處理發(fā)酵劑對(duì)促熟干酪中生物胺和游離氨基酸的影響

謝愛英，陳 祎，黨亞麗*，周 玲

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)， 重慶 402460；2.重慶市威士化　工有限公司，重慶 400060；3.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健食品研究所，浙江 杭州 310013）

處理發(fā)酵劑對(duì)促熟干酪中生物胺和游離氨基酸的影響

謝愛英1，陳 祎2，黨亞麗3,*，周 玲1

（1.西南大學(xué)榮昌校區(qū)， 重慶 402460；2.重慶市威士化工有限公司，重慶 400060；3.浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院保健食品研究所，浙江 杭州 310013）

以0、30、60、90 d促熟干酪中生物胺（組胺、色胺、苯乙胺、尸胺、酪胺）和游離氨基酸含量為指標(biāo)，研究了添加復(fù)合處理發(fā)酵劑對(duì)干酪產(chǎn)生游離氨基酸和生物胺量的影響。結(jié)果表明：不同處理發(fā)酵劑添加量對(duì)各種生物胺產(chǎn)生的影響不同；添加處理發(fā)酵劑干酪中生物胺和游離氨基酸含量增加，其含量隨著復(fù)合處理發(fā)酵劑添加量增加而增加。

促熟干酪；生物胺；游離氨基酸

干酪是以乳、稀奶油、脫脂乳或部分脫脂乳、酪乳或這些原料的混合物為原料，經(jīng)凝乳酶或其他凝乳劑，并排出部分乳清而制成的新鮮或經(jīng)發(fā)酵成熟的乳制品[1]。干酪中含有豐富的蛋白質(zhì)、脂肪、礦物質(zhì)以及多種維生素，是乳制品中營養(yǎng)價(jià)值很高的一種產(chǎn)品，在國外被稱為“乳品之王”，是世界上乳制品的大宗產(chǎn)品之一。干酪的成熟主要是通過蛋白質(zhì)、脂肪降解形成干酪獨(dú)特的風(fēng)味物質(zhì)，該過程需在低溫條件下3～6 個(gè)月完成，其成熟時(shí)間較長且費(fèi)用較高，因此，干酪促熟已成為研究熱點(diǎn)。自20世紀(jì)50年代以來，人們就不斷尋求加速干酪成熟的方法，其基本機(jī)理是采用各種物理、化學(xué)和生物的方法加快蛋白質(zhì)和脂肪的分解，在增強(qiáng)干酪的風(fēng)味、保證風(fēng)味平衡、感官良好的同時(shí)縮短成熟時(shí)間。干酪成熟過程中伴隨著蛋白質(zhì)降解為風(fēng)味物質(zhì)的小分子肽及游離氨基酸也積累了胺類物質(zhì)。生物胺（biogenic amine，BA）是生物胺是具有生物活性的有機(jī)的、基本的含氮化合物，主要由氨基酸脫羧形成[2]。生物胺可與亞硝酸鹽發(fā)生反應(yīng)，生成致癌、致突變、致畸的某些亞硝酸胺類物質(zhì)，因此攝入過多的生物胺引起人體中毒。采用溶菌酶和超聲波復(fù)合處理發(fā)酵劑促熟干酪中生物胺研究的文獻(xiàn)鮮見，本實(shí)驗(yàn)擬在干酪制作過程中添加0、0.5%、1%、2%復(fù)合處理發(fā)酵劑，測定促熟干酪中0、30、60、90 d的主要生物胺和游離氨基酸含量，研究促熟生物胺的生成及干酪蛋白的降解，分析二者關(guān)系，為干酪生產(chǎn)及質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

原料乳由重慶市榮昌縣遠(yuǎn)覺鎮(zhèn)鑫旺公司提供。

干酪發(fā)酵劑FD-DVS R-707、凝乳酶CHY-MAX?M丹麥科漢森公司；溶菌酶（lysozyme，酶活力≥20 000 U/mg）；甲醇、乙腈均為色譜純；水為純凈水；乙醚、丙酮、鹽酸、三氯乙酸、氯化鈉、碳酸氫鈉均為分析純；標(biāo)準(zhǔn)品：組胺（histamine）、酪胺（tyramine）鹽酸鹽、色胺（serotonin）、苯乙胺（phenethylamine）、尸胺（codetermine）、1,7-庚二胺、丹磺酰氯 美國Sigma-Aldrich公司。

1.2儀器與設(shè)備

JY96-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī) 南京馬內(nèi)利儀器設(shè)備有限公司；Avanti J-25貝克曼冷凍離心機(jī) 美國貝克曼庫爾特有限公司；BvAgilent1100 系列高效液相色譜儀（配有G1311A四元泵、G1321A熒光檢測器、G1331A自動(dòng)進(jìn)樣器、G1316A恒溫箱、G1322A在線脫氣裝置及化學(xué)工作站、渦流混合器、0.45 μm針頭微孔濾膜過濾器） 日本島津公司；色譜柱：Ultimate XB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm） 月旭材料科技（上海）有限公司；日立L-8900氨基酸分析儀 日本日立高新技術(shù)公司。

1.3方法

1.3.1干酪加工工藝流程

鮮牛乳→標(biāo)準(zhǔn)化→殺菌（在63 ℃殺菌30 min）→冷卻至32 ℃→添加2%的發(fā)酵劑→調(diào)整酸度→加0.02%氯化鈣→加凝乳酶→凝塊切割→攪拌→加溫→排除乳清→添加處理發(fā)酵劑→混勻→壓榨→成熟→取樣

1.3.2發(fā)酵劑的處理

取2 g發(fā)酵劑添加200 mL脫脂乳，37 ℃培養(yǎng)12 h，添加溶菌酶1.6 kU/mL，在43 ℃條件下酶解1 h，后經(jīng)超聲波處理6 min（120 W，10 ℃）。

1.3.3實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在干酪成熟0、30、60、90 d時(shí)，分別取對(duì)照（不添加超聲波和溶菌酶復(fù)合處理的發(fā)酵劑）、添加0.5%、1.0%、2.0%復(fù)合處理發(fā)酵劑的干酪樣品編號(hào)后密封并放入冰箱中凍藏。取樣結(jié)束后，統(tǒng)一進(jìn)行生物胺和游離氨基酸含量的測定。

1.4指標(biāo)測定

1.4.1生物胺含量的測定

1.4.1.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制與衍生

參照Martuscelli等[3]方法，組胺、酪胺、苯乙胺、尸胺、色胺標(biāo)準(zhǔn)溶液：分別準(zhǔn)確稱取0.034 4、0.024 0、0.021 6、0.034 6、0.029 0 g，水溶后定容至100 mL。每份取樣0.5 mL與150 μL飽和NaHCO3混合，用150 μL 0.1 mol/L NaOH將pH值調(diào)至11.5。將2 mL的10 mg/mL的丹磺酰氯加入到胺的提取液中，混合液在40 ℃振蕩保溫60 min進(jìn)行衍生，剩余的丹黃酰氯用300 g/L的氨水200 μL溶解。20 ℃避光條件下保存30 min后用乙腈定容到5 mL，然后過濾。

1.4.1.2色譜條件

采用高效液相法測定生物胺，色譜條件：流動(dòng)相為水和乙腈，采用梯度洗脫，洗脫程序見表1。流速均為0.8 mL/min，紫外檢測波長為254 nm，進(jìn)樣量20 μL，柱溫30 ℃。

表1　生物胺衍生樣品含量測定的分離洗脫梯度Table 1 Mobile phase gradient program for separation of benzyl derivatives of biogenic amines

圖 l 生物胺標(biāo)準(zhǔn)品衍生物色譜圖Fig.1 Chromatogram of derivatives of biogenic amines standards

生物胺標(biāo)準(zhǔn)品衍生物圖譜見圖l，其出峰順序：組胺3.00～3.30 min，色胺8.65～8.95 min，苯乙胺9.50～9.80 min，尸胺10.2～10.9 min，酪胺12.8～13.5 min。

1.4.1.3樣品預(yù)處理

參照劉振鋒[4]、劉辰麒[5]等方法進(jìn)行樣品處理，將干酪用研缽研磨均勻，稱取5.0 g置于50 mL離心管中，加250 μL內(nèi)標(biāo)（1 000 μg/mL庚胺儲(chǔ)備液），再加20 mL 0.4 mol/L高氯酸溶液分散，均質(zhì)1 min，振蕩提取5 min，靜置5 min，然后采用5 000×g離心35 min；將上清液移入50 mL容量瓶中，用20 mL高氯酸溶液重復(fù)提取1 次，上清液合并至相應(yīng)容量瓶中，用0.4 mol/L高氯酸溶液定容至刻度；取2 mL該溶液，按標(biāo)準(zhǔn)品的衍生方法處理。實(shí)驗(yàn)中對(duì)每個(gè)樣品的處理均重復(fù)3 次。

1.4.2游離氨基酸含量的測定

委托國家糧食局成都糧油食品飼料質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心，采用自動(dòng)氨基酸分析儀測定，所測游離氨基酸包括天冬氨酸、蘇氨酸、絲氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、胱氨酸、纈氨酸、蛋氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、組氨酸、精氨酸和脯氨酸。

1.5數(shù)據(jù)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel處理，并進(jìn)行方差分析。

2　結(jié)果與分析

2.1不同處理對(duì)促熟干酪中生物胺含量的影響

2.1.1不同處理對(duì)促熟干酪中組胺含量的影響

圖2　不同處理發(fā)酵劑添加量對(duì)促熟干酪中組胺含量的影響Fig.2 Influence of the modified starter at different levels on histamine content of cheese during ripening

由圖2可知，在干酪成熟過程中實(shí)驗(yàn)組組胺含量先上升后下降，而對(duì)照組的組胺含量不斷升高。這可能是因?yàn)槿芫钙票诤笤俳?jīng)超聲的機(jī)械效應(yīng)和空化效應(yīng)對(duì)細(xì)胞的破碎處理，在合適的破壁程度下促進(jìn)了細(xì)胞內(nèi)酶的釋放，加速了蛋白質(zhì)的降解。另外，干酪中殘存微生物含量增加也使干酪中生物胺的含量增加[6-7]。添加不同量復(fù)合處理發(fā)酵劑對(duì)干酪中組胺含量的影響不同，這可能是因?yàn)閺?fù)合處理發(fā)酵劑添加量不同釋放的蛋白酶量不同。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組對(duì)比，0～60 d實(shí)驗(yàn)組的組胺含量高于對(duì)照組，30 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組添加復(fù)合處理發(fā)酵劑為1%干酪組胺含量達(dá)到最高為249.97 mg/kg；而60～90 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組組胺含量均低于對(duì)照組。添加處理發(fā)酵劑可顯著（P＜0.05）增加成熟期間干酪中組胺含量，其中添加1%和2%處理發(fā)酵劑實(shí)驗(yàn)組差異不顯著，但二者顯著高于添加0.5%實(shí)驗(yàn)組的組胺含量。實(shí)驗(yàn)中組胺含量從0 d開始就比較高，可能與原料乳及原料乳中腸球菌數(shù)有關(guān)[8]。綜上所述，復(fù)合處理發(fā)酵劑可以影響成熟期間促熟干酪中組胺的生成量，且成熟末期低于未添加復(fù)合處理發(fā)酵劑的干酪。

2.1.2不同處理對(duì)促熟干酪中色胺含量的影響

圖3　不同處理發(fā)酵劑添加量對(duì)促熟干酪中色胺含量的影響Fig.3 Influence of the modified starter at different levels on tryptamine content of cheese during ripening

由圖3可知，在0～90 d的成熟期間，添加復(fù)合處理發(fā)酵劑實(shí)驗(yàn)組色胺含量逐漸升高，對(duì)照干酪組色胺含量先上升后下降。其中復(fù)合處理發(fā)酵劑添加為2%的干酪在60～90 d呈持續(xù)上升趨勢，而添加量為0.5%和1%的在60 d達(dá)到最高。這可能原因是添加的溶菌酶和超聲復(fù)合處理的發(fā)酵劑越多，干酪中蛋白酶與微生物含量越多，生成色胺的量越多[9]。對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組對(duì)比，0～60 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組色胺的含量低于對(duì)照組的含量，60～90 d時(shí)，實(shí)驗(yàn)組的色胺含量高于對(duì)照組，復(fù)合處理發(fā)酵劑添加為2%的干酪在90 d時(shí)色胺最大值為3.03 mg/kg。0～90 d成熟期間，添加1%和2%處理發(fā)酵劑實(shí)驗(yàn)組顯著（P＜0.05）增加了干酪中色胺的含量。綜上分析，復(fù)合處理發(fā)酵劑可以影響成熟期間促熟干酪中色胺的生成量。

2.1.3不同處理對(duì)促熟干酪中苯乙胺含量的影響

圖4　不同處理發(fā)酵劑添加量對(duì)促熟干酪中苯乙胺含量的影響Fig.4 Influence of the modified starter at different levels on phenethylamine content of cheese during ripening

由圖4可知，在成熟的30 d與60 d時(shí)實(shí)驗(yàn)組干酪與對(duì)照組苯乙胺的含量基本持平。在90 d時(shí)，添加復(fù)合處理發(fā)酵劑實(shí)驗(yàn)組的苯乙胺含量高于對(duì)照組。產(chǎn)生苯乙胺的微生物主要是腸球菌[10]和乳酸菌[11]，可能與條件處理發(fā)酵劑增加了干酪中的產(chǎn)苯乙胺微生物的數(shù)量。其中，添加復(fù)合處理發(fā)酵劑為2%干酪中苯乙胺含量最高為2.90 mg/kg。0～90 d成熟期間添加處理發(fā)酵劑1%和2%顯著（P＜0.05）增加了促熟干酪中苯乙胺的含量。綜上分析，復(fù)合處理發(fā)酵劑可以影響促熟干酪中苯乙胺的生成量，添加量不同影響效果不同。

2.1.4 不同處理對(duì)促熟干酪中尸胺含量的影響

圖5　不同處理發(fā)酵劑添加量對(duì)促熟干酪中尸胺含量的影響Fig.5 Influence of the modified starter at different levels on cadaverine content of cheese during ripening

由圖5可知，對(duì)照組和添加復(fù)合處理發(fā)酵劑干酪中尸胺含量都是呈下降、升高、下降趨勢。后期下降可能是因?yàn)榇穗A段微生物的生長大量的消耗了氨基酸的量[12]，使得能用來產(chǎn)生生物胺的氨基酸的量減少。在30～90 d時(shí)，對(duì)照組干酪中尸胺含量高于添加復(fù)合處理發(fā)酵劑干酪中尸胺含量，這可能是因?yàn)樵诟衫页墒旌笃谟胁糠帜c桿菌出現(xiàn)，腸桿菌具有較強(qiáng)的脫羧酶活性，尤其是對(duì)于尸胺生成活性較強(qiáng)[13]，而在實(shí)驗(yàn)組添加了處理發(fā)酵劑，對(duì)腸桿菌的部分抑制作用也抑制了尸胺的生成。添加處理發(fā)酵劑干酪中尸胺的含量顯著（P＜0.05）低于對(duì)照組，添加處理發(fā)酵劑1%的干酪在成熟期間尸胺含量沒有明顯（P＞0.05）增加，可能與其受腸桿菌污染較少所致。由上可以看出，添加復(fù)合處理發(fā)酵劑影響了干酪中尸胺的含量，且在成熟末期促熟干酪低于未添加復(fù)合處理發(fā)酵劑的干酪。

2.1.5不同處理對(duì)促熟干酪中酪胺含量的影響

圖6　不同處理發(fā)酵劑添加量對(duì)促熟干酪中酪胺含量的影響Fig.6 Influence of the modified starter at different levels on tyramine content of cheese during ripening

由圖6可知，添加復(fù)合處理發(fā)酵劑干酪中酪胺呈先下降后上升趨勢，而對(duì)照組干酪中酪胺含量呈先上升后下降趨勢。與Komprda等[14]研究的不同，酪胺含量隨著成熟期的延長而增加，與成熟期成正相關(guān)，可能是干酪中生物胺的含量極大的受干酪種類，成熟時(shí)間，制作工藝和微生物的影響[3]。成熟期間添加處理發(fā)酵劑的干酪顯著（P＜0.05）增加了干酪中酪胺的含量，在90 d時(shí)添加復(fù)合處理發(fā)酵劑干酪中酪胺含量高于對(duì)照組干酪中酪胺含量，添加0.5%復(fù)合處理發(fā)酵劑的干酪在90 d時(shí)酪胺含量最高為6.09 mg/kg。綜上分析，復(fù)合處理發(fā)酵劑可以增加促熟干酪中酪胺的生成量。

2.2不同添加量的復(fù)合處理發(fā)酵劑對(duì)干酪成熟期間游離氨基酸含量的影響

圖7　不同處理發(fā)酵劑添加量對(duì)干酪中的游離氨基酸含量影響Fig.7 Influence of the modified starter at different levels on free amino acid content of cheese during ripening

由圖7可知，添加復(fù)合處理發(fā)酵劑和對(duì)照組干酪中游離氨基酸含量都呈先上升后下降趨勢，這與Gardini等[10]研究的趨勢一致。 其中，干酪成熟的0～30 d游離氨基酸增加不明顯，而在30～60 d期間增加較明顯，之后下降。可能是因?yàn)樵诔墒烨捌谥饕悄槊附到獯蠓肿永业鞍诪殡亩蔚倪^程[15]，而復(fù)合處理發(fā)酵劑增加了干酪中的細(xì)胞內(nèi)酶的含量，其主要作用是水解中間型號(hào)的肽[16]，因此在30～60 d氨基酸含量增加。而后期由于氨基酸進(jìn)一步降解為小分子物質(zhì)而使其含量降低。添加復(fù)合處理發(fā)酵劑干酪中游離氨基酸含量顯著高于（P＜0.05）對(duì)照組干酪中游離氨基酸含量，且復(fù)合添加劑添加量越多游離氨基酸含量也越高。綜上分析，添加復(fù)合處理發(fā)酵劑的含量越多，游離氨基酸生成的量也就越多。

3　討 論

3.1干酪中添加處理發(fā)酵劑對(duì)其生物胺含量影響

隨著復(fù)合處理發(fā)酵劑含量增多，干酪中產(chǎn)生的生物胺總量也越多。這可能是復(fù)合處理發(fā)酵劑增加了干酪成熟過程中蛋白質(zhì)的分解以及微生物殘留不同所致[17-18]。干酪中添加的復(fù)合處理發(fā)酵劑越多，微生物釋放的細(xì)胞內(nèi)蛋白酶的含量就越多，蛋白質(zhì)降解產(chǎn)生的游離氨基酸越多。蛋白質(zhì)的降解提高了肽和氨基酸的濃度，為脫羧酶的微生物群提供了胺產(chǎn)生的前體物質(zhì)[6]，這也是導(dǎo)致生物胺含量增加的重要因素。實(shí)驗(yàn)中0 d樣品中的生物胺和游離氨基酸有所不同，與處理發(fā)酵劑有關(guān)，因處理發(fā)酵劑是采用干粉發(fā)酵劑經(jīng)過培養(yǎng)后，經(jīng)過溶菌酶和超聲波復(fù)合處理，該過程中會(huì)產(chǎn)生部分胺類物質(zhì)和游離氨基酸。另外，在干酪制作過程中，不同的樣品處理有所差別，在凝乳中添加處理發(fā)酵劑的過程中，除了增加干酪中發(fā)酵劑微生物及其酶的含量外，也增加了少數(shù)非發(fā)酵劑微生物的含量，這些微生物及其分泌酶的作用使得0 d樣品中的生物胺和游離氨基酸含量不同。

3.2干酪成熟的時(shí)間不同產(chǎn)生生物胺的總量也不同

成熟時(shí)間也是影響干酪中生物胺含量的一個(gè)重要因素。在干酪成熟60 d時(shí)添加0.5%復(fù)合處理發(fā)酵劑產(chǎn)生生物胺的總量最多，為257.18 mg/kg，低于常規(guī)干酪生物胺含量[19-20]，其他干酪在成熟30 d時(shí)生物胺含量最高，對(duì)照、0.5%和2%分別為51.57、127.13、213.11 mg/kg，低于半硬質(zhì)干酪中生物胺含量[17]。在成熟90 d時(shí)，干酪中生物胺的總量降低，與氨基酸底物[12]及微生物胺氧化酶[3]有關(guān)。

4　結(jié) 論

通過測定0、30、60、90 d促熟干酪中生物胺含量的研究，表明干酪中添加復(fù)合處理發(fā)酵劑對(duì)不同種類生物胺含量的影響不同。添加復(fù)合處理發(fā)酵劑可增加干酪中生物胺的總量；隨著復(fù)合處理發(fā)酵劑添加量的增加，產(chǎn)生生物胺的總量也逐漸上升，30 d或60 d時(shí)達(dá)最高。復(fù)合處理發(fā)酵劑對(duì)游離氨基酸的影響與生物胺總量相同。

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Effect of Modified Starter on Biogenic Amines and Free Amino Acids during the Accelerated Ripening of Cheese

XIE Ai-ying1, CHEN Yi2, DANG Ya-li3,*, ZHOU Ling1
(1. Rongchang Campus, Southwest University, Chongqing 402460, China; 2. Chongqing Weishi Chemical Industry Co. Ltd., Chongqing 400060, China; 3. Institute of Health Food, Zhejiang Academy of Medical Sciences, Hangzhou 310013, China)

The starter culture used for producing cheese in this study was modified by sequential treatment with lysozyme and then ultrasonic irradiation after culture in the presence of skim milk, and the modified product was added at different levels to the cheese to accelerate the ripening process. By doing so, this study aimed t o examine the effect of the modified starter on the formation of free amino acids and biogenic amines including histamine, tyramine, phenylethylamine, tryptamine and cadaverine during the accelerated ripening of cheese. The contents of these compounds after 0, 30, 60 and 90 days of ripening were determined. Results showed that the contents of biogenic amine and free amino acids were higher in cheese ripened with the modified starter than in the control group during cheese ageing, indicating that the addition of the modified starter can result in higher contents of biogenic amines and free amino acids in a concentration-dependent manner.

cheese; biogenic amines; free amino acids

TS252.53

A

1002-6630（2014）15-0188-05

10.7506/spkx1002-6630-201415038

2013-07-16

中央高校基本科研業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金項(xiàng)目（XDJK2010C015）；浙江省衛(wèi)生廳一般計(jì)劃研究項(xiàng)目（2011KYB002）；

國家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101344）

謝愛英（1973—），女，講師，碩士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工。E-mail：xay086@126.com

*通信作者：黨亞麗（1978—），女，副研究員，博士，研究方向?yàn)樯锘钚噪呐c保健食品開發(fā)。E-mail：dangyali1978@126.com