè)成本/[(1-流行率)×(1-特異度)+流行率×敏感度)]。可疑人群中結(jié)核病流行率越高，應(yīng)用固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)檢出1例結(jié)核病患者的單位成本越低。當(dāng)PURE-LAMP檢測(cè)特異度為95%時(shí)，只要敏感度高于60%，在結(jié)核病患病率低于50%的人群中，PURE-LAMP檢出1例結(jié)核病患者的平均成本均低于傳統(tǒng)方法(固體培養(yǎng)和PNB菌群鑒定試驗(yàn))(圖1)。

五、PURE-LAMP檢測(cè)設(shè)備和試劑耗材價(jià)格變化時(shí)對(duì)單位檢測(cè)成本的影響

由于PURE-LAMP檢測(cè)設(shè)備和試劑價(jià)格在整個(gè)成本中占有較大比重，并且對(duì)于將來(lái)市場(chǎng)推廣具有一定影響，因此在項(xiàng)目使用的設(shè)備及試劑價(jià)格基礎(chǔ)上，調(diào)整了50%、80%、100%、120%、150%和200%，分析價(jià)格變化對(duì)檢測(cè)成本的影響。結(jié)果顯示，當(dāng)LAMP檢測(cè)設(shè)備價(jià)格分別調(diào)整為現(xiàn)有價(jià)格的50%時(shí)，單位檢測(cè)成本僅下降了0.17元，而當(dāng)設(shè)備價(jià)格為現(xiàn)價(jià)格的200%時(shí)，單位檢測(cè)成本較現(xiàn)有價(jià)格僅上升了0.38元，設(shè)備價(jià)格的變化對(duì)單位檢測(cè)的成本影響不大；但是，當(dāng)調(diào)整檢測(cè)試劑為現(xiàn)價(jià)格的200%時(shí)，單位檢測(cè)成本將增加108.86元，達(dá)到229.76元，單位檢測(cè)成本隨試劑價(jià)格的變化幅度比較大。

討 論

本研究采用“要素法”成本分析比較了在我國(guó)縣(區(qū))級(jí)結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)分別用于結(jié)核病診斷的成本。整個(gè)研究從衛(wèi)生服務(wù)的角度出發(fā)，分析與固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)相關(guān)的直接和間接的貨幣成本。研究發(fā)現(xiàn)固體培養(yǎng)管理費(fèi)、建筑費(fèi)和耗材費(fèi)均顯著高于PURE-LAMP檢測(cè)，但是PURE-LAMP檢測(cè)設(shè)備和試劑價(jià)格較高，導(dǎo)致PURE-LAMP檢測(cè)單位成本費(fèi)用高于固體培養(yǎng)。目前，我國(guó)縣(區(qū))級(jí)實(shí)驗(yàn)室不具備開展菌群鑒定和藥物敏感性試驗(yàn)(簡(jiǎn)稱“藥敏試驗(yàn)”)的能力，固體培養(yǎng)陽(yáng)性菌株需要送到省參比實(shí)驗(yàn)室完成菌群鑒定，導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間和檢測(cè)成本均顯著增加。之前有研究表明，取患者1份痰標(biāo)本進(jìn)行PURE-LAMP檢測(cè)即可達(dá)到很好的檢測(cè)效能[7]。因此，本研究中每例患者PURE-LAMP檢測(cè)成本按照1份痰標(biāo)本檢測(cè)進(jìn)行計(jì)算。綜合考慮每例結(jié)核病患者的實(shí)際診斷情況，PURE-LAMP檢測(cè)成本低于固體培養(yǎng)。

一、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)成本影響因素分析

通過(guò)此次研究，筆者發(fā)現(xiàn)諸多因素可能會(huì)影響到固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)的成本。首先，PURE-LAMP檢測(cè)的診斷周期為2 h，而固體培養(yǎng)需要4～8周，這將導(dǎo)致固體培養(yǎng)與時(shí)間相關(guān)的成本包括管理費(fèi)、人員費(fèi)、儀器費(fèi)等成本顯著上升；其次，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室不同檢測(cè)成本也呈現(xiàn)出地域差異，其中新鄉(xiāng)市工作人員工資水平更高，這使得新鄉(xiāng)市的人員成本顯著高于獲嘉縣。此外，兩個(gè)項(xiàng)目點(diǎn)管理費(fèi)用差別也較大，實(shí)驗(yàn)所用耗材為當(dāng)?shù)刈孕胁少?gòu)，因此，在耗材方面兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室之間也表現(xiàn)出一定的差異。

表1 不同地區(qū)每份痰標(biāo)本固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)的單位檢測(cè)成本(人民幣：元)

表2 河南省CDC進(jìn)行傳代和PNB菌群鑒定的單位檢測(cè)成本(人民幣：元)

Se：敏感度；Sp：特異度

二、固體培養(yǎng)和PURE-LAMP檢測(cè)成本效益比較

除了更低的價(jià)格，PURE-LAMP檢測(cè)比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)還有諸多優(yōu)勢(shì)。首先，PURE-LAMP檢測(cè)用時(shí)更短。其次，PURE-LAMP檢測(cè)采用封閉的反應(yīng)體系，擴(kuò)增產(chǎn)物無(wú)需開蓋通過(guò)肉眼觀察就可判讀結(jié)果，降低了污染發(fā)生的可能性。其三，PURE-LAMP檢測(cè)更符合生物安全要求；PURE-LAMP檢測(cè)是一種基于核酸檢測(cè)的方法，因此其安全性優(yōu)于傳統(tǒng)的涂片鏡檢和固體培養(yǎng)。綜合考慮其成本和這些相關(guān)因素，PURE-LAMP檢測(cè)是一種更符合成本-效益的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法。

三、研究局限性

本研究中存在幾個(gè)明顯的不足。首先，本研究雖然分析了兩種檢測(cè)方法的成本，但由于后期效益(包括患者發(fā)現(xiàn)后治療及傳播風(fēng)險(xiǎn)等因素)沒(méi)有加以考慮，因此本研究進(jìn)行的成本-效益分析不夠全面；其次，在分析單個(gè)結(jié)核病患者的發(fā)現(xiàn)費(fèi)用時(shí)，僅從成本角度考慮，但在實(shí)際臨床檢測(cè)中，當(dāng)敏感度低于50%的檢測(cè)方法無(wú)實(shí)際使用價(jià)值。因此，后續(xù)深入研究將圍繞如何建立模型評(píng)估快速診斷的社會(huì)經(jīng)濟(jì)效益等方面展開。

總之，本研究表明在目前現(xiàn)有情況下，PURE-LAMP檢測(cè)是一種比傳統(tǒng)固體培養(yǎng)試驗(yàn)更經(jīng)濟(jì)更快速的結(jié)核分枝桿菌檢測(cè)方法。如果生產(chǎn)廠商在未來(lái)能夠降低市場(chǎng)價(jià)格并優(yōu)化產(chǎn)品性能，將更有利于PURE-LAMP檢測(cè)在縣(區(qū))級(jí)結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室的推廣。

志謝河南省CDC、新鄉(xiāng)市結(jié)防所和獲嘉縣CDC工作人員在數(shù)據(jù)收集過(guò)程中給予了支持和配合。美國(guó)帕斯適宜衛(wèi)生科技組織在數(shù)據(jù)分析和撰寫過(guò)程中給予了幫助。Hojoon Sohn在方案設(shè)計(jì)中給予了大力幫助

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