富硒靈芝對非酒精性脂肪性肝病大鼠?；o酶A氧化酶水平的影響＊

武俊紫，牛世偉，2，賈亞敏，沈平瑞，胡躍高，陶文艷，李 燕△，李樹德▲

（1.云南省第一人民醫(yī)院干部保健科，昆明650036；2.昆明理工大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，昆明650504；3太原理工大學(xué)現(xiàn)代科技學(xué)院，太原030021；4.沈陽康硒生物工程研究所，沈陽110015；5.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，北京100094；6.昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，昆明650504）

非酒精性脂肪性肝病（non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）主要是指無酒精或其他明確損肝因素的、一種以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，有研究顯示，當(dāng)前我國城市人口NAFLD的發(fā)生率約31%，貧困地區(qū)NAFLD的患病率也在12%左右，NAFLD已經(jīng)成為威脅我國人民健康的一大疾病[1-2]。硒是人體必需的微量元素之一，其在機體內(nèi)有明顯的抗氧化能力，提高肝臟的谷胱甘肽含量，對肝臟具有一定的保護(hù)作用，靈芝對某些微量元素特別是硒具有高度的富集作用，并把無機硒轉(zhuǎn)化為有機硒，利于人體攝入[3-4]。本實驗以富硒靈芝干預(yù)NAFLD模型大鼠，測定其對大鼠硬脂酰輔酶A去飽和酶及?；o酶A氧化酶1（acyl-coenzyme a oxidase 1，ACOX1）的影響，探討富硒靈芝對NAFLD的治療作用，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物來源及分組 雄性SD大鼠60只、基礎(chǔ)飼料以及飼養(yǎng)用墊料均購自昆明醫(yī)科大學(xué)動物實驗中心，大鼠體質(zhì)量為160～180g，在適應(yīng)性喂養(yǎng)2周后分為空白對照組、模型對照組及富硒靈芝組3組，每組各20只。

1.1.2 高脂溶液配制與灌胃量 用97%豬油、2%膽固醇與1%膽酸鈉配制100%高脂溶液，大鼠灌胃量按每100g大鼠體質(zhì)量灌1mL高脂溶液，灌胃時間為每天8：00～10：00。另外，日常給予大鼠紅糖水自由飲用，紅糖濃度為10%。

1.1.3 藥品與試劑 富硒靈芝（含硒量為3.162mg／kg）由沈陽康硒生物工程研究所提供；膽酸鈉購自上海金穗生物公司；膽固醇購自北京鼎國生物技術(shù)公司；豬油與紅糖市場自購；膽堿酯酶（CHE）、總膽紅素（TBIL）及總膽汁酸（TBA）試劑盒購自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒與逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自天根公司，多克隆抗體ACOX1和ECL發(fā)光試劑盒購自美國Santa Cruz公司，相應(yīng)二抗購于中杉金橋公司。

1.2 方法

1.2.1 NAFLD模型的建立及給藥方法 大鼠分組后，模型對照組與富硒靈芝組在喂食普通飼料的基礎(chǔ)上給予高脂溶液灌胃12周以促使其建立NAFLD模型，空白對照組只喂食普通飼料，造模成功后，富硒靈芝組給予富硒靈芝水（每天2次，每只大鼠每次5mL，富硒靈芝水配方為：每1g富硒靈芝用10 mL水煮沸30min，過夜浸泡）灌胃治療。

1.2.2 標(biāo)本采集 分別于6、12周處死大鼠各半，測定其相應(yīng)指標(biāo)。處死時用3%水合氯醛2mL腹腔內(nèi)注射，麻醉后無菌操作暴露腹腔，10mL注射器心臟迅速取血；血液5 000r／s離心，取上清液，-86℃保存；稱300mg肝臟置于RNA保存液中，其余-86℃保存。

1.2.3 病理學(xué)檢查方法 取肝左葉300mg，用4%的中性福爾馬林溶液固定，乙醇脫水，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肝臟病理學(xué)改變。

1.2.4 實時熒光定量PCR（RT-PCR）檢測ACOX1的mRNA表達(dá) （1）取肝臟組織，用總RNA提取試劑盒提取總RNA；（2）定量后每組各取2μg逆轉(zhuǎn)錄cDNA，用2μL cDNA為模板進(jìn)行PCR擴增ACOX1目的片段；（3）PCR擴增反應(yīng)條件如下：98℃預(yù)變性2min，98℃變性10s、48℃退火30s和72℃延伸35s，循環(huán)34次；（4）PCR反應(yīng)產(chǎn)物在含核酸染料（1μL配比100mL瓊脂糖溶液）的1.6%瓊脂糖凝膠中電泳30min，電壓110V，電泳完成后用凝膠成像儀拍照采集圖像；（5）Image J軟件計算各條帶的熒光強度值，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對照。每組實驗重復(fù)3次。ACOX1引物設(shè)計為，PrimerA：5′-GAG ATG GAT AAC GGC TAC CT-3′，PrimerB：5′-AAT TCC GTG AGC TCG GTG AC-3′，產(chǎn)物長度為190bp。β-actin引物設(shè)計為，PrimerA：5′-AAG CCT TGG ACA GAC TCT GA-3′，PrimerB：5′-ACG CAG CTC ATT GTA GAA GGT GTG G-3′，產(chǎn)物長度為123bp。

1.2.5 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測 ACOX1的表達(dá)（1）取肝臟組織用組織細(xì)胞裂解液制作勻漿；（2）蛋白質(zhì)定量試劑盒（BCA）法測定蛋白質(zhì)含量；（3）取各樣本80μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）；（4）半干轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜；（5）5%的脫脂牛奶封閉2h；（6）3μL抗體相應(yīng)多克隆一抗聯(lián)合6 000μL TBST緩沖液配成抗體溶液封閉；（7）4℃過夜，洗膜后加入相應(yīng)的辣根酶標(biāo)記的二抗孵育，洗滌3次，每次15min；（8）洗滌后與ECL發(fā)光試劑反應(yīng)，曝光洗片；（9）掃描圖像后用Image J軟件計算各條帶的灰度值，以β-actin作為內(nèi)參進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)對照。每組實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以±s表示，采用t檢驗，檢驗水準(zhǔn)α＝0.05，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 肝臟HE染色比較 HE染色圖片可以明顯地看出，空白對照組6周及12周切片表面光滑，看不到任何脂滴及壞死特征；模型對照組6周表面有不同程度的脂肪變性及空泡樣變，肝細(xì)胞極度腫脹呈圓形，肝細(xì)胞體積較空白對照組明顯要大，模型對照組12周與6周比較有一定好轉(zhuǎn)，但脂肪浸潤面積仍然較大；富硒靈芝組6周脂肪變性程度及細(xì)胞腫脹明顯減輕，壞死灶較HFD明顯減少，但在匯管處仍有小部分面積脂肪顆粒堆積，富硒靈芝組12周大鼠肝臟基本恢復(fù)到正常水平，與空白對照組12周幾乎沒有差異，見圖1。

圖1 肝臟HE染色變化

2.2 大鼠血清CHE、膽紅素的變化分析 6周時，大鼠CHE富硒靈芝組比模型對照組顯著降低（P＜0.05），TBIL、直接膽紅素及間接膽紅素均得到了好轉(zhuǎn)，幾乎恢復(fù)到正常的水平（P＜0.05），見表1。12周時，大鼠CHE模型對照組比6周時有一定降低，富硒靈芝組相較于6周時基本恢復(fù)到正常的水平，TBIL、直接膽紅素及間接膽紅素空白對照組相較于6周時呈現(xiàn)出下降的趨勢，富硒靈芝組基本維持在空白對照組附近，見表2。

表1 各組大鼠6周時CHE、膽紅素比較（±s）

表1 各組大鼠6周時CHE、膽紅素比較（±s）

＊：P＜0.05，與模型對照組比較。

組別 CHE TBIL 直接膽紅素 間接膽紅素模型對照組225.00±47.00 1.65±0.51 1.23±0.48 0.48±0.12空白對照組 142.00±28.00 0.51±0.17 0.41±0.16 0.10±0.04富硒林芝組 155.00±21.00＊ 0.52±0.33＊ 0.42±0.27＊ 0.10±0.04＊

表2 各組大鼠12周時CHE、膽紅素比較（±s）

表2 各組大鼠12周時CHE、膽紅素比較（±s）

＊：P＜0.05，與模型對照組比較。

組別 CHE TBIL 直接膽紅素 間接膽紅素模型對照組173.00±39.00 0.30±0.16 1.32±0.46 0.25±0.10空白對照組 142.00±28.00 0.37±0.28 0.35±0.19 0.02±0.01富硒林芝組 146.00±19.00＊ 0.38±0.27 0.34±0.21＊ 0.04±0.02＊

2.3 大鼠血清總膽汁酸、總蛋白、清蛋白和球蛋白的變化分析6周時，大鼠總膽汁酸模型對照組和空白對照組基本一致，富硒林芝組與上述兩組比較有一定的降低；總蛋白、清蛋白及球蛋白模型對照組與空白對照組差異微小，但經(jīng)富硒靈芝治療后，其值居于中間，見表3。12周時，模型對照組大鼠總膽汁酸要明顯高于空白對照組，同時12周與6周比較，其值明顯升高，而富硒靈芝組與上述兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。同時，富硒靈芝組與6周時比較基本沒有變化，總蛋白、清蛋白及球蛋情況與6周時較為相似，見表4。

表3 各組大鼠6周總膽汁酸、總蛋白、清蛋白和球蛋白的比較（±s）

表3 各組大鼠6周總膽汁酸、總蛋白、清蛋白和球蛋白的比較（±s）

＊：P＜0.05，與模型對照組比較。

組別 總膽汁酸 總蛋白 清蛋白 球蛋白模型對照組 10.83±2.14 73.75±4.58 26.00±3.12 47.75±4.18空白對照組 6.65±0.93 64.50±5.72 22.50±1.89 42.00±2.14富硒林芝組 5.40±0.72＊67.17±4.73 23.50±2.17 43.67±2.96

表4 各組大鼠12周時總膽汁酸、總蛋白、清蛋白和球蛋白的比較（±s）

表4 各組大鼠12周時總膽汁酸、總蛋白、清蛋白和球蛋白的比較（±s）

＊：P＜0.05，與模型對照組比較。

組別 總膽汁酸 總蛋白 清蛋白 球蛋白模型對照組 24.38±6.24 72.75±5.12 24.75±2.83 48.50±5.44空白對照組 11.50±2.13 62.67±4.92 21.67±4.17 41.00±2.87富硒林芝組 4.34±0.89＊67.20±5.16 22.40±2.74 43.40±3.10

圖2 各組大鼠肝臟ACOX1的Western blot表達(dá)

圖3 各組大鼠肝臟組織ACOX1的Western blot表達(dá)

2.4 ACOX1的mRNA表達(dá) RT-PCR發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，6周時富硒靈芝組大鼠肝臟ACOX1的mRNA表達(dá)稍有改善，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。但12周時ACOX1的mRNA表達(dá)幾乎恢復(fù)到正常水平，其與模型對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖2。Western blot檢測發(fā)現(xiàn)，與模型對照組相比，6周時富硒靈芝組ACOX1蛋白表達(dá)有一定的改善，但改善不明顯，見圖2。12周時富硒靈芝組的蛋白表達(dá)明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

3 討 論

NAFLD是指除酒精和其他明確的損肝因素外所致的肝細(xì)胞內(nèi)脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，其疾病譜包括單純性脂肪肝（simple fatty liver，SFL）、非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）及其相關(guān)肝硬化等[1]。當(dāng)前NAFLD已經(jīng)成為威脅我國人民健康的一大疾病，NAFLD男性發(fā)病率稍高于女性，且患病率隨年齡增加而升高，特別是中年人群發(fā)病率高達(dá)26%，另外多項研究提示，約15%～50%的肝纖維化和肝硬化與脂肪肝有關(guān)，脂肪肝纖維化患者中約30%于10年后可發(fā)展為肝硬化，甚至進(jìn)一步發(fā)展有可能導(dǎo)致肝癌[5-6]。

血清CHE是近年來診斷脂肪肝的一個新型指標(biāo)，多項研究均顯示，NAFLD發(fā)病時，其體內(nèi)CHE明顯升高，其原因為脂肪肝發(fā)生時，體內(nèi)脂肪酸合成和轉(zhuǎn)換增加，導(dǎo)致血液中?；o酶A增加，繼而產(chǎn)生酰基膽堿等，這與本文的研究相符合。本研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠CHE平均水平要明顯地高于空白對照組，治療第6周時差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），表明富硒靈芝可以改善血清中CHE的代謝，從而減輕肝臟負(fù)擔(dān)，達(dá)到保護(hù)肝臟的作用[7]。

TBIL是用來診斷臟或膽道是否發(fā)生異常的一個重要指標(biāo)。血清膽紅素升高，表明肝細(xì)胞處理和處理后膽紅素從膽道的排泄發(fā)生障礙。總膽紅素由直接膽紅素和間接膽紅素構(gòu)成。間接膽紅素經(jīng)過肝臟代謝又可變?yōu)橹苯幽懠t素，隨膽汁排入膽道，最后經(jīng)大便排出。肝細(xì)胞受損后，直接膽紅素就不能排入腸道，使直接膽紅素偏高[8]。但最新的研究發(fā)現(xiàn)，NAFLD患者血清總膽紅素呈下降趨勢[9]。而本研究發(fā)現(xiàn)，模型對照組大鼠TBIL、間接膽紅素及直接膽紅素比空白對照組明顯升高，經(jīng)過富硒靈芝治療后，在6周時發(fā)生了明顯的改變（P＜0.05），提示富硒靈芝可以改善肝臟功能，使其膽紅素代謝恢復(fù)正常，但在12周時血清TBIL卻呈明顯的下降趨勢，明顯的低于空白對照組和富硒靈芝治療組，分析原因可能是灌胃時加入膽酸鈉造成血清膽紅素明顯增高，在6周時大鼠機體并不能完全代謝，到12周時即恢復(fù)到正常水平，符合最新研究報道。

一般而言，血液中血清膽汁酸含量極微，當(dāng)肝細(xì)胞受損時膽汁酸代謝就會出現(xiàn)異常，血清總膽汁酸就會升高[10]。本研究發(fā)現(xiàn)：6周時，模型對照組大鼠總膽汁酸比空白對照組要高、經(jīng)過富硒靈芝治療后，發(fā)生了明顯的改變，同時也略低于空白對照組（P＜0.05）；12周時，富硒靈芝組、模型對照組及空白對照組膽汁酸比6周時明顯升高，這可能與大鼠逐漸成熟有關(guān)，但12周時富硒靈芝組膽汁酸水平明顯低于空白對照組和模型對照組（P＜0.01），提示富硒靈芝可能對NAFLD模型大鼠膽汁酸的降低起著積極的作用?？偟鞍资怯汕宓鞍缀颓虻鞍捉M成，慢性肝病及一些慢性感染類疾病會造成總蛋白略微偏高。本研究結(jié)果證明，NAFLD發(fā)生時，其總蛋白、清蛋白及球蛋白均有略微升高，經(jīng)富硒靈芝治療后，均得到改善。

1978年Osumi等[11]發(fā)現(xiàn)，ACOX1是脂肪細(xì)胞內(nèi)與脂肪酸氧化相關(guān)的酶，同時也是過氧化酶體內(nèi)β-氧化系統(tǒng)的起始酶。還有研究顯示，ACOX1基因缺乏小鼠可發(fā)生嚴(yán)重的NASH，表明長鏈和極長鏈乙酰輔酶A可導(dǎo)致此病變的發(fā)生[12]。本實驗結(jié)果表明，模型對照組6周和12周的ACOX1 mRNA表達(dá)明顯降低，富硒靈芝治療后ACOX1mRNA表達(dá)6周時變化微小，12周時發(fā)生了顯著的變化，幾乎達(dá)到了空白對照組的水平，而ACOX1蛋白的表達(dá)與mRNA的表達(dá)一致，因此推測富硒靈芝可激活A(yù)COX1的基因轉(zhuǎn)錄，同時增加其蛋白表達(dá)，以促進(jìn)肝臟脂肪代謝，保護(hù)肝細(xì)胞，這可能是其治療NAFLD的分子機制。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)富硒靈芝可明顯改善NAFLD大鼠ACOX1的表達(dá)，通過其ACOX1的表達(dá)來調(diào)節(jié)NAFLD大鼠血清CHE、膽紅素、膽汁酸及總蛋白的變化，從而達(dá)到治療NAFLD的目的。

[1] Smith BW，Adams LA.Non-alcoholic fatty liver disease[J].Crit Rev Clin Lab Sci，2011，48（3）：97-113.

[2] 沈峰，汪余勤，范建高.2012上海國際消化系統(tǒng)疾病會議紀(jì)要[J／CD].中國醫(yī)學(xué)前沿雜志：電子版，2012，4（7）：1-4.

[3] 陳璐，羅霞，曾謹(jǐn)，等.不同靈芝類群藥效的特異性研究[J].中國食用菌，2007，26（6）：40-43.

[4] 程紅艷，孫緒春，孟俊龍，等.靈芝富硒栽培研究[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2012，40（5）：2626-2627.

[5] Jokal D，Wahll K，Moeller S，et al.Prospective biopsycontrolled evaluation of cell death biomarkers for prediction of liver fibrosis and nonalcoholic steatohepatitis[J].Hepatology，2012，55（2）：455-464.

[6] Arora A，Sharma P.Non-invasive diagnosis of fibrosis in non-alcoholic fatty liver disease[J].J Clin Exper Hepatol，2012，2（2）：145-155.

[7] Ghareeb DA，Hafez HS，Hussien HM，et al.Non-alcoholic fatty liver induces insulin resistance and metabolic disorders with development of brain damage and dysfunction[J].Metab Brain Dis，2011，26（4）：253-267.

[8] Kwak MS，Kim D，Chung GE，et al.Serum bilirubin levels are inversely associated with nonalcoholic fatty liver disease[J].Clin Mol Hepatol，2012，18（4）：383-390.

[9] Jang BK.Elevated serum bilirubin levels are inversely associated with nonalcoholic fatty liver disease[J].Clin Mol Hepatol，2012，18（4）：357-359.

[10] Gabbi C，Bertolotti M，Anzivino C，et al.Effects of bile duct ligation and cholic acid treatment on fatty liver in two rat models of non-alcoholic fatty liver disease[J].Dig Liver Dis，2012，44（12）：1018-1026.

[11] Osumi T，Hashimoto T.Acyl-CoA oxidase of rat liver：a new enzyme for fatty acid oxidation[J].Biochem Biophys Res Commun，1978，83（2）：479-485.

[12] Fan CY，Pan J，Chu R，et al.Hepatocellular and hepatic peroxisomal alterations in mice with a disrupted peroxisomal fatty acyl-coenzyme A oxidase gene[J].J Biol Chem，1996，271（40）：698-710.