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    人D-二聚體的制備及其凍干性質(zhì)的分析

    2014-03-21 11:47:33武建偉才蕾王繼華唐時(shí)幸
    生物技術(shù)通報(bào) 2014年11期
    關(guān)鍵詞:人源冷凍干燥凍干

    武建偉 才蕾 王繼華 唐時(shí)幸

    (廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司 自檢型快速診斷國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,廣州 510663)

    人D-二聚體的制備及其凍干性質(zhì)的分析

    武建偉 才蕾 王繼華 唐時(shí)幸

    (廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司 自檢型快速診斷國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室,廣州 510663)

    以人源纖維蛋白原為原材料制備D-二聚體,將其制成凍干品并分析其凍干性質(zhì)。使用凝血酶、Factor XIIIa酶解纖維蛋白原,獲得交聯(lián)纖維蛋白。經(jīng)纖溶酶降解交聯(lián)纖維蛋白,生成纖維蛋白降解產(chǎn)物。超濾除去纖維蛋白降解產(chǎn)物中的小分子物質(zhì),可獲得較高純度的D-二聚體。通過篩選和優(yōu)化凍干方案,將D-二聚體制備成凍干品。經(jīng)檢測可知,D-二聚體凍干品可在37℃穩(wěn)定保存12 d;復(fù)溶后在25℃穩(wěn)定保存8 d;復(fù)溶后在4℃穩(wěn)定保存30 d;復(fù)溶時(shí),常用復(fù)溶溶劑對(duì)其復(fù)溶后的活性檢測無明顯影響。

    纖維蛋白 纖維蛋白原 D-二聚體 血栓 凍干品

    D-二聚體(D-dimer)是交聯(lián)纖維蛋白發(fā)生纖溶的特異性標(biāo)志物,由纖維蛋白原逐步水解而成[1]。纖維蛋白原是一種具有凝血功能的血漿球蛋白,主要作為凝血因子I參與體內(nèi)凝血過程[2]。經(jīng)凝血酶、Factor XIIIa作用,纖維蛋白原被水解成交聯(lián)纖維蛋白;纖溶酶可使纖維蛋白(原)D-E區(qū)互補(bǔ)結(jié)構(gòu)裂解,降解纖維蛋白原和纖維蛋白單體生成纖維蛋白原降解產(chǎn)物,以及降解交聯(lián)纖維蛋白生成纖維蛋白降解產(chǎn)物,纖維蛋白降解產(chǎn)物中含有大量的D-dimer[3,4]。D-dimer分子量約為180 kD[5],在健康人體內(nèi)含量極少,一般認(rèn)定0.5 mg/L(FEU)為cut-off值[6]。另有研究表明,D-dimer的cut-off值與年齡呈正相關(guān),年齡愈大,cut-off值愈高[7]。

    機(jī)體內(nèi)凝血和繼發(fā)性纖溶系統(tǒng)的激活,均可使D-dimer水平升高[8]。臨床診斷中,D-dimer檢測常用于:靜脈血栓栓塞(Venous thrombus embolism,VTE)、深靜脈血栓(Deep vein thrombosis,DVT)和肺血栓(Pulmonary embolism,PE)的排除,以及彌漫性血管內(nèi)凝血(Disseminated intravascular coagulation,DIC)的診斷、溶栓治療的監(jiān)測[9-12];

    急性心肌梗塞(Acute myocardial infarction,AMI)、冠狀動(dòng)脈缺血(Coronary ischemia)、腦梗塞(Cerebral infarction)[12-14]的診斷和預(yù)后判斷;惡性腫瘤,如肺癌(Lung cancer)、卵巢癌、結(jié)腸直腸癌(Colorectal cancer)、乳腺癌(Breast cancer)[15-18],以及肝臟疾?。?9]、糖尿?。?0]、妊娠高血壓綜合征高凝狀態(tài)[21]等的診斷和預(yù)后判斷。

    真空冷凍干燥(Vacuum Freeze-drying),簡稱“凍干”,是在適宜的真空度下將物質(zhì)中的水分析出的技術(shù),已廣泛應(yīng)用于生物制品、醫(yī)藥、食品、花卉產(chǎn)業(yè)、標(biāo)本制作和古書籍保護(hù)等領(lǐng)域[22]。生物制品通過真空冷凍干燥制成凍干品后,具有穩(wěn)定、易復(fù)溶等優(yōu)勢,便于保存和運(yùn)輸。商品化的人源D-dimer蛋白多以液體形式保存于血清中,對(duì)保存和運(yùn)輸條件要求苛刻。以健康新生牛血清作為凍干基質(zhì)對(duì)D-dimer蛋白進(jìn)行凍干,制備的D-dimer凍干品具有良好的穩(wěn)定性和實(shí)用性。

    近年來,D-dimer研究多集中于生理意義的剖析和醫(yī)學(xué)價(jià)值的探討,本研究著重介紹人源D-dimer的制備及其凍干性質(zhì)的分析。通過逐步酶解和真空冷凍干燥獲得穩(wěn)定高效的D-dimer凍干品,旨在為人源蛋白的制備和保存提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人源纖維蛋白原、人源凝血酶、人源纖溶酶、抑肽酶、Tris-base購自Sigma公司;人源Factor XIIIa購自AssayPro公司;0.22 μm濾器、Amicon Ultra-15(MWCO:100KDa)購自Millipore公司;健康新生牛血清、PageRuler Unstained High Range Protein Ladder購自Thermo Scientific公司;D-二聚體(D-dimer)定量檢測試劑盒(免疫層析法)為廣州萬孚生物技術(shù)股份有限公司(Wondfo)自主研發(fā);其它試劑均為國產(chǎn)分析純。

    蛋白電泳儀、Bio-Rad Gel Doc XR+ 凝膠成像系統(tǒng)購自Bio-Rad公司;醫(yī)用冷藏箱購自中科美菱公司;AutoRep E 連續(xù)分配器購自RAININ公司;CHRIST ALPHA 1-2/ LD PLUS凍干機(jī)購自Martin Christ公司;-86℃立式醫(yī)用低溫保存箱購自SANYO公司。

    1.2 方法

    1.2.1 D-dimer的制備

    1.2.1.1 纖維蛋白原的酶解 稱取適量纖維蛋白原至離心管中,溶入TBS(20 mmol/L Tris-HCl,0.15 mol/L NaCl,2 mmol/L KCl,pH7.4)至終濃度為5 mg/mL,加入凝血酶(終濃度1 U/mL)、Factor XIIIa(終濃度5 μg/mL),37℃水浴4-6 h,即得到白色膠狀交聯(lián)纖維蛋白。

    1.2.1.2 交聯(lián)纖維蛋白的洗滌 取出交聯(lián)纖維蛋白至50 mL離心管中,使用TBS顛倒洗滌數(shù)次,放于37℃恒溫?fù)u床中振蕩洗滌約2-3 h。

    1.2.1.3 交聯(lián)纖維蛋白的酶解 取出洗滌完畢的交聯(lián)纖維蛋白至干凈的離心管,加入TBS(交聯(lián)纖維蛋白濕重終濃度200 mg/mL)、纖溶酶(終濃度5 mU/mL),37℃水浴至溶液中不再有絮狀交聯(lián)纖維蛋白。向反應(yīng)體系中加入抑肽酶(終濃度1 μg/mL),充分混勻。

    1.2.1.4 D-dimer的超濾 使用0.22 μm無菌濾器將新制的D-dimer溶液過濾至超濾管(MWCO:100KDa)中,超濾濃縮(2 000×g,20 min,4℃)。向濃縮液中加入適量TBS,再次進(jìn)行超濾濃縮(2 000×g,20 min,4℃),分裝制得的D-dimer濃縮液,保存于-80℃冰箱中。

    1.2.2 D-dimer凍干性質(zhì)的分析

    1.2.2.1 D-dimer的活性檢測與凍干方案的篩選 使用D-二聚體(D-dimer)定量檢測試劑盒(免疫層析法,線性范圍:0.1-10 mg/L)檢測制備的D-dimer活性。為提高D-dimer穩(wěn)定性,將其制成D-dimer凍干品。以3 mL棕色玻璃瓶為容器,每瓶加入500 μL D-dimer凍干工作液。通過調(diào)節(jié)真空冷凍干燥時(shí)的真空度及凍干時(shí)間、凍干稀釋液組份及pH,對(duì)凍干方案進(jìn)行篩選及優(yōu)化。根據(jù)D-dimer凍干品的精密度和系列穩(wěn)定性,選定最佳凍干方案。

    1.2.2.2 D-dimer凍干品的穩(wěn)定性分析 為驗(yàn)證D-dimer凍干品的穩(wěn)定性,使用Wondfo D-二聚體(D-dimer)定量檢測試劑盒監(jiān)測D-dimer凍干品在37℃穩(wěn)定性、復(fù)溶后4℃/25℃穩(wěn)定性、不同溶劑復(fù)溶凍干品對(duì)其活性檢測的影響等。

    2 結(jié)果

    2.1 D-dimer的制備和超濾

    將纖維蛋白原酶解體系置于37℃水浴中,白色交聯(lián)纖維蛋白迅速生成,反應(yīng)體系完全呈膠狀。酶解體系中的交聯(lián)纖維蛋白在37℃水浴中逐漸萎縮,直至完全消失。新制的D-dimer溶液活性遠(yuǎn)超出D-二聚體(D-dimer)定量檢測試劑盒的檢測范圍,需適度稀釋后用于定量檢測。經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳和Bio-Rad Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)分析,交聯(lián)纖維蛋白的降解產(chǎn)物中,D-dimer純度約為60%;超濾后,小分子蛋白被大量除去,D-dimer純度升高至90%(圖1)。使用A280nm紫外吸收法檢測D-dimer溶液濃度,發(fā)現(xiàn)D-dimer蛋白總量約為纖維蛋白原的一半,即制備得率約為50%。

    圖1 D-dimer的SDS-PAGE凝膠電泳純度分析

    2.2 D-dimer的活性檢測與凍干方案的篩選

    經(jīng)過多次摸索和驗(yàn)證,按照一定的比例將D-dimer蛋白溶液稀釋成位于D-二聚體(D-dimer)定量檢測試劑盒檢測范圍內(nèi)的3個(gè)不同的濃度(高濃度H、中濃度M、低濃度L)。鑒于臨床檢測的D-dimer樣品多以全血或血漿為基質(zhì),本研究擬以健康新生牛血清作為D-dimer蛋白的凍干保護(hù)劑。凍干前,使用凍干稀釋液(50 mmol/L Tris-HCl,0.1 mol/L NaCl,0.5 mmol/L EDTA,pH8.0)調(diào)節(jié)新生牛血清比例(凍干稀釋液組份及pH經(jīng)多次正交試驗(yàn)篩選和優(yōu)化而得,詳細(xì)步驟略)。根據(jù)凍干品的系列穩(wěn)定性檢測結(jié)果,將凍干保護(hù)劑定為12%新生牛血清,真空冷凍干燥真空度:0.025 mbar(Main Drying)/0.012 mbar(Final Drying),凍干時(shí)間由凍干樣品的總裝液量而定。凍干后,從每個(gè)濃度的凍干品中隨機(jī)取出10支進(jìn)行檢測。稀釋后的D-dimer凍干品活性值均位于檢測試劑的檢測范圍內(nèi),3個(gè)濃度凍干品的批內(nèi)精密度(C.V)均小于15%(表1)。

    表1 Wondfo試劑檢測D-dimer凍干品均值與精密度

    2.3 D-dimer凍干性質(zhì)的分析

    隨機(jī)選取D-dimer凍干品用于各項(xiàng)檢測,參考區(qū)間由檢測精密度時(shí)的均值而定,即:x-±25%。檢測發(fā)現(xiàn),D-dimer凍干品可在37℃穩(wěn)定保存12 d(表2),復(fù)溶后在4℃穩(wěn)定保存30 d(表3),復(fù)溶后在25℃穩(wěn)定保存8 d(表4)。

    表2 D-dimer凍干品37℃穩(wěn)定性

    檢測不同溶劑復(fù)溶凍干品對(duì)其活性檢測的影響時(shí),選用去離子水、三蒸水、生理鹽水、瓶裝礦泉水(農(nóng)夫山泉)和自來水復(fù)溶凍干品。經(jīng)檢測,選用的5種溶劑復(fù)溶凍干品時(shí)對(duì)其活性檢測均無明顯影響(表5)。

    3 討論

    繼Ruckley等[23]于1970年發(fā)現(xiàn)血清FDP對(duì)肺栓塞具有重要的診斷價(jià)值之后,Gaffney在FDP中分離得到將近200 kD大小的“γ-γ dimers”,將其命名為 D-dimer,并預(yù)言“D-dimer檢測可能會(huì)成為有用的診斷依據(jù)”[24-26]。經(jīng)過多年的研究和臨床驗(yàn)證,研究人員發(fā)現(xiàn)D-dimer分子量約為180 kD,等電點(diǎn)(pI)為4.9-5.3,在健康人體內(nèi)的半衰期約為8 h[27],是交聯(lián)纖維蛋白降解的特異性產(chǎn)物,對(duì)多項(xiàng)疾病的診斷具有重要的檢測意義。由于D-dimer不存在疾病特異性,在臨床診斷中,D-dimer以

    其高度的敏感性和陰性預(yù)示能力時(shí)常用于篩查項(xiàng)目和輔助診斷。據(jù)世界衛(wèi)生組織(World Health Organization,WHO)發(fā)布的《Global status report on noncommunicable diseases(2010)》報(bào)告稱,心腦血管疾病已成為全球頭號(hào)死因,每年死于心腦血管疾病的人數(shù)約占全球死亡人數(shù)的30%[28]。鑒于D-dimer可作為血栓形成性疾病診斷和溶栓藥物療效監(jiān)測的特異性標(biāo)志物,D-dimer檢測對(duì)血栓導(dǎo)致的心腦血管疾病的及早診斷和治療,便顯得尤為重要。

    目前,國內(nèi)多采用進(jìn)口D-dimer抗原進(jìn)行相關(guān)研究或制備單克隆抗體。進(jìn)口抗原純度雖高,但價(jià)格昂貴,且多以液體形式保存,嚴(yán)重制約了D-dimer的研究及其運(yùn)輸和保存。本研究采用逐步酶解法和超濾即獲得高純度高活性的D-dimer蛋白,并通過真空冷凍干燥將其制成穩(wěn)定的D-dimer凍干品。選用健康新生牛血清為凍干基質(zhì),凍干品復(fù)溶后幾乎可作為天然D-dimer抗原使用。制備的D-dimer蛋白濃度約為5.6 mg/mL,使用Wondfo D-二聚體(D-dimer)定量檢測試劑盒檢測1 000倍稀釋后的蛋白溶液凍干前的活性約為5.0 mg/L,凍干后的活性約為4.5-5.0 mg/L,檢測時(shí)的活性收率和凍干時(shí)的活性收率均超過90%。

    表3 D-dimer凍干品復(fù)溶后4℃穩(wěn)定性

    表4 D-dimer凍干品復(fù)溶后25℃穩(wěn)定性

    表5 不同溶劑復(fù)溶D-dimer凍干品對(duì)其活性檢測的影響

    筆者曾在D-dimer超濾濃縮前,使用HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR(GE)對(duì)其進(jìn)行多次純化,純化效率均不理想。D-dimer經(jīng)HiPrep 16/60 Sephacryl S-300 HR純化后,蛋白純度未能明顯提高,蛋白濃度卻因被稀釋而明顯降低。鑒于超濾后的D-dimer純度約為90%,可滿足D-dimer常規(guī)研究使用,如用作室內(nèi)質(zhì)控品/物、陽性對(duì)照、免疫或初篩單克隆抗體。

    Shackell[29]于1909年使用真空干燥技術(shù)將補(bǔ)體、抗毒素、狂犬病毒及其它生物制品進(jìn)行凍干,制成可以穩(wěn)定保存的凍干品。隨著凍干原理的深入研究和凍干設(shè)備的改良,真空冷凍干燥技術(shù)現(xiàn)已發(fā)展成為集多門學(xué)科于一體的綜合技術(shù)工藝。在凍干過程中,預(yù)凍過的物料置于真空條件下進(jìn)行升華干燥,除去冰晶(約占全部水分的90%),升華干燥完成后進(jìn)入解析干燥,除去未凍結(jié)水,至物料中水分含量<3%[30]。制成的D-dimer凍干品呈多孔餅狀,對(duì)溫度、濃度或蛋白酶都具備較高的耐受程度,且易復(fù)溶和恢復(fù)活性。為使制備的D-dimer凍干品更接近于D-dimer天然抗原,以符合臨床檢測標(biāo)準(zhǔn),本研究使用新生牛血清作為凍干基質(zhì)對(duì)D-dimer進(jìn)行凍干。D-dimer凍干品在37℃穩(wěn)定保存12 d;復(fù)溶后

    在4℃穩(wěn)定保存30 d;復(fù)溶后在25℃穩(wěn)定保存8 d;使用常規(guī)溶劑復(fù)溶對(duì)活性檢測無明顯影響。

    4 結(jié)論

    本研究闡述了一項(xiàng)簡捷高效的人源D-dimer制備方案,以人源纖維蛋白原為原材料,先后經(jīng)過凝血酶、Factor XIIIa、纖溶酶等酶解和超濾即制得高純度的人源D-dimer蛋白,適于臨床研究的D-dimer凍干品具備較好的穩(wěn)定性。

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    (責(zé)任編輯 馬鑫)

    Preparation and Analysis of Lyophilization Characterization of Human D-dimer

    Wu Jianwei Cai Lei Wang Jihua Tang Shixing
    (National Engineering Laboratory of Rapid Diagnostic Test, Guangzhou Wondfo Biotech Co.,Ltd.,Guangzhou 510663)

    D-dimer is formed by sequential action of 3 enzymes from fibrinogen. After producing D-dimer, we did the research on its lyophilization process. To produce cross-linked fibrin, fibrinogen was digested by thrombin and Factor XIIa. Then, fibrin degradation products(FDP)was prepared from cross-linked fibrin being degraded by plasmin. D-dimer was purified from FDP through ultrafiltration and prepared into lyophilized powder. By optimizing the lyophilization program, lyophilized D-dimer was stable for at least 12 days at 37℃, stable for at least 8 days at 25℃ and 30 days at 4℃ after reconstitution, and not different when being dissolved by different solvent.The preparation system established in this research is feasible and efficient. Depend on its stability, lyophilized D-dimer could be provided as biological raw materials for further research.

    Fibrin Fibrinogen D-dimer Thrombus Lyophilized power

    2014-05-12

    國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃(“863”計(jì)劃)(2011AA02A103),廣東省戰(zhàn)略新興產(chǎn)業(yè)核心技術(shù)攻關(guān)項(xiàng)目(2012A080800007)

    武建偉,男,碩士,研究方向:免疫診斷;E-mail:Jarviswu@hotmail.com

    唐時(shí)幸,男,博士,研究方向:免疫診斷;E-mail:tang.shixing@wondfo.com.cn

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