熒光光譜法研究左氧氟沙星、拉米夫定同時與牛血清白蛋白的相互作用

胡 威，付彩霞，黃玉玲

（濱州醫(yī)學(xué)院化學(xué)教研室，山東煙臺264000）

左氧氟沙星（LVFX），具有廣譜抗菌作用，毒性小，療效高，是目前臨床上廣泛應(yīng)用的新一代喹諾酮類藥物，通過抑制細菌DNA旋轉(zhuǎn)酶和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ活性，阻止細菌DNA的合成和復(fù)制。拉米夫定（LMVD），是新一代核苷類抗病毒藥，強烈抑制逆轉(zhuǎn)錄酶活性，在細胞內(nèi)經(jīng)磷酸化后與脫氧胞嘧啶核苷（dCTP）競爭，摻入合成的DNA鏈中，使病毒不能繼續(xù)延伸而終止復(fù)制［1－2］。

作者在此采用熒光光譜法研究左氧氟沙星和拉米夫定同時與牛血清白蛋白的相互作用，擬為臨床合理用藥提供指導(dǎo)［3－4］。

1 實驗

1.1 試藥與儀器

牛血清白蛋白第五組分，上海生物工程有限公司；拉米夫定，杭州創(chuàng)世紀醫(yī)藥科技有限公司；左氧氟沙星，浙江醫(yī)藥股份有限公司新昌制藥廠；三羥甲基氨基甲烷（Tris），北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；0.1mol ·L－1NaCl水溶液，煙臺中環(huán)化學(xué)試劑有限公司。

KQ－600TDE型超聲波清洗儀，昆山舒美超聲儀器有限公司；AR1140型電子分析天平，ohaus，corp.pineBrook Nj USA；LS55型熒光／磷光／發(fā)光分光光度計，美國Perkin－Elmer公司；比色管（10mL）。

1.2 方法

1.2.1 2種藥物分別對BSA的相互作用

準確配制濃度為1.0×10－6mol·L－1的BSA的Tris－HCl溶液25mL，靜置，取3mL轉(zhuǎn)移至石英比色皿中，以微量注射器加入10μL的拉米夫定或左氧氟沙星，旋渦混勻。設(shè)定熒光激發(fā)波長為280nm，在300～550nm范圍內(nèi)掃描熒光光譜，分別討論2種藥物對BSA的熒光猝滅作用（以空白的BSA溶液熒光強度為F0）。

1.2.2 2種藥物共同對BSA的相互作用

準確量取7.5mL 1.0×10－6mol·L－1的BSA的Tris－HCl溶液和10μL 1.0×10－4mol·L－1的LVFX溶液于25mL容量瓶中，定容后靜置。取3mL轉(zhuǎn)移至石英比色皿中，用微量注射器加入一定量的LMVD（加入后混合均勻并靜置30min），使其濃度（×10－6mol·L－1）為0、1、2、3、4、5、6。討論LVFX存在時，LMVD對BSA的熒光猝滅作用（以未加LMVD的BSA－LVFX溶液的熒光強度為F0）。

同理，討論LMVD存在時，LVFX對BSA的熒光猝滅作用。

2 結(jié)果與討論

2.1 熒光猝滅光譜

BSA－LVFX、BSA－LMVD、BSA－LVFX－LMVD、BSA－LMVD－LVFX 4種體系的熒光猝滅光譜如圖1所示。

圖1 BSA－LVFX（a），BSA－LMVD（b）、BSA－LVFX－LMVD（c）、BSA－LMVD－LVFX（d）4種體系的熒光猝滅光譜Fig.1 Quenching fluorescence spectra of four kinds of systems BSA－LVFX（a），BSA－LMVD（b），BSA－LVFX－LMVD（c），BSA－LMVD－LVFX（d）

由圖1可看出，左氧氟沙星／拉米夫定的加入使BSA的熒光光譜發(fā)生了劇烈的猝滅作用，這種作用在左氧氟沙星／拉米夫定溶液一開始加入時就可以觀察到，表明BSA的1個高親和結(jié)合位點位于色氨酸殘基的附近。當以280nm波長進行激發(fā)時，BSA在350 nm附近有最大發(fā)射峰，隨著左氧氟沙星／拉米夫定的加入可以觀察到典型的熒光猝滅行為。在混合體系中同樣可以觀察到強烈的熒光猝滅行為。

2.2 熒光猝滅機制

熒光猝滅可分為靜態(tài)猝滅和動態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是激發(fā)態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子之間的相互碰撞而導(dǎo)致的熒光猝滅。靜態(tài)猝滅是基態(tài)的熒光分子與猝滅劑分子通過弱的結(jié)合形成復(fù)合物，并吸收熒光分子發(fā)出的熒光，形成的復(fù)合物隨著體系溫度的升高會逐漸分解，靜態(tài)猝滅效應(yīng)逐漸降低。靜態(tài)猝滅可用下式描述：

式中：F0、F分別為無、有猝滅劑時的熒光強度；Ks為靜態(tài)猝滅常數(shù)；c為小分子猝滅劑的游離濃度。

假設(shè)左氧氟沙星、拉米夫定對BSA熒光的猝滅是動態(tài)猝滅，則應(yīng)滿足Stern－Volmer猝滅方程［5］：

式中：Kq為雙分子猝滅過程速率常數(shù)；τo為生物大分子的平均熒光壽命，10－8s；KSV為Stern－Volmer動態(tài)猝滅常數(shù)。

根據(jù)式（2），對4種體系進行線性擬合，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，4種體系中藥物與BSA相互作用的線性相關(guān)系數(shù)分別為0.9993、0.9993、0.9917、0.9995，線性關(guān)系較好。

根據(jù)擬合結(jié)果，繪制BSA－LVFX、BSA－LMVD、BSA－LVFX－LMVD、BSA－LMVD－LVFX 4種體系的Stern－Volmer曲線，如圖2所示。

圖2 BSA－LVFX（a）、BSA－LMVD（b）、BSA－LVFX－LMVD（c）、BSA－LMVD－LVFX（d）4種體系熒光猝滅的Stern－Volmer曲線Fig.2 Stern－Volmer Curves for fluorescence quenching of four kinds of systems BSA－LVFX（a），BSA－LMVD（b），BSA－LVFX－LMVD（c），BSA－LMVD－LVFX（d）

計算表明，左氧氟沙星、拉米夫定對BSA的熒光猝滅速率常數(shù)Kq值（表1）遠遠大于各類猝滅劑對生物大分子的最大動態(tài)熒光猝滅速率常數(shù)2.0×1010L ·mol－1·s－1，證實了原假設(shè)不成立，猝滅過程應(yīng)為形成復(fù)合物引起的靜態(tài)猝滅。

2.3 結(jié)合常數(shù)與結(jié)合位點數(shù)

馮喜增等［6］推導(dǎo)出靜態(tài)猝滅中熒光強度與猝滅劑的關(guān)系：

lg［（F0－F）／F］和lgc成正比關(guān)系，根據(jù)式（3）求出左氧氟沙星、拉米夫定與BSA的結(jié)合常數(shù)KA及結(jié)合位點數(shù)n，如表1所示。

表1 左氧氟沙星、拉米夫定與BSA的猝滅反應(yīng)參數(shù)Tab.1 Quenching parameters of BSA reaction with LVFX，LMVD

由表1可知：（1）結(jié)合位點數(shù)均約為1；（2）左氧氟沙星KA是拉米夫定KA的3.5倍，說明左氧氟沙星與BSA結(jié)合能力大于拉米夫定與BSA的結(jié)合能力；（3）藥物混合體系中，拉米夫定存在時左氧氟沙星與BSA結(jié)合常數(shù)KA是藥物單體左氧氟沙星的KA的8.3倍，表明拉米夫定使左氧氟沙星與BSA的結(jié)合穩(wěn)定性增強，游離的左氧氟沙星減少；同理，左氧氟沙星存在時拉米夫定與BSA的結(jié)合常數(shù)KA是藥物單體拉米夫定的KA的13.57倍，表明左氧氟沙星的存在也使拉米夫定與BSA的結(jié)合穩(wěn)定性增強，游離的拉米夫定減少。

3 結(jié)論

應(yīng)用熒光光譜法研究了左氧氟沙星和拉米夫定同時與BSA的相互作用。結(jié)果表明，2種藥物對BSA的熒光都存在靜態(tài)猝滅作用；當2種藥物共存時，一種藥物會使另一種藥物與BSA的結(jié)合穩(wěn)定性提高，游離藥物含量減少，藥效降低。

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