NLRP3 炎癥小體在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用研究

張海清，孔慶霞

癲癇(epilepsy)是一種神經(jīng)系統(tǒng)常見病，是大腦神經(jīng)元異常放電導(dǎo)致的短暫性大腦功能障礙。近年來臨床研究及動物實驗均證實，炎癥反應(yīng)與癲癇的關(guān)系密不可分，腦內(nèi)特定區(qū)域(興奮性增高的病變組織)的炎癥反應(yīng)是其共同的本質(zhì)特征［1］，炎癥反應(yīng)可以降低癇性發(fā)作的閾值、增加神經(jīng)元興奮性、破壞血腦屏障、介導(dǎo)神經(jīng)元凋亡及突觸重塑［2］。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種炎性介質(zhì)在癲癇患者或動物模型組中表達(dá)水平升高，其中包括白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)。在難治性癲癇患者手術(shù)切除腦組織及癲癇動物模型中均證實存在IL-1β 表達(dá)水平異常升高［3～6］，并且Ravizza 等發(fā)現(xiàn)患者腦組織中IL-1β 升高水平與其術(shù)前癇性發(fā)作的嚴(yán)重程度成正相關(guān)［5］。IL-1 受體拮抗劑(IL-1ra)或者抑制IL-1β 合成能有效發(fā)揮抗癇作用［7］。NLRP3 炎癥小體是一種存在于細(xì)胞胞漿中的多蛋白復(fù)合物，主要是由NOD 樣受體(NODlike receptor 3，NLRP3)、凋亡相關(guān)點狀蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)和磷酸化的半胱氨酸天冬氨酸酶-1(caspase-1)前體相互結(jié)合形成的。NLRP3 炎性小體能使磷酸化的caspase-1 去磷酸化，活化的caspase-1 促進(jìn)IL-1β、白介素-18(IL-18)炎性因子前體的成熟，由此可見NLRP3 炎性小體活化是IL-1β 成熟的關(guān)鍵。盡管臨床研究及動物實驗均證實IL-1β 在癲癇中表達(dá)上調(diào)，但是目前國內(nèi)外尚沒有關(guān)于NLRP3 炎癥小體與癲癇發(fā)作關(guān)系相關(guān)研究。本研究通過檢測癲癇大鼠海馬組織不同時間點NLRP3 炎癥小體表達(dá)，探討NLRP3 炎癥小體是否參與癲癇誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)及其作用機(jī)制，將可能為癲癇治療提供新的方向。

1 材料和方法

1.1 材料及實驗分組 健康雄性Wistar 大鼠60 只，鼠齡2 m，由山東魯抗實驗動物中心提供(生產(chǎn)許可證scxk 魯20130001)，體重250～300 g。按隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠分為癲癇24 h、48 h、72 h 組，每組10 只，及正常對照組、7 d 組，每組15 只。匹羅卡品、氯化鋰(美國SIGMA);兔抗大鼠NLRP3、ASC、caspase-1 及羊抗兔IgG 單克隆抗體(美國Santa Cruz)，兔抗大鼠GFAP-Cy3 標(biāo)記(美國abcam)、兔抗大鼠Iba1(日本wako)、FITC 標(biāo)記驢抗兔二抗(美國abcam);總RNA 提取試劑盒(上海生物工程有限公司)，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(北京天根生物科技)，引物由上海生物工程有限公司設(shè)計合成;DYY-11 型電泳儀(北京六一儀器廠)，BIORAD 凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD);Leica 熒光顯微鏡(德國萊卡);大鼠IL-1βELISA 試劑盒(武漢博士德);Themro 酶標(biāo)儀(Themro)。

1.2 動物模型制備 氯化鋰-匹羅卡品法制備癲癇模型，方法如下:大鼠腹腔內(nèi)提前18～20 h 預(yù)先注射氯化鋰(LiCl)127 mg/kg(利用氯化鋰與匹羅卡品的協(xié)同作用)，第2 天提前30 min 預(yù)先給予大鼠腹腔注射溴化甲基阿托品1 mg/kg，以減少外周膽堿能反應(yīng)，30 min 后實驗組腹腔注射新鮮配置的匹羅卡品(PILO)30 mg/kg(對照組注射0.9%的生理鹽水替代匹羅卡品)。大鼠在匹羅卡品注射后可出現(xiàn)外周膽堿能反應(yīng)、刻板動作、癲癇發(fā)作直至全身強(qiáng)直-陣攣癲癇大發(fā)作。按照Racine 癲癇行為標(biāo)準(zhǔn)觀察記錄大鼠行為30 min，若大鼠未達(dá)到Racine 分級的IV～V 級的癇性發(fā)作，則可以追加匹羅卡品的劑量，每隔10 min 重復(fù)注射匹羅卡品一次，每次為10 mg/kg，最大追加劑量可達(dá)60 mg/kg。只有發(fā)作級別達(dá)Racine 分級IV～V 級才能進(jìn)入后續(xù)實驗。所有大鼠達(dá)IV～V 級癇性發(fā)作1 h 后腹腔注射地西泮10 mg/kg，以終止發(fā)作，降低死亡率。對造模失敗大鼠通過隨機(jī)抽樣原則作及時補(bǔ)充，以保證各實驗組大鼠數(shù)量恒定。

1.3 癲癇動物模型評定標(biāo)準(zhǔn) 采用1972 年的Racine 標(biāo)準(zhǔn)，Racine 標(biāo)準(zhǔn)共分6 級，其中I、II、III 級為復(fù)雜部分性發(fā)作;IV、V 為部分性發(fā)作繼發(fā)的全身性發(fā)作。0 級:行為正常，無抽搐發(fā)作;I 級:面部陣攣，包括眨眼、動須、節(jié)奏性咀嚼等;II 級:面部痙攣+節(jié)律性點頭;III 級:面部痙攣+節(jié)律性點頭+單側(cè)前肢肌陣攣，但無后肢直立位;IV 級:面部痙攣+節(jié)律性點頭+雙側(cè)前肢陣攣+后肢直立位;V 級:全面性強(qiáng)直-陣攣發(fā)作，并失去體位控制。動物出現(xiàn)Racine IV 級以上發(fā)作并存活者入組。SE 出現(xiàn)當(dāng)天記為0 d。

1.4 檢測指標(biāo)及方法

1.4.1 組織取材及處理 各組大鼠于各觀察時間點采用10%水合氯醛(0.3～0.4 ml/100 g)腹腔注射麻醉，待大鼠眨眼反射消失時，仰臥位，四肢稍固定，局部消毒后打開腹腔，輕柔撥開臟器暴露腹主動脈，用5 ml 注射器取血，將血注入促凝管中，室溫靜止2 h 后離心取上清，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。腹主動脈取血后立即脫頸處死大鼠，斷頭取出大腦，并且立即冰上分離獲取海馬，將海馬迅速放入液氮中保存。各組10 只大鼠其中隨機(jī)抽5 只用于提取蛋白，各組中剩余5 只用于提取組織RNA。正常對照組及造模后7 d 組剩余5 只大鼠上述方式麻醉，依次以0.9%生理鹽水及4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注固定，分離腦組織置于4%的多聚甲醛中繼續(xù)固定12 h(4 ℃)，后經(jīng)30%蔗糖脫水沉底，行冰凍連續(xù)冠狀位切片，切片厚15 μm，用于免疫熒光染色。

1.4.2 免疫蛋白印記(Western blot)冰上研磨海馬組織，加入裂解液及蛋白酶抑制劑(RIPA)充分裂解細(xì)胞，冰上研磨40 min，離心組織勻漿4 ℃12000 r/min×30 min，取上清，即為得到組織總蛋白。BCA 法測定蛋白濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算蛋白質(zhì)濃度。所得蛋白質(zhì)加入5×蛋白上樣緩沖液并熱變性備用。各組分別取50 μg 進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜并封閉，與NLRP3、ASC、caspase-1 一抗4 ℃孵育過夜，TBS-T 洗去一抗后加二抗孵育2 h，用ECL 化學(xué)發(fā)光劑顯影，在BIO-RAD 凝膠成像系統(tǒng)圖像分析系統(tǒng)曝光并定量分析條帶的光密度值。

1.4.3 免疫熒光染色 將冰凍切片常溫下復(fù)溫30 mins，加5%山羊血清封閉2 h，加入抗GFAP(Cy3 標(biāo)記)及Iba1 一抗4 ℃孵育過夜，PBS 洗3次，加入FITC 標(biāo)記驢抗兔二抗，避光室溫條件孵育1 h，PBS 洗凈后加入DAPI 染色3 min，PBS 洗3 次，抗熒光衰減封片劑封片，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.4.4 熒光定量PCR(RT-PCR)用Trizol 試劑提取大鼠海馬組織總RNA，研缽中加液氮研磨海馬組織，組織研磨至粉末狀時按RNA 提取試劑盒說明書提取海馬組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，以1 μl cDNA 為模板行PCR 擴(kuò)增，實時定量PCR 樣品反應(yīng)體系采用SYBR Green I，其最終的反應(yīng)體系20 μl。NLRP3 上游引物:5’-GCAAGAGGTGCTGATGAAGA-3’，下游引物:5’-CCTTTCTCGGGTGGGTAATC-3’;ASC 上游引物:5’-TTGCTGGATGCTCTGTATGG-3’，下游引物:5’-CCAAGTAGGGCTGTGTTTGC-3’;caspase-1 上游引物:5 ’-AGATGCCAACCACTGAAAGG-3’，下游引物:5’-GCATGATTCCCAACACAGGT-3’;β-actin 上游引物:5’-CATCACTATCGGCAATGAGC-3’，下游引物5’-GACAGCACTGTGTTGGCATA-3’。PCR 循環(huán)條件為:95 ℃ 15 min，95 ℃變性10 s，60 ℃32 s，40 個循環(huán)。每個樣品均設(shè)置相應(yīng)未經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄的模板作為陰性對照，繪制NLRP3、ASC、caspase-1、β-actin 的熒光曲線和溶解曲線，并得到各自的熒光域值循環(huán)數(shù)(Ct 值)，采用相對定量法2-△△Ct 進(jìn)行計算實驗組相對與對照組的基因表達(dá)量。

1.4.5 ELISA 嚴(yán)格參照ELISA 試劑盒說明書檢測IL-1β，以空白調(diào)零，450 nm 波長檢測各孔光密度D(λ)值。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。實驗結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，P 值＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義，兩組間均數(shù)比較采用兩獨立樣本t 檢驗，P 值＜0.05 認(rèn)為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 造模情況 實驗組大鼠腹腔注射匹羅卡品10～40 min 后開始出現(xiàn)外周膽堿能反應(yīng):立毛、抖動、流涎、流淚等;刻板行動:凝視、吸鼻、反復(fù)點頭等;隨后出現(xiàn)癲癇發(fā)作:咀嚼或動須、節(jié)律性點頭、濕狗樣抖動、前肢及后肢痙攣、最后出現(xiàn)全身強(qiáng)直-痙攣發(fā)作并跌倒。按照Racine 分級標(biāo)準(zhǔn)，只有達(dá)到IV級及以上的大鼠進(jìn)入后續(xù)試驗，癲癇達(dá)IV 級以上發(fā)作后1 h 腹腔注射地西泮終止其發(fā)作，此時大鼠活動減少。造模成功率為83.3%，死亡率10%(60 只大鼠，50 只成功建立模型，其中3 只在造模后24 h內(nèi)死亡，2 只在造模后48 h 內(nèi)死亡)，模型成功后注意保暖，加強(qiáng)呼吸道及體液管理能有效降低模型死亡率。對照組大鼠腹腔注射生理鹽水，無任何抽搐表現(xiàn)，行為正常。

2.2 免疫蛋白印記Western blot 檢測各組NLRP3 炎癥小體表達(dá)情況 各時間點致癇組大鼠海馬NLRP3、ASC、caspase-1 蛋白的表達(dá)較對照組均有明顯增加，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。結(jié)果顯示NLRP3 炎性小體各部分隨時間延長逐漸增加，并于72 h達(dá)高峰，癲癇發(fā)作7 d 后炎性小體表達(dá)稍下降，但仍高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。

2.3 GFAP 與Iba1 免疫熒光雙重染色熒光顯微鏡(×400 倍)下觀察，造模后7 d，與對照組比較模型組海馬CA3區(qū)星形膠質(zhì)細(xì)胞(紅色)和小膠質(zhì)細(xì)胞(綠色)增生現(xiàn)象明顯(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.4 熒光實時定量PCR(RT-PCR)檢測海馬組織NLRP3 炎癥小體各部分mRNA 的表達(dá) 采用2-△△Ct(RQ)法計算目的基因相對表達(dá)率。從擴(kuò)增曲線和溶解曲線中可以看出，熒光定量PCR 反應(yīng)中目的基因及內(nèi)參得到了擴(kuò)增，并且擴(kuò)增產(chǎn)物單一，所得實驗結(jié)果可信。統(tǒng)計結(jié)果顯示各致癇組NLRP3 炎性小體mRNA 表達(dá)量均顯著高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，在不同時間點的海馬組織中NLRP3炎性小體各部分的相對表達(dá)量關(guān)系如下:照組＜24 h組＜48 h 組＜7 d 組＜72 h 組。

2.5 ELISA 檢測大鼠血清中IL-1β 含量并分析其與海馬組織中NLRP3 的相關(guān)性 統(tǒng)計結(jié)果顯示:24 h、48 h、72 h、7 d 各致癇組血清中IL-1β 的含量較對照組高，其中以72 h 組水平最高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1);另外分析結(jié)果顯示IL-1β 與NLRP3炎性小體活化呈正相關(guān)(r=0.849，P=0.000)。

表1 不同時間點各組血清IL-1β 含量的變化及其與海馬組織NLRP3 的相關(guān)性分析(±s，ng/L，n=10)

表1 不同時間點各組血清IL-1β 含量的變化及其與海馬組織NLRP3 的相關(guān)性分析(±s，ng/L，n=10)

經(jīng)t 檢驗，與正常對照組比較* P＜0.05

3 討論

天然免疫反應(yīng)又稱為固有免疫反應(yīng)，是機(jī)體防御病原體的特異性第一道防線。吞噬細(xì)胞通過模式識別受體(pattern recognition receptor，PRR)識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)，促進(jìn)多種炎性細(xì)胞因子釋放及炎癥反應(yīng)，啟動天然免疫反應(yīng)。PRR 主要表達(dá)于固有免疫細(xì)胞表面，PRP 包括多種不同類型識別受體，近來研究較多的PRR 為NOD 樣受體(NOD-like receptor，NLR)家族，NLRP3 即為NLR 家族成員之一，它可以識別病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)以及損傷相關(guān)分子模式(damageassociated molecular pattern，DAMP)而被激活，在激活之后能夠通過與接頭蛋白凋亡相關(guān)的點狀蛋白(apoptosis-associated speck-like protein，ASC)相互作用，活化半胱氨酸蛋白酶-1(caspase-1)，形成蛋白復(fù)合物“炎癥小體(inflammasome)”，進(jìn)而誘導(dǎo)白介素(Interleukin，IL)-1β(IL-1β)和白介素-18(IL-18)的成熟與分泌。IL-1 介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是組織炎癥反應(yīng)的開始，IL-1β 作為上游炎性因子能介導(dǎo)多種炎性因子表達(dá)上調(diào)，因此IL-1β 被稱為“前炎性因子”［8］。研究發(fā)現(xiàn)NLRP3 炎癥小體激活主要通過以下途徑:(1)溶酶體破裂介導(dǎo)的激活途徑，溶酶體裂解釋放組織蛋白酶B，組織蛋白酶B 能進(jìn)一步激活caspase-1，發(fā)揮切割白介素-1β 前體作用［9］;(2)鉀離子外流介導(dǎo)的激活途徑，細(xì)胞外ATP 與ATP 門控的陽離子通道受體(P2X)家族亞型P2X7R 結(jié)合介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鉀離子外流，細(xì)胞內(nèi)低鉀能有效促使NLRP3 炎癥小體激活［10］;(3)活性氧介導(dǎo)激活途徑，線粒體損傷釋放活性氧(ROS)，ROS 使硫氧還蛋白相互作用的蛋白(thioredoxin-interacting protein，TXNIP)與硫氧蛋白(TRX)分離，TXNIP 與NLRP3 結(jié)合能招募ASC、pro-caspase-1 促進(jìn)形成炎癥小體［11］。研究發(fā)現(xiàn)NLRP3 炎癥小體在多種疾病中被激活，其中包括家族性周期性自身炎癥反應(yīng)、2 型糖尿病、阿爾茨海默病、動脈粥樣硬化癥、腦梗死、多發(fā)性硬化癥等。

以往研究發(fā)現(xiàn)在癲癇發(fā)作過程中，發(fā)生氧化應(yīng)激損傷、線粒體裂解，釋放ATP、ROS 水平升高［12］。另外近期有研究發(fā)現(xiàn)ATP 通過激活P2X7R 參與癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)病過程，在海馬組織中P2X7R 表達(dá)上調(diào)，給予P2X7R 受體拮抗劑能減輕海馬區(qū)域損傷［13］。Jimenez 等發(fā)現(xiàn)在癲癇患者及小鼠模型皮質(zhì)中P2X7R 表達(dá)亦上調(diào)，特異性P2X7R 受體抑制劑A-438079 能有效小鼠癇性發(fā)作次數(shù)及嚴(yán)重程度［14］。由此可見，P2X7R 在癲癇的發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于癲癇與炎癥反應(yīng)的研究主要集中在各類炎性介質(zhì)及其相應(yīng)阻斷劑的作用方面，至于NLRP3 炎癥小體在癲癇中是否表達(dá)上調(diào)，其意義又如何，國內(nèi)外未見有相關(guān)報道。

目前研究認(rèn)為匹羅卡品可誘導(dǎo)動物出現(xiàn)數(shù)小時的癲癇持續(xù)狀態(tài)，而引起一系列的層級反應(yīng)最終導(dǎo)致特定腦區(qū)興奮性增強(qiáng)，軸突出芽和功能性突觸重建，能夠較好模擬人類顳葉癲癇。本實驗中應(yīng)用氯化鋰、匹羅卡品誘導(dǎo)SD 大鼠建立癲癇模型［15］。通過RT-PCR 檢測發(fā)現(xiàn)發(fā)現(xiàn)模型組海馬組織中的NLRP3、caspase-1 及ASC mRNA 表達(dá)與對照組相比有顯著升高，Western blot 檢測顯示NLRP3、caspase-1及ASC 蛋白在模型組也明顯增加。模型建立后NLRP3 炎癥小體各部分均隨時間變化逐漸上升，72 h左右達(dá)到最高峰，提示在癲癇發(fā)病過程中激活炎癥反應(yīng)，NLRP3 炎癥小體參與癲癇發(fā)作后的炎癥過程。本次實驗還發(fā)現(xiàn)NLRP3 與IL-1β 之間有明顯相關(guān)性，提示選擇性抑制NLRP3 炎性小體活化或者特異性阻斷caspase-1 活性可能有效抑制癲癇導(dǎo)致IL-1β 異常升高。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中星形膠質(zhì)細(xì)胞是調(diào)控ROS 生成、氧化應(yīng)激、固有免疫和炎癥反應(yīng)的重要場所，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)IL-1β 的主要來源。癲癇誘導(dǎo)膠質(zhì)細(xì)胞活化可能是NLRP3炎性小體激活的潛在機(jī)制，仍需進(jìn)一步實驗證明。

綜上所述，本實驗結(jié)果證實了在急性癲癇發(fā)病過程中NLRP3 炎癥小體被激活，但是需要指出的是，本研究目前只能反映NLRP3 炎性小體與癲癇急性期的相關(guān)性，其在癲癇中的發(fā)病機(jī)制，另外本實驗沒有對NLRP3 炎性小體進(jìn)行組織定位。因此，需進(jìn)一步研究NLRP3 炎癥小體參與癲癇發(fā)病過程的具體機(jī)制，可以通過抑制NLRP3 炎性小體激活觀察對癲癇大鼠細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及認(rèn)知功能的影響。為控制癲癇發(fā)作、研制新的神經(jīng)保護(hù)劑提供新的方向。

［1］Vezzani A，F(xiàn)rench J，Bartfai T，et al.The role of inflammation in epilepsy［J］.Nat Rev Neurol，2011，7(1):31-40.

［2］Xu D Miller SD，Koh S.Immune mechanisms in epileptogenesis［J］.Front Cell Neurosci，2013，7:195.

［3］Ravizza T，Gagliardi B，Noe F，et al.Innate and adaptive immunity during epileptogenesis and spontaneous seizures:evidence from experimental models and human temporal lobe epilepsy［J］.Neurobiol Dis，2008，29(1):142-160.

［4］Henshall DC，Clark RS，Adelson PD，et al.Alterations in bcl-2 and caspase gene family protein expression in human temporal lobe epilepsy［J］.Neurology，2000，55(2):250-257.

［5］Ravizza T，Boer K，Redeker S，et al.The IL-1beta system in epilepsyassociated malformations of cortical development［J］.Neurobiol Dis，2006，24(1):128-143.

［6］Boer K，Jansen F，Nellist M，et al.Inflammatory processes in cortical tubers and subependymal giant cell tumors of tuberous sclerosis complex［J］.Epilepsy Res，2008，78(1):7-21.

［7］Mattia M，Silvia B，Teresa R.Interleukin-1beta biosynthesis inhibition reduces acute seizures and drug resistant chronic epileptic activity in mice［J］.Neurotherapeutics，2011，8(2):304-315.

［8］Vezzani A，F(xiàn)riedman A，Dingledine RJ.The role of inflammation in epileptogenesis［J］.Neuropharmacology，2013，69:16-24.

［9］Hornung V，Bauernfeind F，Rock KL，et al.Silica crystals and aluminum salts activate the NALP3 inflammasome through phagosomal destabilization［J］.Nat Immunol，2008，9(8):847-856.

［10］Petrilli V，Papin S，Dostert C，et al.Activation of the NALP3 inflammasome is triggered by low intracellular potassium concentration［J］.Cell Death and Differentiation，2007，14(9):1583-1589.

［11］Zhou R，Tardivel A，Tschopp J，et al.Thioredoxin-interacting protein links oxidative stress to inflammasome activation［J］.Nature Immunology，2010，11(2):136-140.

［12］劉朝巍，張 濤，楊 卓.氧化應(yīng)激損傷線粒體參與癲癇病理過程［J］.中國病理生理雜志，2008，24(1):198-200.

［13］Kim JE，Kim DS，Kang TC，et al.The effect of P2X7 receptor activation on nuclear factor-κB phosphorylation induced by status epilepticus in the rat hippocampus［J］.Hippocampus，2013，23(6):500-514.

［14］Jimenez-Pacheco A，Mesuret G，Sanz-Rodriguez A，et al.Increased neocortical expression of the P2X7 receptor after status epilepticus and anticonvulsant effect of P2X7 receptor antagonist A-438079［J］.Epilepsia，2013，54(9):1551-1561.

［15］Glien M，Brandt C，Potschka H，et al.Effects of the novel antiepileptic drug levetiracetam on spontaneous recurrent seizures in the rat pilocarpine model of temporal lobe epilepsy［J］.Epilepsia，2002，43(4):350-357.