穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b對乳腺癌MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

湯鋒，楊玨，李潤樂，格日力，奚濤**

(1. 青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810016；2. 中國藥科大學(xué)生物技術(shù)中心，江蘇 南京 210009；3. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧810016）

穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b對乳腺癌MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響

湯鋒1,2，楊玨2，李潤樂1,3，格日力1*，奚濤2**

(1. 青海大學(xué)高原醫(yī)學(xué)研究中心，青海 西寧 810016；2. 中國藥科大學(xué)生物技術(shù)中心，江蘇 南京 210009；3. 青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧810016）

目的：通過構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)miR-125b的真核表達(dá)載體以探討miR-125b對乳腺癌MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。方法：構(gòu)建重組質(zhì)粒pSilencer 4.1-miR-125b并轉(zhuǎn)染MCF-7細(xì)胞，通過G418篩選得到穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7-miR-125b，并結(jié)合二維劃痕愈傷實驗、三維Transwell侵襲小室實驗和集落形成實驗考察過表達(dá)miR-125b對乳腺癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移能力的影響。結(jié)果：成功獲得了穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7-miR-125b，其在二維和三維水平的遷移能力均明顯強(qiáng)于MCF-7細(xì)胞，細(xì)胞新生克隆數(shù)較MCF-7亦有顯著提高。結(jié)論：miR-125b可使乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)。

miR-125b；真核表達(dá)載體；乳腺癌；細(xì)胞轉(zhuǎn)移

近年來，乳腺癌發(fā)病率呈不斷升高的趨勢，嚴(yán)重威脅著女性健康。腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移是影響癌癥患者生活質(zhì)量和導(dǎo)致死亡的重要原因之一[1-2]，深入探索腫瘤的轉(zhuǎn)移機(jī)制及尋找轉(zhuǎn)移相關(guān)的靶點已成為癌癥治療的重要手段。MicroRNA（miRNA）是一種長度約18～26 bp的單鏈小分子RNA，是由具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的約70～90 bp的單鏈RNA前體經(jīng)過Dicer酶加工后生成，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控靶基因的表達(dá)[3]。近來研究表明，miRNA在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要的作用，其中miR-373、miR-21、miR-10b和miR-200c等均與乳腺癌轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[4-9]。

miR-125b與線蟲lin-4具有很強(qiáng)的同源性，位于染色體11q24并在細(xì)胞分化中扮演著重要的角色[10-11]。筆者所在課題組的前期研究結(jié)果顯示，miR-125b與乳腺癌轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)且在體外具有促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDAMB-231遷移、提高其侵襲能力的功能[12]。

構(gòu)建長效表達(dá)miR-125b的載體對于在體內(nèi)外水平研究miR-125b對細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響是至關(guān)重要的，這也是現(xiàn)階段該方面研究的瓶頸。筆者所在課題組首先設(shè)計并構(gòu)建過表達(dá)miR-125b的pSilencer 4.1-miR-125b重組質(zhì)粒，經(jīng)宿主菌擴(kuò)增、酶切、測序鑒定后轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細(xì)胞，通過G418篩選建立穩(wěn)定表達(dá)miR-125b的MCF-7細(xì)胞系，并以實時定量PCR（qRT-PCR）進(jìn)行驗證。最后通過細(xì)胞劃痕-修復(fù)實驗、侵襲小室及單克隆形成實驗考察過表達(dá)miR-125b對乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的影響。

1 實驗材料

乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和pSilencer 4.1-CMV Expression Vectors為本實驗室保存；1640培養(yǎng)基、小牛血清，購自Gibico公司；Transwell 侵襲小室（批號：3401），購自美國Corning公司；Hind Ⅲ限制性內(nèi)切酶（批號：1060A）、Bam HI限制性內(nèi)切酶（批號：1010A）、T-4連接酶（批號：2011A）、Taq plus DNA聚合酶（批號：1189A），購自Takara公司；E.coli. DH5α感受態(tài)細(xì)胞、質(zhì)粒提取試劑盒（批號：DP103）、DNA片段凝膠回收試劑盒（批號：DP209）、PCR產(chǎn)物純化試劑盒，購自TIANGEN公司；氨芐青霉素（Amp）、G418，購自上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限責(zé)任公司；miR-125b-primer、U6-primer、EzOmicsTM SYBR qPCR Kit，購自百奧邁科生物技術(shù)有限公司（Biomics）；Trizol試劑盒（批號：15596-026），購自Invitrogen公司。

2 方法

2.1 PCR擴(kuò)增獲得人miR-125b基因

MCF-7細(xì)胞用含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、100%濕度條件下培養(yǎng)至70%～90%匯合度時，提取基因組DNA，并以其為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

根據(jù)pre-miR-125b序列設(shè)計引物，上游引物P1為5′-CGCGGATCCAACATTGTTGCGCTCCTCTCA-3′； 下 游引 物P2為5′-CCCAAGCTTTTCCAGGATGCAAAAGCAC GA-3′。分別引入了BamH I和HindⅢ酶切位點。以從MCF-7細(xì)胞中提取的基因組DNA為模板擴(kuò)增pre-miR-125b序列。

2.2 重組質(zhì)粒pSilencer 4.1-miR-125b的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增得到的pre-miR-125b基因片段切膠回收后，同時與質(zhì)粒pSliencer 4.1一起進(jìn)行BamH I和HindⅢ雙酶切，然后用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化酶切產(chǎn)物，在T4連接酶作用下4 ℃連接過夜。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH 5α并保存，利用Amp抗性篩選陽性克隆，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切驗證，進(jìn)一步通過測序確定序列及連接方向的正確性。

2.3 穩(wěn)定表達(dá)pre-miR-125b的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7-miR-125b的建立

用0.125%的胰酶消化MCF-7細(xì)胞，血球計數(shù)板計數(shù)，按每孔1.5×103個接種至96孔培養(yǎng)板，次日換含有不同劑量G418（0、50、100、200、400、600和800 mg·L-1）的培養(yǎng)基培養(yǎng)，每個劑量平行6份。每隔3 d更換一次含G418的培養(yǎng)基，培養(yǎng)至第15 d時，通過倒置顯微鏡觀察，選擇可以完全殺死MCF-7細(xì)胞所需的最小劑量，再略微增加，用作后續(xù)轉(zhuǎn)染時的篩選劑量。

轉(zhuǎn)染24 h后將細(xì)胞以1∶10比例傳代，次日開始用含有適當(dāng)濃度G418的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選培養(yǎng)，每3 d更換一次培養(yǎng)基，連續(xù)篩選3周，然后將獲得的細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，通過實時熒光PCR方法檢測miR-125b表達(dá)情況，留取表達(dá)量最高的細(xì)胞克隆作為以后研究之用，并將其命名為MCF-7-miR-125b細(xì)胞。

2.4 實時PCR檢測miR-125b

2.4.1 細(xì)胞總RNA的提取 細(xì)胞用含有10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基在37 ℃、5% CO2、100%濕度條件下培養(yǎng)至70%～90%匯合度時，采用Trizol法提取總RNA，并用Dnase I（Rnase Free）處理以去除可能殘余的基因組DNA。取5 μL RNA樣品加DEPC-ddH2O定容至1 mL，測定OD260及OD280以判斷總RNA的純度，并以O(shè)D260計算總RNA含量。具體操作按Trizol試劑盒說明書（Invitrogen）中步驟進(jìn)行。

2.4.2 逆轉(zhuǎn)錄合成miR-125b-cDNA第一鏈 在EP管(RNase-free)中加入2 μL總RNA、8 μL DEPC水稀釋，各取1 μL U6引物、miR-125b逆轉(zhuǎn)錄頸環(huán)引物、1 μL MLV逆轉(zhuǎn)錄酶、10 μL 5×MLV緩沖液，以DEPC水補(bǔ)至50 μL。逆轉(zhuǎn)錄條件為：30 ℃ 10 min，42℃ 1 h，95 ℃ 10 min。

2.4.3 實時PCR檢測miR-125b表達(dá)水平 選用U6RNA作為內(nèi)參照，通過實時PCR法對miR-125b進(jìn)行相對定量。使用EzOmics SYBR qPCR kits試劑盒擴(kuò)增miR-125b，25 μL反應(yīng)體系。反應(yīng)條件為95℃ 5 min，95 ℃ 30 s，61℃ 30 s (30個循環(huán))，72 ℃ 10 min。以△△Ct法計算miR-125b相對表達(dá)差異，計算公式為：其中，“NC”指正常MCF-7細(xì)胞系。

2.5 二維水平細(xì)胞遷移實驗

參考Xu等[13]的實驗方法，采用劃痕損傷模型分析對比miR-125b表達(dá)水平改變后乳腺癌細(xì)胞系MCF-7和MDA-MB-231在二維水平遷移能力的差異。具體操作步驟如下：

1）用0.125%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按每孔6×104個接種到24孔培養(yǎng)板中，于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；

2）次日，待細(xì)胞長成均勻單層后，用無菌的10 μL移液器吸頭沿孔的中軸線輕輕劃過。用37 ℃預(yù)熱的PBS輕輕洗滌2～3遍，除去漂起的細(xì)胞殘骸，然后加入37 ℃預(yù)熱的培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；

3）培養(yǎng)0.5～1 h待細(xì)胞恢復(fù)后，以這一時間作為零時間點，分別在0、12和24 h時在倒置顯微鏡下（50×）觀察細(xì)胞遷移情況并利用目鏡刻度尺測量劃痕寬度（S），每孔測量5處（即兩端、中點、左1/4處和右1/4處）求平均值，直至細(xì)胞完全匯合。每組細(xì)胞均設(shè)3個平行孔。

2.6 Transwell小室侵襲實驗

參考Chen等[14]的實驗方法，具體操作步驟如下：

1）將細(xì)胞用無血清1640或L-15培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h后，用0.125%胰蛋白酶消化、無血清1640或L-15培養(yǎng)基制備單細(xì)胞懸液，調(diào)整濃度為每毫升2.5×105個；

2）向24孔培養(yǎng)板中加入600 μL含10%小牛血清的1640或L-15培養(yǎng)基，然后將Transwell侵襲小室浸入，再向小室中加入200 μL無血清單細(xì)胞懸液（即5.0×104個細(xì)胞）；

3）37 ℃、5% CO2培養(yǎng)20 h后，取出Transwell小室，用棉簽小心擦拭，將膜上表面的細(xì)胞去除；

4）用手術(shù)刀片小心沿小室邊緣將膜切下，把膜下表面向上放在一個潔凈的24孔培養(yǎng)板的孔中；

5）將膜用甲醇∶冰醋酸（3∶1）固定10 min，然后用10%結(jié)晶紫染液染色15～30 min；

6）將膜用蒸餾水漂洗干凈后在倒置顯微鏡下（200×）隨機(jī)選取6個視野（上、下、左、右各1個，中間2個）計數(shù)細(xì)胞。

2.7 軟瓊脂集落形成實驗

1）取對數(shù)生長期細(xì)胞，用0.25%胰蛋白酶消化并輕輕吹打，使之成為單細(xì)胞，作活細(xì)胞計數(shù)，用含20%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞密度至每毫升1×106細(xì)胞。然后根據(jù)實驗要求作梯度倍數(shù)稀釋。

2）用蒸餾水分別制備出1.2%和0.7%這2個濃度的低熔點瓊脂糖液，高壓滅菌后，維持在40 ℃中不會凝固。

3）按1∶1比例使1.2%的瓊脂糖和2×RPMI 1640 (含有2×抗生素和20%的小牛血清)混合，然后取1.5 mL混合液注入6孔板中，冷卻凝固，作為底層瓊脂置CO2溫箱中備用。

4）按1∶1比例使0.7%的瓊脂糖和2×RPMI 1640培養(yǎng)基在無菌試管中混合，再向管中加入0.2 mL的細(xì)胞懸液，充分混勻，注入底層鋪有1.2%瓊脂糖的平板，使其形成雙瓊脂層。待上層瓊脂凝固后，置入37 ℃、5% CO2溫箱中培養(yǎng)10 ～ 14 d。

5）將平皿放置在倒置顯微鏡下，觀察細(xì)胞克隆數(shù)，并拍照。

2.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

實驗結(jié)果以x±s表示（n=3），采用t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計分析。*P＜0.05，認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)顯著差異；**P＜0.01，認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)極顯著差異。

3 結(jié)果

3.1 重組質(zhì)粒pSilencer 4.1-miR-125b雙酶切鑒定

重組質(zhì)粒pSilencer 4.1-miR-125b經(jīng)HindⅢ和BamH I雙酶切后，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見2個條帶，其中110 bp處為pre-miR-125b基因，5073 bp處為載體片段（見圖1），表明載體構(gòu)建成功。

圖1 重組質(zhì)粒pSilencer 4.1-miR-125b的HindⅢ和BamHI雙酶切鑒定結(jié)果Figure 1 Identification result of recombinant plasmid pSilencer 4.1-miR-125b by BamHI and HindⅢ digestion

3.2 PCR鑒定重組質(zhì)粒pSilencer 4.1-miR-125b

重組質(zhì)粒pSilencer 4.1-miR-125b經(jīng)PCR擴(kuò)增后，經(jīng)2%的瓊脂糖凝膠電泳觀察，可見110 bp處的目的條帶（見圖2），表明載體構(gòu)建成功。PCR擴(kuò)增結(jié)果和酶切正確的質(zhì)粒送上海生物工程技術(shù)有限公司測序。

圖2 重組質(zhì)粒pSilencer 4.1-miR-125b的PCR鑒定結(jié)果Figure 2 Identification result of recombinant plasmid pSilencer 4.1-miR-125b by PCR

3.3 重組質(zhì)粒pSilencer 4.1-miR-125b的測序

進(jìn)一步的測序分析結(jié)果證實，pSilencer 4.1多克隆位點（Bam HI和 Hind Ⅲ酶切位點之間）有110 bp的插入片段，其序列和方向與pre-miR-125b序列一致（見圖3），表明miR-125b表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒命名為pSilencer 4.1-miR-125b。

圖3 重組質(zhì)粒pSilencer 4.1-miR-125b的部分測序結(jié)果Figure 3 Partial sequencing results of recombinant plasmids pSilencer 4.1-miR-125b

3.4 MCF-7-miR-125b乳腺癌細(xì)胞中miR-125b表達(dá)水平的研究

最終確定MCF-7篩選劑量為600 mg·L-1。通過實時定量PCR檢測穩(wěn)定表達(dá)pSilencer 4.1-miR-125b的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7-miR-125b中的miR-125b表達(dá)水平，結(jié)果顯示，MCF-7-miR-125b中miR-125b表達(dá)量較MCF-7細(xì)胞提高了13.06倍，表明，穩(wěn)定表達(dá)pSilencer 4.1-miR-125b的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7-miR-125b構(gòu)建成功（見圖4）。

圖4 乳腺癌細(xì)胞MCF-7和MCF-7-miR-125b中miR-125b的表達(dá)水平Figure 4 Expression of miR-125b in brest cancer cells MCF-7 and MCF-7-miR-125b

3.5 miR-125b對細(xì)胞二維水平遷移能力的影響

通過劃痕損傷模型分析穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7在二維水平上的遷移能力，結(jié)果顯示：在劃痕損傷36 h后，穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b的MCF-7細(xì)胞的遷移能力較miR-125b低表達(dá)的MCF-7細(xì)胞提高了2.3倍（見圖5）。

圖5 MCF-7-miR-125b和MCF-7二維水平遷移能力的比較Figure 5 Comparison of migration ability between MCF-7-miR-125b and MCF-7 on 2D level

3.6 miR-125b對細(xì)胞三維水平侵襲能力的影響

通過侵襲小室模型分析了穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b對MCF-7細(xì)胞三維水平遷移能力的影響。結(jié)果顯示，MCF-7-miR-125b細(xì)胞從Transwell侵襲小室上室穿過8 μm孔徑的PET膜遷移到下室的細(xì)胞數(shù)目顯著增多（見圖6），表明miR-125b能夠顯著增強(qiáng)細(xì)胞在三維水平上的侵襲能力。

圖6 MCF-7-miR-125b和MCF-7三維水平遷移能力的比較Figure 6 Comparison of migration ability between MCF-7-miR-125b and MCF-7 on 3D level

3.7 miR-125b對MCF-7細(xì)胞集落形成能力的影響

通過軟瓊脂糖集落形成實驗考察了穩(wěn)定過表達(dá)miR-125b對MCF-7細(xì)胞集落形成能力的影響。結(jié)果顯示，MCF-7-miR-125b細(xì)胞形成新生克隆數(shù)較MCF-7有顯著的提高（見圖7），表明上調(diào)miR-125b表達(dá)水平可以促進(jìn)MCF-7細(xì)胞形成新生克隆的能力。

圖7 miR-125b對MCF-7細(xì)胞集落形成的影響Figure 7 The effect of miR-125b on tumor cell clone formation

4 討論

miRNA具有多種多樣的生物學(xué)功能，與許多疾病的發(fā)生和發(fā)展有著密切關(guān)系，它主要是在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控基因的表達(dá)。人們在研究miRNA的作用時，大多使用合成的miRNA進(jìn)行轉(zhuǎn)染，但RNA有不穩(wěn)定、易降解、保存條件要求高、半衰期短等許多不足之處，轉(zhuǎn)染RNA后也難以獲得穩(wěn)定的細(xì)胞株用于進(jìn)一步的功能研究。利用原始miRNA（pre-miRNA）構(gòu)建表達(dá)載體則能夠克服上述缺點。此外，pre-miRNA保留了每個miRNA獨(dú)自的原始天然雙臂結(jié)構(gòu)，使其在真核細(xì)胞中表達(dá)后不影響miRNA的功能，可以說，構(gòu)建pre-miRNA或miRNA前體(pri-miRNA)表達(dá)載體，是目前miRNA過表達(dá)研究的主要方法。

先前有研究證實瞬時轉(zhuǎn)染miR-125b-mimics能上調(diào)MCF-7細(xì)胞中miR-125b表達(dá)水平且可以促進(jìn)MCF-7細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力[12]。本實驗構(gòu)建了可穩(wěn)定表達(dá)miR-125b的pSilencer 4.1載體并通過G418篩選獲得了穩(wěn)定表達(dá)miR-125b的乳腺癌細(xì)胞系MCF-7-miR-125b，然后通過二維劃痕愈傷實驗、三維Transwell侵襲小室實驗、集落形成實驗進(jìn)一步證實了miR-125b具有促進(jìn)乳腺癌轉(zhuǎn)移的能力。筆者所在課題組主要研究miR-125b在轉(zhuǎn)錄后調(diào)控乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制，曾考慮用合成的miR-125b-mimics瞬時轉(zhuǎn)染細(xì)胞，但mimics的半衰期較短，不適合進(jìn)行長期藥理學(xué)實驗研究；而質(zhì)粒載體pSilencer 4.1-CMV neo具有強(qiáng)啟動子CMV，這種啟動子適合操縱miRNA的表達(dá)，且pSilencer 4.1-CMV neo具有新霉素抗性，便于轉(zhuǎn)染后穩(wěn)定表達(dá)miR-125b細(xì)胞的篩選，另外質(zhì)粒載體還有穩(wěn)定、易操作的優(yōu)點，故本研究最終選用pSilencer 4.1-CMV neo構(gòu)建了miR-125b真核表達(dá)載體。

本實驗所構(gòu)建的miR-125b真核表達(dá)載體可廣泛應(yīng)用于各種哺乳動物細(xì)胞并獲得穩(wěn)定高表達(dá)miR-125b的細(xì)胞模型，可用于長期研究和觀察，不僅為研究miR-125b轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的機(jī)制提供了技術(shù)支撐，也為今后研究miR-125b的其他生物功能打下了良好的工作基礎(chǔ)。

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[14]Chen P N, Hsieh Y S, Chiang C L, et al. Silibinin inhibits invasion of oral cancer cells by suppressing the MAPK pathway [J]. J Dent Res, 2006, 85 (3): 220-225.

Influence of Stable Over-expression of miR-125b on Metastasis of Breast Cancer Cell Line MCF-7

TANG Feng1,2, YANG Jue2, LI Runle1,3, GE Rili1, XI Tao2
(1. Research Center for High Altitude Medicine, Qinghai University, Xining 810016, China; 2. Research Center of Biotechnology, China Pharmaceutical University, Nanjing 210009, China; 3. Department of Agriculture and Animal Husbandry, Qinghai University, Xining 810016, China)

Objective: To explore the effect of miR-125b on metastasis of breast cancer cell line MCF-7 by constructing eukaryotic expression vector stably expressing miR-125b. Methods: The recombinant plasmid pSilencer 4.1-miR-125b was constructed and used to transfect MCF-7 cells. MCF-7-miR-125b cells which could stably over-express miR-125b were obtained by G418 screening. The wound healing assay, transwell assay and clone forming assay were used to explore the effect of miR-125b on metastasis of breast cancer cells. Results: The MCF-7-miR-125b cells which could stably over-express miR-125b were successfully constructed. The migration capability in 2D and 3D level of MCF-7-miR-125b cells was significantly stronger than that of MCF-7 cells. The clone forming quantity of MCF-7-miR-125b cells was also larger than that of MCF-7 cells. Conclusion: The miR-125b can promote the metastasis of breast cancer cells.

miR-125b; eukaryotic expression vector; breast cancer; cell metastasis

R73-37

B

1001-5094 (2014) 01-0057-06

接受日期：2013-09-04

項目資助：青海省自然科學(xué)基金資助項目（No.2013-Z-938Q）；國家自然科學(xué)基金資助項目（No.81360300）

*通訊作者：格日力，教授；

研究方向：高原醫(yī)學(xué)；

Tel：0971-6142063；E-mail：geriligao@hotmail.com**通訊作者：奚濤，教授；

研究方向：分子藥理學(xué)；

Tel：025-83271022；E-mail：xi-tao18@hotmail.com