NK細胞殺傷弓形蟲的機制及中藥的調(diào)節(jié)作用

吳 丹，肖蓓蕾，李曉東，王斐然，楊漠源，王偉強

（河北大學醫(yī)學部，河北 保定 071000）

NK細胞殺傷弓形蟲的機制及中藥的調(diào)節(jié)作用

吳 丹，肖蓓蕾，李曉東，王斐然，楊漠源，王偉強

（河北大學醫(yī)學部，河北 保定 071000）

NK 細胞的殺傷活性無 MHC 限制，不依賴抗體，其靶細胞主要是某些腫瘤細胞、病毒感染細胞、某些自身組織細胞、寄生蟲等，所以在抗細胞內(nèi)弓形蟲感染的免疫應答中起重要作用，將影響 NK 細胞殺傷弓形蟲活性的中藥成分以及NK 細胞殺傷弓形蟲的機制等進行綜述。

弓形蟲；NK細胞；感染；中藥成分；殺傷

剛地弓形蟲（Toxoplasma gondii）是一種機會性的專性胞內(nèi)寄生原蟲，能夠引起人獸共患病。弓形蟲的生活史十分復雜，貓和其他貓科動物是其終末宿主，其他溫性動物包括人類都可以成為弓形蟲重要的中間宿主[1]。主要通過侵入中間宿主腸壁經(jīng)血或淋巴進入單核-吞噬細胞系統(tǒng)的細胞內(nèi)寄生，進而感染全身其他部位且入侵有核細胞，造成嚴重破壞。機體的免疫系統(tǒng)通過固有免疫和獲得性免疫來防御感染，其中固有免疫中的自然殺傷細胞（natural killer, NK）是抗感染的重要一方面。

自然殺傷細胞是機體執(zhí)行固有免疫的主要細胞，是天然免疫的主要承擔者,對病原體感染和惡性轉(zhuǎn)化的細胞具有自然細胞毒效應。NK 細胞無需抗原預先致敏即可以直接殺傷靶細胞[2]，所以，NK 細胞作為生物治療的新手段越來越受關注。

1 NK細胞殺傷弓形蟲的機制

1.1 線粒體介導的凋亡途徑

顆粒溶素（granulysin，GNLY）是細胞毒顆粒蛋白，與穿孔素和顆粒酶共同定位于人的細胞毒 T 淋巴細胞（CTL）和NK細胞溶細胞顆粒中，近來發(fā)現(xiàn) GNLY 也釋放到外周血漿中[3]。GNLY 具有廣譜抗病原菌、真菌和寄生蟲的效應，不僅能直接殺傷胞外致病菌，還可在穿孔蛋白（perforin）的協(xié)同作用下降低胞內(nèi)病原菌的生存能力[4]。在弓形蟲感染中，顆粒溶素-B 能夠直接作用于凋亡酶促進凋亡[3]。王偉靈等[5]發(fā)現(xiàn)，GNLY 電荷形成與細胞膜相互作用有關。GNLY 帶正電荷與帶負電荷的細胞結(jié)合，導致胞內(nèi) Ca2+濃度的增加和 K+濃度的降低，神經(jīng)磷脂酶被激活，神經(jīng)酰胺濃度緩慢增加，通過更快速的過程，線粒體被損傷，線粒體膜通透性增高，細胞色素 C 和誘導凋亡的因子被釋放，導致 caspase 和核酸內(nèi)切酶被激活，發(fā)生細胞凋亡。Walch 等[6]還發(fā)現(xiàn)在穿孔素存在下，顆粒溶素依賴的細胞溶解作用加強。也就是說兩者相互協(xié)同損傷細胞。依賴于穿孔素（PFP）或其他孔形成蛋白所形成的活性孔道，GNLY 可進入靶細胞內(nèi)殺滅寄生的病原微生物[7]。弓形蟲不同于其他大多數(shù)細胞內(nèi)寄生病原體，幾乎可以感染所有各種類型細胞。弓形蟲從入侵部位進入血液后散布全身并迅速進入單核-巨噬細胞以及宿主的各臟器或組織細胞內(nèi)繁殖，直至細胞脹破，逸出的原蟲（速殖子）又可侵入鄰近的細胞，當機體感染弓形蟲后，GNLY 可以通過線粒體介導的凋亡途徑，殺傷弓形蟲感染的宿主細胞，還可以在穿孔素的協(xié)助下，即穿孔素在寄生有弓形蟲靶細胞細胞膜上形成多聚穿孔素“孔道”，水電解質(zhì)入胞致其裂解，GNLY 循“孔道”入胞，激活凋亡相關酶系統(tǒng)致靶細胞凋亡。

1.2 Fas/FasL 途徑

弓形蟲感染，引起組織中細胞凋亡相關蛋白 Bax、Bcl-2、Fas、FasL 及 TNF-α表達增加[8]。Fas 分子胞內(nèi)段有死亡結(jié)構(gòu)域（death domain, DD） ，三聚化的 Fas 和 FasL 結(jié)合后，使 3 個 Fas 分子的 DD 相聚成簇，吸引了細胞質(zhì)中另一種帶有相同 DD 的 Fas 相關死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（Fas-associated death domain, FADD）。FADD 是死亡信號轉(zhuǎn)錄中的一個連接蛋白，它由兩部分組成：C 端（DD結(jié)構(gòu)域） 和 N 端（死亡效應結(jié)構(gòu)域，death effector domain, DED） 部分。C 端負責與 Fas 分子胞內(nèi)段上的 DD 結(jié)構(gòu)域結(jié)合，該蛋白再以 DED連接另一個帶有 DED 的后續(xù)成分[9]?；罨?NK 細胞可表達 FasL，F(xiàn)as（CD95）通過與其特異性配體FasL（ CD95L） 結(jié)合而在細胞膜表面發(fā)生聚合，形成的復合物通過FADD與Caspase28特異的結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并使Caspase28形成二聚體而自身激活，進而引起細胞的Caspases酶系級聯(lián)反應，引起多種死亡性底物的酶解而引發(fā)DNA降解，使凋亡發(fā)生，導致靶細胞凋亡[10]。凋亡信號激活半胱天冬酶后，caspase-3水解半胱天冬酶激活的Dnase抑制因子，釋放的caspase-3水解半胱天冬酶激活的Dnase進入核內(nèi)，發(fā)揮Dnase活性降解染色體DNA，導致靶細胞解體[11]。其作用包括以下 3 個方面：（1）凋亡信號傳導級聯(lián)反應過程的一個關鍵環(huán)節(jié)；（2）可直接破壞細胞結(jié)構(gòu)，如核層蛋白（Laminine） 和凝膠蛋白（ Gelsolin） 等，使蛋白分解引起凋亡；（3）對蛋白酶的調(diào)節(jié)功能，如滅活細胞凋亡的抑制劑作用、激活下游的核酸內(nèi)切酶等[7]。感染弓形蟲時，通過 NK 細胞活化，引起細胞的Caspases酶系級聯(lián)反應，導致弓形蟲感染的靶細胞細胞結(jié)構(gòu)破壞，染色體 DNA 降解，使靶細胞解體，實現(xiàn) NK 細胞對弓形蟲的殺傷。而一項關于 Fas-AD 誘導 Bel-7402細胞凋亡的研究[12]表明：除 caspase-8外，P38MAPK 也參與了此凋亡過程，而且二者在 mRNA 水平上相互調(diào)節(jié)。

還有研究表明，F(xiàn)as/FasL還可以通過第二信使的途徑來誘導凋亡。Fas/FasL結(jié)合時，鞘磷酸脂酶活化，從而使鞘磷酸分解生成神經(jīng)酰胺，然后通過胞質(zhì)內(nèi)絲/蘇氨酸蛋白磷酸激酶和膜結(jié)合性的絲/蘇氨酸蛋白激酶導致 IP3 和 DAG 等第二信使激活，胞內(nèi) Ca2+濃度升高，從而激活 Ca/Mg 依賴的核酸酶，使DNA 斷裂，激活谷氨酰胺轉(zhuǎn)移酶，使胞質(zhì)內(nèi)蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，從而導致細胞凋亡[13]。

1.3 TNF-α/TNF-R1途徑

弓形蟲感染妊娠中期的小鼠，可引起胎盤組織中細胞凋亡相關蛋白表達量的改變，進而啟動內(nèi)、外源性的細胞凋亡途徑，導致胎盤細胞凋亡增加[14]。NK 細胞表面能恒定地表達 TNF，TNF 與受弓形蟲感染的細胞表面的 TNF-R1結(jié)合后，TNF-R1 的 DD 與 TNFR相關死亡結(jié)構(gòu)域蛋白（TNF receptor．a(chǎn)sso—ciated death domain）分子的 DD 交聯(lián)，后者作為一種輔助因子與 FADD 結(jié)合后可通過和 Fas-FasL 相同的途徑誘導細胞凋亡?；罨?NK 細胞可釋放 TNF-α 和 TNF-β（LT），TNF 通過（1）靶細胞溶酶體的穩(wěn)定性發(fā)生變化；（2）影響細胞膜磷脂代謝；（3）糖代謝發(fā)生變化，組織中 pH 降低（pH6.5 的培養(yǎng)條件較適于試驗的弓形蟲速殖子體外增殖）；（4）靶細胞核酸內(nèi)切酶活化，降解基因組 DNA 從而引起程序性細胞死亡等機理殺傷靶細胞[9]。TNF 引起細胞死亡過程要明顯慢于穿孔素溶解細胞的作用。

2 影響 NK 細胞殺傷弓形蟲活性的中藥成分

2.1 單味中藥成分大蒜素

徐麗等[15]應用不同濃度的大蒜素對體外培養(yǎng)的大鼠脾 NK 細胞進行處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)大蒜素能改變 NK細胞S+G2/M周期比例，且在大蒜素的一定濃度范圍內(nèi)，對 NK 細胞增殖率的影響呈劑量依賴關系，即在相同的培養(yǎng)時點 NK 細胞的增殖率隨大蒜素使用濃度增高而升高，提示大蒜素可提高 NK 細胞活性，30 mg/L是大蒜素的相對適宜濃度。大蒜素對 NK 細胞培養(yǎng)上清中 INF-γ 分泌水平的影響，與 NK 細胞的殺傷活性的變化趨勢完全一致，大蒜素可能通過上調(diào) NK 細胞分泌 INF-γ 的水平殺傷弓形蟲。陳光等[16]采用臺盼蘭著色法觀察大蒜素對弓形蟲速殖子活性的影響，發(fā)現(xiàn)在大蒜素作用后，弓形蟲速殖子的形態(tài)發(fā)生了顯著的改變，蟲體變短變粗，結(jié)構(gòu)模糊，最終可能導致蟲體破裂。采用 TUNEL 末端標記法檢測弓形蟲速殖子的凋亡率發(fā)現(xiàn)：大蒜素能夠使弓形蟲速殖子凋亡，并呈時間和劑量依賴性。而且大蒜還有免疫激活作用，大蒜素中有一種重要生物活性成分二丙烯基二硫化物，其活性基團是-os-s-基，可以刺激IL-2、TNF-α、IFN-γ釋放，從而增強 NK 細胞殺傷活性[17-18]。

2.2 復合中藥成分排毒增益湯

排毒增益湯也能提高 NK 細胞殺傷活性，苑文英等[19]發(fā)現(xiàn)：弓形蟲感染模型組小鼠脾臟 NK 細胞殺傷率顯著降低，可能與弓形蟲感染小鼠免疫抑制有關，排毒增益湯各用藥組對弓形蟲感染小鼠脾臟 NK細胞殺傷率有顯著上調(diào)作用，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義，說明排毒增益湯能促進弓形蟲感染小鼠NK 細胞殺傷率，能夠在抗弓形蟲感染方面發(fā)揮作用。

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（責任編輯：高艷華）

The mechanisms of NK cells in killing Toxoplasma gondii and the role of traditional Chinese medicine in its regulation

WU Dan, XIAO Beilei, LI Xiaodong, WANG Feiran, YANG Moyuan, WANG Weiqiang
(Medical Center of Hebei University, Baoding 071000, China)

The killing activity of NK cells, whose main target cells are some tumor cells, cells infected by virus, tissue cells and parasites, etc, has no MHC restriction, and does not rely on antibody, so it plays an important role in the immune response to toxoplasma infection in cells. The following will review the Chinese herb ingredient which affects the activity of NK cells to kill toxoplasma and the mechanisms of NK cell in killing Toxoplasma gondii.

Toxoplasma gondii; NK cells; infection; Chinese native medicine ingredient; killing

R69

A

1674-490X(2014)01-0079-04

2013-09-23

吳丹（1990—），女，河北灤縣人。E-mail: 595351510@qq.com