戊糖乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸及高產(chǎn)菌株誘變選育

王義強王啟業(yè)馬國輝林麗云

（1.中南林業(yè)科技大學生物技術(shù)實驗室，長沙 410004；2.經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004；3.國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，長沙 410004）

戊糖乳桿菌發(fā)酵產(chǎn)乳酸及高產(chǎn)菌株誘變選育

王義強1，2，3王啟業(yè)1馬國輝1林麗云1

（1.中南林業(yè)科技大學生物技術(shù)實驗室，長沙 410004；2.經(jīng)濟林培育與保護教育部重點實驗室，長沙 410004；3.國家林業(yè)局生物乙醇研究中心，長沙 410004）

戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）是能利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸的潛力菌株，發(fā)酵條件優(yōu)化與高產(chǎn)菌株的選育是提高乳酸產(chǎn)量的重要手段。通過單因素試驗、Plackett-Burman設計與響應面試驗，對戊糖乳桿菌ATCC 8041產(chǎn)乳酸的發(fā)酵培養(yǎng)基及發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。結(jié)果表明，該菌株發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合為葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸鈣29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO40.20 g/L、MnSO450 mg/L；最佳發(fā)酵條件為37℃、pH6.5、接種量6%、裝液量80%。在此優(yōu)化條件下，該菌株發(fā)酵產(chǎn)乳酸為54.12 g/L。進一步以戊糖乳桿菌ATCC 8041為出發(fā)菌株，通過原生質(zhì)體進行紫外誘變，經(jīng)多重篩選，最終獲得一株遺傳穩(wěn)定性好的高產(chǎn)乳酸突變株，命名為戊糖乳桿菌Lactic UVC-02，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存，注冊號為CCTCC M 2013209。該突變株Lactic UVC-02經(jīng)葡萄糖發(fā)酵，乳酸產(chǎn)量達64.17 g/L，比出發(fā)菌株ATCC 8041（54.12 g/L）提高18.6%。

戊糖乳桿菌 乳酸發(fā)酵 紫外誘變 響應面試驗

乳酸（Lactic acid），又名丙醇酸，是一種在人體、動植物、微生物體內(nèi)普遍存在的有機酸［1］。乳酸及其衍生物可廣泛應用于食品、化工、紡織、制革、電子、醫(yī)藥以及農(nóng)業(yè)等諸多領域［2，3］。隨著環(huán)境污染問題

日益嚴重，應用新技術(shù)開發(fā)新型塑料，從而解決傳統(tǒng)塑料造成的“白色污染”問題，已成為各國研究的熱點［4］。乳酸可聚合生產(chǎn)聚乳酸來制造生物降解塑料、綠色包裝材料及農(nóng)業(yè)薄膜。聚乳酸無毒，無刺激性，具有較好的生物相容性和生物降解性。以聚乳酸來加工成塑料可解決日益嚴重的環(huán)境污染問題，引起世界的廣泛關注。乳酸的生產(chǎn)方法有酶合成法、化學合成法、微生物發(fā)酵法3種［5］。工業(yè)化生產(chǎn)多采用前兩種方法，但它們目前面臨原料來源有限、成本急劇增加的困境，最主要的是生產(chǎn)過程中帶來嚴重的環(huán)境污染。因此，通過微生物發(fā)酵法生產(chǎn)乳酸將成為未來發(fā)展的主要趨勢。

目前，能應用到工業(yè)生產(chǎn)乳酸的微生物只有霉菌中的根霉屬和細菌中的乳酸菌類［6-8］。利用根霉屬的米根霉生產(chǎn)乳酸在國內(nèi)外研究很多，但其發(fā)酵產(chǎn)乳酸存在糖轉(zhuǎn)化率低（理論值75%）、有氧混合發(fā)酵成本高和副產(chǎn)物多等不足［5，9］。乳酸細菌能利用葡萄糖（或可利用的碳水化合物）發(fā)酵產(chǎn)乳酸，糖轉(zhuǎn)化率可達90%以上，且發(fā)酵成本低，產(chǎn)物主要為L-型乳酸和D-乳酸混合物［10］。部分乳酸菌甚至可利用木質(zhì)纖維素的水解產(chǎn)物，如木糖、阿拉伯糖等五碳糖，發(fā)酵產(chǎn)生乳酸［11-13］。

傳統(tǒng)的乳酸發(fā)酵常以糧食作物為底物，不僅浪費糧食，且使乳酸價格高昂。因此，尋找和選育能夠利用木質(zhì)纖維素水解液為原料的高產(chǎn)乳酸菌株迫在眉睫。因傳統(tǒng)誘變具有誘變效率高且不易回復突變等特性，工業(yè)生產(chǎn)上乳酸菌種的選育多數(shù)是以傳統(tǒng)的誘變選育為主［14］。戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）ATCC 8041不僅能利用六碳糖也能利用五碳糖發(fā)酵生產(chǎn)乳酸，是能利用木質(zhì)纖維素水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸的潛力菌株［15］。本研究首次采用紫外線對出發(fā)菌株戊糖乳桿菌ATCC 8041原生質(zhì)體進行誘變處理，期望篩選出高產(chǎn)乳酸突變株。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本試驗所用的戊糖乳桿菌（Lactobacillus pentosus）ATCC 8041購于美國典型培養(yǎng)物保藏中心。

1.1.2 培養(yǎng)基 MRS肉湯活化培養(yǎng)基：眎蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，牛肉膏10 g/L，葡萄糖20 g/L，山梨醇酐單油酸1 g/L，檸檬酸銨2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CH3COONa·3H2O 7.73 g/L，Na2HPO4·12H2O 5.04 g/L，H2O 1 000 mL，固體培養(yǎng)基添加15 g/L的瓊脂，pH6.5。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖90 g/L，眎蛋白胨10 g/L，酵母粉5 g/L，Na2HPO4·12H2O 5 g/L，MgSO40.2 g/L，MnSO4·H2O 0.05 g/L，CaCO330 g/L。

種子培養(yǎng)基（改良的MRS培養(yǎng)基）：眎蛋白胨10 g/L、酵母提取物5 g/L、牛肉膏10 g/L、葡萄糖20 g/L、山梨醇酐單油酸1 g/L、檸檬酸銨2 g/L、MnS04·H2O 0.05 g/L、三水合乙酸鈉7.73 g/L、十二水合磷酸氫二鈉5.04 g/L，pH6.5。

斜面培養(yǎng)基：在種子培養(yǎng)基的基礎上，添加瓊脂20 g/L。

篩選培養(yǎng)基：改良的MRS培養(yǎng)基中加入0.01%溴鉀酚綠。

高滲再生培養(yǎng)基：采用雙層瓊脂法，用0.7 mol/L NaCl配制MRS培養(yǎng)基，上層含2%瓊脂，下層含3%的瓊脂。

滲透壓穩(wěn)定劑：0.7 mol/L NaCl溶液。

1.2 方法

1.2.1 種子培養(yǎng) 取1 mL MRS肉湯培養(yǎng)基于安瓿管中溶解菌體，稀釋后涂布平板，培養(yǎng)3 d；取平板培養(yǎng)菌落接種于含10 mL種子培養(yǎng)基的25 mL試管，37℃靜置培養(yǎng)10 h為一級種子液。取1 mL一級種子液接種于含100 mL種子培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶，37℃恒溫搖床中150 r/min培養(yǎng)10 h后用于試驗。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基單因素試驗 以乳酸產(chǎn)量為考察指標，對發(fā)酵培養(yǎng)基中的7個組分：葡萄糖（60、75、90、105、120和135 g/L）、蛋白胨（0、5、10、15和20 g/L）、酵母粉（0、2.5、5、7.5和10 g/L）、Na2HPO4·12H2O（0、2.5、5、7.5和10 g/L）、MgSO4（0、0.1、0.2、0.3、0.4和 0.5 g/L）、MnSO4·H2O（0、25、50、75和100 mg/L）、CaCO3（0、10、20、30、40、50和60 g/L）進行單因素試驗，除目標因素外，其余培養(yǎng)基組分均按發(fā)酵培養(yǎng)基和已篩選因素中的較佳條件進行試驗，每組3個平行，37℃厭氧發(fā)酵72 h，液相色譜檢測產(chǎn)物，結(jié)果取平均值。

1.2.3 Plackett-Burman試驗設計與響應面試驗 在

單因素試驗的基礎上確定低水平（-1）值，高水平（1）為低水平的1.25倍，選取影響乳酸產(chǎn)量較大的7個因素（葡萄糖、蛋白胨、酵母粉、Na2HPO4、MgSO4、MnSO4、CaCO3）進行全面考察，選用N=12的PB設計，以乳酸產(chǎn)量（Y）為響應值，利用試驗設計和數(shù)據(jù)分析軟件Minitab15進行Plackett-Burman設計［16，17］，根據(jù)軟件給出的試驗矩陣表確定各試驗組的編碼與取值進行試驗，再根據(jù)試驗結(jié)果進行數(shù)據(jù)分析，篩選出重要影響因素。

根據(jù)Plackett-Burman設計試驗結(jié)果，采用Box-Behnken設計進行試驗［18，19］，所得結(jié)果利用軟件以乳酸產(chǎn)量（Y）為響應值做響應面分析，從而獲得培養(yǎng)基中重要因子的最佳組合。

1.2.4 發(fā)酵條件單因素試驗 在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎上，以乳酸產(chǎn)量為考察指標，分別對溫度（31、33、35、37、39、41和43℃）、初始pH（4.0、4.5、5.0、5.5、6、6.5和7.0）、種子液接種量（2%、4%、6%、8%、10%和12%）及100 mL發(fā)酵瓶裝液量（65%、70%、75%、80%、85%、90%和95%） 依次進行單因素試驗。除目標因素外，其余培養(yǎng)條件按已篩選的最佳條件進行試驗，每組3個平行，進行厭氧發(fā)酵，液相色譜檢測，結(jié)果取平均值。

1.2.5 原生質(zhì)體制備 取10 mL液體種子培養(yǎng)物于滅過菌的離心管中，4 000 r/min 離心15 min，去上清液，用無菌生理鹽水洗滌收集的菌體兩次，加入3 mL含溶菌酶的滲透壓穩(wěn)定劑中，將制備的菌酶混合液在30℃的條件下酶解2 h，將酶解液3 000 r/min離心15 min，取上清液收集原生質(zhì)體，將原生質(zhì)體懸浮于10 mL滲透壓穩(wěn)定劑中備用。

1.2.6 原生質(zhì)體紫外誘變 取5 mL經(jīng)高滲溶液稀釋后原生質(zhì)體溶液，混勻，倒入直徑9 mm的培養(yǎng)皿中，在磁力攪拌下距功率20 W的紫外燈35 cm處進行0、20、40、60、80、100和120 s紫外照射。誘變結(jié)束后，取不同時間的處理液100 μL涂布在高滲再生培養(yǎng)基上，每個處理3個重復，37℃條件下恒溫避光培養(yǎng)72 h。以時間為橫坐標，致死率為縱坐標，繪制致死曲線。致死率（%）=（對照1 mL菌液中活菌數(shù)-處理后1 mL菌液中活菌數(shù)）/對照1 mL菌液中活菌數(shù)×100%。

1.2.7 高產(chǎn)突變株的篩選 將最佳處理原生質(zhì)體稀釋涂布于原生質(zhì)體再生培養(yǎng)基上，72 h后用無菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接在篩選培養(yǎng)基平板上。2 d后培養(yǎng)基為綠色，菌株的代謝產(chǎn)物乳酸會使菌落周圍pH降低，形成黃色顯色圈，挑取顯色圈較大的90株菌株進行搖瓶發(fā)酵，每個菌株接1瓶，37℃培養(yǎng)，72 h后測其乳酸產(chǎn)量。得到乳酸產(chǎn)量較高的菌株再次進行發(fā)酵復篩，每株3瓶，37℃培養(yǎng)，72 h后測其乳酸產(chǎn)量。

1.2.8 高產(chǎn)突變株遺傳穩(wěn)定性試驗 對篩選獲得的高活性的突變株進行繼代培養(yǎng)，連續(xù)繼代8次，每代5個平行，測其乳酸產(chǎn)量，分析其穩(wěn)定性。

1.2.9 乳酸的液相色譜法檢測

1.2.9.1 采用液相色譜［20］測定發(fā)酵液中乳酸的含量 色譜條件：色譜儀為安捷倫1100［含在線脫氣機，可變波長檢測器（VWD），agilent 1100四元泵］，色譜柱為EDipse XDB-C18（150 mm×4.6 mm 1.d. 5 μm），流動相為0.005 mol/L H2SO4溶液，pH2.5（用NaOH調(diào)節(jié)），流速1.0 mL/min，檢測波長210 nm，進樣量20 μm，柱溫為室溫。

1.2.9.2 流動相配制 0.27 mL分析純濃硫酸用水稀釋并定容至1 000 mL（0.005 mol/L），用NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至2.5，然后用0.45 μm孔徑的合成纖維素酯膜過濾。

1.2.9.3 對照品制備及標準曲線繪制 精密稱取乳酸1 g標準品放入10 mL容量瓶中，用超純水溶解并定容至10 mL，配成乳酸標準液，然后進行稀釋，分別配成0.5、1、2、4和5 g/L的標準溶液。用0.45 μm孔徑的合成纖維素酯膜過濾。再分別經(jīng)液相色譜檢測，以濃度為橫坐標，峰高值為縱坐標，繪制出的標準曲線如圖1所示。

圖1 乳酸標準曲線

1.2.9.4 樣品的制備 取5 mL發(fā)酵液（5 000 r/min，10 min）除去碳酸鈣，加5 mL 0.01 mol/L的硫酸溶

液進行酸解10 min，離心除去硫酸鈣，以0.45 μm的濾膜過濾，取1 mL濾液適量稀釋即得待測液。

2 結(jié)果

2.1 戊糖乳桿菌ATCC 8041最佳發(fā)酵培養(yǎng)基確定

發(fā)酵培養(yǎng)基中的7個因素的單因素試驗結(jié)果為葡萄糖90 g/L、蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、Na2HPO4·12H2O 5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO4·H2O 50 mg/L、CaCO330 g/L時對戊糖乳桿菌 ATCC8041發(fā)酵產(chǎn)乳酸的影響較大。在此基礎上，選取這7個對乳酸產(chǎn)量影響較明顯的因素進行Plackett-Burman設計試驗（表1），得到了2個對乳酸產(chǎn)量影響顯著的因素：葡萄糖質(zhì)量濃度和酵母粉質(zhì)量濃度，結(jié)果見圖2。在此基礎上對葡萄糖、酵母浸粉以及第三影響因子CaCO3做響應面試驗（表2），得到了預測乳酸產(chǎn)量的模型：

Y=54.00+1.62X1+0.33X2-0.020X3-0.075X1X2-0.020X1X3+0.020X2X3-2.58X12-0.79X22-0.22X32

其中X1為葡萄糖質(zhì)量濃度，X2為酵母浸粉質(zhì)量濃度，X3為CaCO3質(zhì)量濃度。

對該模型進行方差分析和顯著性檢驗（表3）得出，葡萄糖質(zhì)量濃度、酵母浸粉質(zhì)量濃度兩個因素對乳酸產(chǎn)量影響均達到顯著水平。各因素影響乳酸產(chǎn)量的大小順序為：葡萄糖＞酵母浸粉＞CaCO3。二次回歸模型的R2為0.9997，方程P值＜0.05，失擬檢驗P值為0.2500＞0.05，失擬不顯著，試驗結(jié)果可靠。因此模型選擇正確，可用于預測乳酸產(chǎn)量。

Design-Expert軟件預測和驗證試驗表明，發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組合為：葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸鈣29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO40.20 g/L、MnSO450 mg/L。

2.2 戊糖乳桿菌ATCC 8041最佳發(fā)酵條件的確定

在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化的基礎上，對發(fā)酵條件做單因素試驗，結(jié)果（圖3-圖7）顯示，得到較佳發(fā)酵條件為：溫度37℃、初始pH6.5、接種量6%、裝液量80%。在培養(yǎng)基與發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎上，得到出發(fā)菌株發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乳酸產(chǎn)量為54.11 g/L。

表1 Plackett-Burman試驗設計與結(jié)果

圖2 七個因素的效應Pareto圖分析

表2 響應面試驗設計及結(jié)果

2.3 戊糖乳桿菌ATCC 8041最佳誘變劑量的確定

戊糖乳桿菌ATCC 8041最佳紫外誘變劑量的確定結(jié)果（圖7）顯示，隨著紫外照射時間的增加，菌體的致死率有逐漸增加的趨勢。當照射時間為40

s時，菌體的致死率為85.54%，而60 s時紫外照射的致死率為97.84%。研究表明，當致死率為80%-90%之間時，菌體的誘變效果和生存能力的比例最好，從而確定在功率20 W的紫外燈，距離35 cm照射條件下，最佳誘變劑量為40 s。

表3 方差分析及顯著性檢驗

圖3 溫度對乳酸產(chǎn)量的影響

圖4 初始pH對乳酸產(chǎn)量的影響

圖5 接種量對乳酸產(chǎn)量的影響

圖6 裝液量對乳酸產(chǎn)量的影響

圖7 Lactobacillus pentosus ATCC 8041紫外致死率曲線

2.4 高產(chǎn)乳酸突變株的選育

出發(fā)菌株經(jīng)紫外誘變后經(jīng)篩選培養(yǎng)基初篩，觀察篩選平板，正常產(chǎn)酸菌落會產(chǎn)生黃色顯色圈（圖

8-B），挑取黃色較深的90株菌落進行復篩，結(jié)果（表4）顯示，紫外誘變后正突變?yōu)?2.22%，負突變?yōu)?8.89%，38.89%的菌株沒有明顯差異。在正突變菌株中，平均產(chǎn)量提高幅度為7.4%，最大產(chǎn)量提高率達到18.84%。進一步對正突變菌株進行搖瓶發(fā)酵測乳酸產(chǎn)量進行再復篩，結(jié)果（表5）顯示，經(jīng)過再次復篩，突變株Lactic UVC-02和Lactic UVD-05產(chǎn)量較對照高15%以上。故對突變株Lactic UVC-02和Lactic UVD-05進行傳代培養(yǎng)，檢驗其遺傳穩(wěn)定性。

圖8 出發(fā)菌株和突變株菌落形態(tài)

表 4 出發(fā)菌株紫外誘變結(jié)果

表5 突變株發(fā)酵復篩結(jié)果

2.5 突變菌株的遺傳穩(wěn)定性

將突變株Lactic UVC-02進行傳代培養(yǎng)，傳代8次，測定其乳酸產(chǎn)量（每代重復5次）如表6所示。進一步對數(shù)據(jù)進行方差分析，結(jié)果見表6。由方差分析可以看出，F(xiàn) crit=2.31是α=0.05的F統(tǒng)計量臨界值，F(xiàn)=1.58是F統(tǒng)計量的計算值，1.58＜2.31，P=0.177，故數(shù)據(jù)間無顯著差異，說明突變株Lactic UVC-02遺傳穩(wěn)定性好。

表6 突變株Lactic UVC-02遺傳穩(wěn)定性及方差分析

將突變株Lactic UVD-05進行傳代培養(yǎng)，傳代8次，其乳酸產(chǎn)量如表7所示（每代重復5次）。對數(shù)據(jù)進行方差分析，見表7。由方差分析可以看出，F(xiàn) crit=2.31，是α=0.05的F統(tǒng)計量臨界值，F(xiàn)=4.64是F統(tǒng)計量的計算值，4.64＞2.31，P=0.001，數(shù)據(jù)間差異顯著，說明突變株Lactic UVD-05的遺傳穩(wěn)定性差。

表7 突變株Lactic UVD-05遺傳穩(wěn)定性及方差分析

通過對突變株Lactic UVC-02和Lactic UVD-05的遺傳穩(wěn)定性比較表明，Lactic UVC-02的穩(wěn)定性

優(yōu)于Lactic UVD-05，故確定突變株Lactic UVC-02為一株高產(chǎn)乳酸突變株，命名為戊糖乳桿菌Lactic UVC-02，由中國典型培養(yǎng)物保藏中心保存，注冊號為CCTCC M 2013209。該突變株Lactic UVC-02經(jīng)葡萄糖發(fā)酵后，乳酸產(chǎn)量達到64.17 g/L，比出發(fā)菌株（54.12 g/L）提高18.6%，為進一步利用木質(zhì)纖維發(fā)酵產(chǎn)乳酸提供了研究基礎。

3 討論

在發(fā)酵工業(yè)中，發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化對發(fā)酵水平的提高有著重大作用，而合理的試驗設計及統(tǒng)計方法的選擇在探索最佳發(fā)酵培養(yǎng)基的過程中尤為重要［19］。Plackett-Burman（P-B）法是一種以不完全平衡塊為原理的試驗設計，它能夠從眾多的過程變量中快速、有效地篩選出最為重要的幾個因素，為進一步研究提供基礎。響應面分析法是1951年Box Wilson開發(fā)的用于研究多因子系統(tǒng)中因子交互作用達到最大響應值時所對應的最佳條件，結(jié)合數(shù)學方法和統(tǒng)計分析，通過對重要因子響應過程變量進行數(shù)學建模分析，定向優(yōu)化響應因子［21］。國內(nèi)外很多學者通過P-B設計和響應面分析法在乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化方面取得了很好的成就［22-27］。本研究通過P-B設計快速有效地從7個影響乳酸產(chǎn)量的發(fā)酵培養(yǎng)基組分中篩選出3個顯著性影響組分：葡萄糖、酵母浸粉和碳酸鈣，然后利用響應面分析法中Box-Behnken設計得出最佳培養(yǎng)基組合：葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸鈣29.43 g/L、蛋白胨10 g/L、Na2HPO4·12H2O 5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO450 mg/L。在最佳培養(yǎng)基組合下，乳酸產(chǎn)量達到54.11 g/L，與預測值擬合較好。說明運用響應面法優(yōu)化戊糖乳桿菌ATCC8041發(fā)酵產(chǎn)乳酸是合理可靠的。

微生物誘變育種是指利用各種誘變劑處理微生物細胞，以提高其基因突變頻率，再通過適當?shù)暮Y選方法獲得所需的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的育種方法，誘變育種的速度快、成本低、耗時短、方法簡便，是一種高效的菌株選育方法。其中的紫外線輻射方法更具有操作簡便，經(jīng)濟實惠，對實驗室條件要求低，且出現(xiàn)正突變的幾率較高，誘變的效果好，是一種非常實用的誘變劑［28］。在微生物發(fā)酵產(chǎn)乳酸方面，利用紫外誘變篩選優(yōu)良菌株也取得了良好的效果。仲松等［29］以干酪乳桿菌ZZ-L為出發(fā)菌株，對其原生質(zhì)體進行紫外誘變，篩選得到一株比原始菌株乳酸產(chǎn)量高20.7%的高產(chǎn)突變菌株ZZ-06。吳慧昊等［30］使用紫外照射和亞硝基胍復合誘變的方法選育出一株在低溫下生長良好、遺傳性狀穩(wěn)定的菌株Q1-4-6。Yin等［31］采用紫外和亞硝基胍復合誘變的方法得到突變株Rhizopus oryzae LA-UN-1，乳酸產(chǎn)量達到59.5 g/L，比原始菌株提高54.5%。本研究以能同時利用六碳糖和五碳糖的戊糖乳桿菌ATCC 8041為出發(fā)菌，制備了原生質(zhì)體，并對其原生質(zhì)體懸液進行紫外誘變，期望獲得能利用木質(zhì)纖維水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸的高產(chǎn)突變株。突變體經(jīng)過初篩、復篩等一系列過程篩選出乳酸產(chǎn)量較高的2個菌株：Lactic UVC-02與Lactic UVD-05，對其進行了8代繼代培養(yǎng)檢測其遺傳穩(wěn)定性，其中突變株Lactic UVC-02遺傳穩(wěn)定性較好，各代之間無顯著差異。突變株菌落形態(tài)與原始菌株也出現(xiàn)一定程度的差異，引起這種差異的原因還需進一步在分子水平進行分析研究。由于木質(zhì)纖維原材料處理過程復雜且周期較長，目前我們已初步得出突變株Lactic UVC-02能利用楊木水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸，但暫時還未能完全驗證該突變株是否能高效利用木質(zhì)纖維水解液發(fā)酵產(chǎn)乳酸，這也是我們下一步工作的研究重點。

4 結(jié)論

戊糖乳桿菌ATCC 8041發(fā)酵產(chǎn)乳酸的最佳發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件組合為：葡萄糖93.11 g/L、酵母浸粉5.19 g/L、碳酸鈣29.43 g/L、蛋白胨10.00 g/L、Na2HPO4·12H2O 5.00 g/L、MgSO40.20 g/L、MnSO450 mg/L；最佳發(fā)酵條件為溫度37℃、pH6.5、接種量6%、裝液量80%。進一步對戊糖乳桿菌ATCC8041進行原生質(zhì)體誘變得到高產(chǎn)突變株Lactic UVC-02，保存在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（注冊號：CCTCC M 2013209），其乳酸產(chǎn)量達到64.17 g/L，比原始菌株產(chǎn)量提高了18.6%。

［1］曹本昌, 徐建林, 匡群.根霉發(fā)酵L-乳酸［J］.食品與發(fā)酵工業(yè), 1991（1）：37-41.

［2］金其榮, 金豐收. 乳酸衍生物發(fā)展應用新動向［J］. 山西食品

工業(yè), 2002, 3：2-4.

［3］錢志良, 胡軍, 雷肇祖. 乳酸的工業(yè)化生產(chǎn)應用和市場［J］.工業(yè)微生物, 2001（6）：49-54.

［4］曾煒, 陳豐秋, 詹曉力. 乳酸的生產(chǎn)技術(shù)及其研究進展［J］.化工進展, 2006, 25（7）：746-747.

［5］張剛, 乳酸細菌——基礎、技術(shù)和應用［M］. 北京：化學工業(yè)出版社, 2007.

［6］樂曉潔, 王昌祿, 顧曉波, 等. 細菌發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸高產(chǎn)菌株的選育［J］. 中國食品添加劑, 2004, 1：67-69.

［7］鄭艷, 薛景珍, 劉長江. L-乳酸發(fā)酵菌株的選育［J］. 微生物學雜志, 2004, 24（3）：26-28.

［8］張秀鳳, 李正英, 江均平. 細菌L-乳酸發(fā)酵的研究［J］. 食品與機械, 2005, 21（5）：74-76.

［9］白冬梅, 趙學明, 胡宗定. 反相HPLC雙檢測器法同時測定米根霉乳酸發(fā)酵液中的有機酸與葡萄糖［J］. 食品與發(fā)酵工藝, 2001, 27（1）：13-17.

［10］付曉芬, 江均平, 張潔, 等. 微生物利用木糖發(fā)酵L—乳酸代謝途徑的研究［J］. 食品工業(yè)科技, 2009（8）：359-362.

［11］Masayuki T, Masahiro H, Tanabe S, et al. Production of L-lactic acid by simultaneous saccharification and fermentation using unsterilized defatted rice bran as a carbon source and nutrient components［J］. Food Sci Technol Res, 2005, 11：400-406.

［12］Zhu Y, Lee YY, Elander RT. Conversion of aqueous ammoniatreated corn stover to lactic acid by simultaneous saccharification and co-fermentation［J］. Appl Biochem Biotechnol, 2007（1-12）：137-140.

［13］Bustos G, Moldes AB, Cruz JM, et al. Production of fermentable media from trimming wastes and bioconversion into lactic acid by Lactobacillus pentosus［J］. Journal of the Science of Food and Agriculture, 2004, 84：2105-2112.

［14］張麗麗, 沈兆兵, 史吉平, 等. 紫外誘變和丁醇馴化復合選育高產(chǎn)丁醇菌株［J］. 中國釀造, 2013, 32（5）：129-133.

［15］Bustos G, Moldes AB, Cruz JM, et al. Influence of the metabolism pathway on lactic acid production from hemicellulosic trimming vine shoots hydrolyzates using Lactobacillus pentosus［J］. Biotechnol Prog, 2005, 21：793-798.

［16］楊承劍, 黃興國, 等. Plackett-Burman設計在益生菌生長主要影響因子篩選中的應用［J］. 飼料工業(yè), 2007, 28（16）：31-33.

［17］Pan CM, Fan YT, Xing Y, et al. Statistical optimization of process parameters on biohydrogen production from glucose by Clostridium sp. Fanp2［J］. Bioresour Technol, 2008, 99（8）：3146-3154.

［18］Yuan LL, Li YQ, Wang Y, et al. Optimization of critical medium components using response surface methodology for phenazine-1-carboxylic acid production by Pseudomonas sp. M-18Q［ J］. J Biosci Bioeng, 2008, 105（3）：232-237.

［19］代志凱, 張翠, 阮征. 試驗設計和優(yōu)化及其在發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)化中的應用［J］. 微生物學報, 2010, 37（6）：894-903.

［20］白冬梅, 趙學明, 胡宗定. 高效液相色譜手性流動相添加劑分離乳酸對應體［J］. 分析化學, 2001, 29（4）：413-415.

［21］田泱源, 李瑞芳. 響應面法在生物過程優(yōu)化中的應用［J］. 食品工程, 2010（2）：8-11.

［22］潘麗軍, 龐銳, 吳學鳳, 等. 葡萄糖和木糖共發(fā)酵生產(chǎn)L-乳酸的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件響應面優(yōu)化［J］. 食品科學, 2011, 32（9）：140-145.

［23］丁涓, 魏敏, 張莉. 玉米漿發(fā)酵生產(chǎn) L-乳酸的工藝優(yōu)化［J］.食品科學, 2011, 32（1）：127-130.

［24］秦浩. 高產(chǎn)L-乳酸菌株的選育及其發(fā)酵條件的研究［D］. 無錫：江南大學, 2012.

［25］Naveena BJ, Altaf M, Bhadriah K, et al. Selection of medium components by Plackett-Burman design for production of l（+）lactic acid by Lactobacillus amylophilus GV6 in SSF using wheat bran［J］. Bioresource Technology, 2005, 96（4）：485-490.

［26］Coelho LF, De Lima CJB, Rodovalho CM, et al. Lactic acid production by new Lactobacillus plantarum LMISM6 grown in molasses：optimization of medium composition［J］. Brazilian Journal of Chemical Engineering, 2011, 28（1）：27-36.

［27］Gowdhaman D, Sugumaran KR, Ponnusami V. Optimization of lactic acid production from tea waste by Lactobacillus plantarum MTCC 6161 in solid state fermentation by central composite design［J］. Inter J Chemtech Res, 2012, 4（1）：143-148.

［28］石彩蕊, 王義強, 陳介南, 等. 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶微生物育種研究進展［J］. 生物技術(shù)通報, 2011（3）：59-65.

［29］仲松, 張慶慶, 孫平平. 紫外誘變原生質(zhì)體選育高產(chǎn)L-乳酸菌株的研究［J］. 安徽工程大學學報, 2011, 26（1）：28-30.

［30］吳慧昊, 牛鋒. 乳酸菌低溫菌株的復合誘變選育［J］. 微生物學通報, 2013, 40（4）：631-645.

［31］Yin L, Ruan Q, Fu Y. Strain improvement of Rhizopus oryzae for over-production of lactic acid by random mutations［J］. African Journal of Microbiology Research, 2013, 7（23）：2970-2975.

（責任編輯 馬鑫）

Lactobacillus pentosus Fermentation Lactic Acid Production and High Yield Strain Mutation Breeding

Wang Yiqiang1，2，3Wang Qiye1Ma Guohui1Lin Liyun1
（1. Biotechnology Laboratory of Central South University of Forestry and Technology，Changsha 410004；2. Key Lab of Non-wood Forest Nurturing and Protection of National Ministry of Education，Changsha 410004；3. Bio-ethanol Research Center of State Forestry Administration，Changsha 410004）

Lactobacillus pentosus is a potential strain which can make use of the lignocellulose hydrolysate fermentation to produce lactic acid, optimization of fermentation conditions and the breeding of high yield strain are the important means to improve lactic acid production. Fermentation medium and fermentation conditions were optimized for strain Lactobacillus pentosus ATCC 8041, through single factor experiment, Plackett-Burman design and response surface experiment. The results showed that the best combination of fermentation medium is 93.11 g/L glucose, 5.19 g/L yeast powder, 29.43 g/L calcium carbonate, 10.00 g/L peptone, 5.00 g/L Na2HPO4·12H2O, 0.20 g/L MgSO4, 50 mg/L MnSO4. The best fermentation conditions is temperature 37℃, pH6.5, quantity of 6%, and fluid amount 80%. The lactic acid production is 54.12 g/L under the optimized fermentation medium and fermentation conditions. And then, Lactobacillus pentosus ATCC 8041 was taken as the original strain, treated with UV mutation ATCC 8041 protoplast, after through multiple screening, finally we have got a mutant which has high lactic acid production, named Lactobacillus pentosus lactic UVC-02 which conserved in China Center for Type Culture Collection, registration number for CCTCC M 2013209. The results for glucose fermentation showed that lactic UVC-02 produced 64.17 g/L lactic acid, which was 18.6% higher than the original strain.

Lactobacillus pentosus Lactic acid fermentation UV mutation Response surface experiment

2014-03-27

國家林業(yè)局“948“項目（2011-4-13）

王義強，男，教授，博士生導師，研究方向：細胞工程與生物能源；E-mail：wangyiqiang12@163.com